一种工业菌种的前处理方法及检测工业菌种中克罗诺杆菌的方法与流程

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种工业菌种的前处理方法及检测工业菌种中克罗诺杆菌的方法。

背景技术：

1、克罗诺杆菌原称阪崎肠杆菌，其广泛分布于自然界中，可在食品、饮料、加工原料及生产环境中分离得到。该菌属于一种条件致病菌，繁殖迅速，基本不会对健康人群产生危害，但对于婴幼儿、新生儿或免疫力低下者具有严重威胁，甚至引发败血症、脑膜炎及坏死性结肠炎。克罗诺杆菌在婴幼儿配方食品、乳及乳制品、肉类、水和蔬菜中均可检测到，其中奶粉是主要感染渠道，故需要严格的检测和控制措施来防止婴幼儿的感染。

2、依据gb 29921-2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》，特殊膳食食用食品（仅适用于婴儿0-6月龄配方食品、特殊医学用途婴儿配方食品）需监控克罗诺杆菌属，中国食品安全国家标准gb 4789.40-2024规定了该菌的检验方法，其选择性培养基可通过万古霉素（抑制g+菌）和显色底物组合，排除了绝大多数益生菌和非目标菌的干扰。

3、但是，上述检测方法以婴幼儿配方食品作为检测对象，当某一批次中克罗诺杆菌检测超标时，同批次的成品均需作废处理，增加了生产成本。也有采用特定试剂盒检测克罗诺杆菌的方法，但其检测步骤较为烦琐、周期较长，检测成本升高。因此，需要开发一种能够在源头提前实现对克罗诺杆菌的检测，避免因所用原料比如工业菌种受克罗诺杆菌的污染而造成大量婴幼儿配方食品作废情况的方法。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种工业菌种的前处理方法及检测工业菌种中克罗诺杆菌的方法，该处理方法操作简单，易于实施，采用其处理工业菌种后能够实现初始原料工业菌种中克罗诺杆菌的准确检出；该检测方法能够特异性检测克罗诺杆菌，准确性高，避免了试剂盒检测时易出现的假阴性/假阳性的问题。

2、为解决以上技术问题，本发明提供一种工业菌种的前处理方法，步骤包括：

3、将工业菌种与洗涤溶液于无菌容器中混合均匀，得悬浮液；

4、对所述悬浮液进行离心洗涤，收集固相沉淀，得到预处理的工业菌种；

5、其中，所述洗涤溶液为生理盐水或磷酸盐缓冲溶液，所述预处理的工业菌种用于检测其中是否含有克罗诺杆菌。

6、发明人发现，当预先采用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液对待检测的工业菌种进行洗涤处理，之后再按照gb 4789.40-2024的方法进行检测时，能够成功检测出克罗诺杆菌。发明人推测，这可能是由于工业菌种中含有麦芽糊精、海藻糖和/或乳糖等多种菌种保护剂，而这些保护剂可能会抑制克罗诺杆菌的生长或存活，进而使得工业菌种无法直接按照gb4789.40-2024的方法进行准确有效的检测。

7、结合第一方面，所述工业菌种为用于添加在婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品婴幼儿乳制品或其各自原料中的益生菌种。

8、优选地，所述工业菌种选自长双歧杆菌长亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌婴儿亚种中的至少一种。

9、结合第一方面，所述磷酸盐缓冲溶液和生理盐水均经过120~121℃高压灭菌14~16min；所述磷酸盐缓冲溶液的质量浓度为50~60μg/l，所述生理盐水的质量浓度为8~9g/l。

10、优选地，所述工业菌种的质量与洗涤溶液的体积之比为1：4~25。

11、进一步优选地，所述工业菌种的质量与磷酸盐缓冲溶液的体积之比为1：5~20，所述工业菌种的质量与生理盐水的体积之比为1：10~20。

12、结合第一方面，对所述悬浮液进行两次离心洗涤，具体操作为：将所述悬浮液于离心管中离心洗涤，离心完毕后舍弃上清液，继续加入洗涤溶液进行第二次离心洗涤。

13、在对所述悬浮液进行洗涤时，可将悬浮液分装至50ml的离心管中进行离心洗涤，在第一次离心洗涤完毕后，将上清液舍弃，再加入与第一次洗涤时基本等量的洗涤溶液进行第二次洗涤。

14、优选地，所述离心洗涤时的转速为4800~5200r/min，离心时间为4~6min。

15、进一步优选地，所述离心洗涤时的转速为5000r/min，离心时间为5min。

16、本发明还提供一种检测工业菌种中克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：

17、按照上述工业菌种的前处理方法对待检测的工业菌种进行预处理，得预处理的工业菌种；

18、对所述预处理的工业菌种在无菌条件下依次进行前增菌、选择性增菌、显色分离、纯化培养和克罗诺杆菌的鉴定确认步骤。

19、结合第二方面，所述前增菌步骤具体为：将所述预处理的工业菌种接种至bpw培养基中、于36±1℃培养18±2h。

20、将所述预处理的工业菌种接种至缓冲蛋白胨（bpw）培养基中、于36±1℃培养18±2h。对预处理的工业菌种进行前增菌操作，使预处理的工业菌种中可能存在的克罗诺杆菌从加工损伤或营养胁迫状态中恢复活力，并具有一定的繁殖能力，为后续选择性增菌和分离检出创造条件。

21、结合第二方面，所述选择性增菌步骤具体为：将前增菌步骤获得的工业菌种接种至mlst-vm培养基中、于41.5±1℃培养24±2h。

22、将前增菌步骤获得的工业菌种接种至改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mlst-vm）培养基中、于41.5±1℃培养24±2h。克罗诺杆菌能够耐受相对较高的培养温度，在41.5±1℃条件下仍可生长；而工业菌种中的部分背景杂菌在此温度下的生长会受到限制。而且，培养基中的月桂基硫酸钠能够抑制部分革兰氏阳性菌及部分伴随菌，万古霉素主要抑制革兰氏阳性菌。通过温度、表面活性剂和抗生素的组合能够提高克罗诺杆菌在工业菌种中的相对占比，减少后续分离平板上背景菌的干扰。

23、结合第二方面，所述显色分离步骤具体为：将选择性增菌步骤获得的工业菌种划线接种至克罗诺杆菌显色培养基中、于36±1℃培养24±2h，之后从显色平板上挑取蓝绿色可疑菌落。

24、克罗诺杆菌显色培养基含有克罗诺杆菌的特异性底物5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-吡喃葡萄糖苷，该特异性底物含有1个显色基团和1个能够被酶识别的糖苷基团，当克罗诺杆菌在该培养基上生长时，产生的α葡萄糖苷酶会特异性地将显色底物水解，切掉糖苷部分，释放出显色基团，该显色基团在氧气存在作用下形成不溶于水且稳定的蓝绿色色素。

25、结合第二方面，所述纯化培养步骤具体为：将所述蓝绿色可疑菌落划线接种至tsa培养基中、于36±1℃培养24±2h进行纯化。

26、将所述蓝绿色可疑菌落划线接种至胰蛋白胨大豆琼脂（tsa）培养基中进行纯化培养，为后续鉴定步骤提供条件。

27、结合第二方面，所述鉴定确认步骤具体为：对纯化培养得到的可疑菌落进行生化鉴定，判断工业菌种中是否含有克罗诺杆菌。

28、本发明提供的工业菌种的前处理方法操作简单，易于实施，成功排除了工业菌种（高浓度益生菌）中抑菌物质的干扰，采用该方法处理工业菌种、实现了采用国家标准gb4789.40-2024也可准确检出工业菌种中克罗诺杆菌。相比于采用试剂盒的检测方法，本发明提供的检测方法不仅能够特异性检测克罗诺杆菌，且方法准确性高，检出率可达100%，且不存在假阴性/假阳性问题，有助于企业在工业菌种入厂时的检测及排查，从生产前端提升了企业管控克罗诺杆菌的能力。