一种瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群、制备方法及应用

本发明属于生物，具体涉及一种瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群、制备方法及应用。

背景技术：

1、皮肤伤口愈合是一个复杂的生物学过程，愈合异常可导致病理性瘢痕，如瘢痕疙瘩。这类疾病不仅外观受损，还常伴有瘙痒、疼痛及功能障碍。目前对于这类疾病的治疗主要存在以下问题：

2、（1）未能从单细胞水平解析瘢痕疙瘩（keloid）与一般瘢痕（如增生性瘢痕）在细胞起源上的本质差异，难以区分驱动keloid形成的特异性细胞亚群与传统认为驱动瘢痕的成纤维细胞亚群。仅仅只是笼统地将纤维化致病细胞归为”成纤维细胞”或”肌成纤维细胞”，忽略了瘢痕组织内部高度的细胞异质性。这一认知缺口导致现有治疗方案以非特异性成纤维细胞为干预对象，而真正驱动keloid侵袭性生长的特异性致病细胞亚群得不到精准清除，从而使得治疗靶点选择偏差，无法从根源上阻断keloid的病理进程，造成治疗失败率居高不下。

3、（2）目前的治疗手段（如皮质类固醇注射、压迫疗法、放疗）多为广谱抑制，副作用大，且由于缺乏针对keloid特异性驱动细胞的精准干预靶点，在治疗时非特异性地抑制所有成纤维细胞，所以复发率高。而且由于keloid主要特发于人类，现有的动物模型（如鼠、兔、猪）难以完全复制人类keloid的病理特征，且现有筛选模型多关注一般的胶原沉积或针对瘢痕的成纤维细胞异常增殖，缺乏针对keloid特异性细胞亚群存活与扩增的筛选模型。上述局限直接导致keloid患者的治疗复发率居高不下（文献报道术后复发率可达45%～100%），反复治疗增加患者痛苦，且现有广谱治疗手段带来较大副作用（如长期皮质类固醇注射引起皮肤萎缩、色素减退等），严重影响患者生活质量，也制约了针对keloid的新药研发进程。

4、（3）临床上keloid与普通瘢痕在早期阶段极难区分，主要依靠病史和外观进行经验性鉴别。然而，两者的发病机制和预后截然不同（keloid呈持续侵袭性生长且不消退）。现有技术缺乏客观的分子诊断标志物来量化区分两者，无法通过检测特异性指标在分子水平上实现早期精准鉴别诊断。该问题导致临床上keloid在早期极易被误诊为普通增生性瘢痕（hts），患者接受针对hts的常规治疗（如单纯加压疗法）后效果不佳，错失精准干预时机；由于缺乏分子诊断标志物，keloid患者无法得到及时的精准治疗，致使病情持续进展，最终形成难以控制的侵袭性生长病灶。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群、制备方法及应用。

2、本发明第一个方面提供了一种瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群，所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群来源于成纤维细胞类型的间充质基质细胞，且所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群高表达lgr4以及thy1（即cd90）。

3、优选的，所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群还高表达细胞核转录因子foxp1。

4、优选的，所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群还高表达sfrp2。

5、本发明第二个方面提供了一种上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群的制备方法，包括：

6、收集临床手术切除的人瘢痕疙瘩组织，去除表皮及皮下脂肪后剪碎，加入混合酶液在37℃下消化处理60～90 min，获得单细胞悬液；

7、向所述单细胞悬液中加入抗cd45抗体和抗cd31抗体，得到细胞群体；

8、在所述细胞群体中，采用抗lgr4抗体和抗thy1抗体标记，分选同时高表达lgr4和thy1的细胞，得到所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群。

9、优选的，所述混合酶液通过将collagenase i、collagenase ii、collagenase iv、dnaase i以及含钙镁离子的pbs混合配置得到；

10、所述混合酶液中的collagenase i、collagenase ii、collagenase iv和dnaase i的浓度分别为100 u/ml、100 u/ml、50 u/ml和10 u/ml。

11、本发明第三个方面提供了一种上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群的鉴定方法，包括：

12、将抗lgr4抗体和抗thy1抗体加入到待测瘢痕组织样本或细胞样本中孵育；

13、将孵育后的瘢痕组织样本或细胞样本使用荧光标记的二抗进行多重染色，得到染色后的瘢痕组织样本或细胞样本；

14、对染色后的瘢痕组织样本或细胞样本的lgr4和thy1进行检测，若染色后的样本中存在细胞膜和/或胞质同时呈现lgr4与thy1共定位强阳性信号的细胞，则判定该样本中存在所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群。

15、优选的，所述鉴定方法还包括：

16、检测细胞核转录因子foxp1，若所述lgr4与thy1共定位强阳性的细胞的细胞核同时呈现foxp1核阳性信号时，确认该细胞为所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群。

17、本发明第四个方面提供了一种瘢痕疙瘩的诊断试剂盒，包括特异性检测上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群的试剂。

18、优选的，所述试剂为检测上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群中的lgr4基因、thy1基因以及转录因子foxp1相结合的特异性抗体。

19、本发明第五个方面提供了一种上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群在筛选治疗瘢痕疙瘩的候选药物中的应用。

20、本发明第六个方面提供了一种用于预防、缓解或治疗瘢痕疙瘩的候选药物的筛选方法，以lgr4和/或细胞核转录因子foxp1为读出指标，包括：

21、将候选药物作用于上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群上；

22、检测所述瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群中lgr4和/或foxp1的表达水平或活性；

23、若所述候选药物降低lgr4和/或foxp1的表达水平或活性，则判定所述候选药物为预防、缓解或治疗瘢痕疙瘩的候选药物。

24、本发明第七个方面提供了一种用于预防、缓解或治疗瘢痕疙瘩的候选药物，包括抑制上述的瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群增殖的抑制剂。

25、优选的，所述抑制剂为wnt分泌抑制剂。

26、优选的，所述抑制剂抑制瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群中的lgr4基因增殖和/或抑制lgr4介导的wnt信号通路。

27、本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

28、（1）本发明首次在单细胞水平将keloid的治疗靶点锁定为间充质基质细胞（msc）亚群，而并非是传统的普通成纤维细胞；msc亚群特异性高表达lgr4和thy1，以及转录因子foxp1和sfrp2，而这些基因在普通成纤维细胞或其他类型瘢痕细胞中表达量极低或不表达；所以通过检测lgr4和foxp1的共表达，能够特异性地将具有持续侵袭生长特性的keloid从其他类型的瘢痕中区分出来。从而能够避免误用针对普通成纤维细胞的药物，实现keloid的精准医疗。

29、（2）本发明证实了抑制瘢痕疙瘩特异性病理细胞亚群中的lgr4基因增殖的药物能够用于治疗瘢痕疙瘩。