一种将外源物质高效转染进免疫细胞的方法与流程

本发明涉及电转染领域，涉及一种电转染装置，更具体而言，本发明涉及一种利用电转染装置将外源物质高效电转染进免疫细胞的方法。

背景技术：

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2、快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症（恶性肿瘤）发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显，癌症现在已成为人类健康的头号杀手。目前传统治疗手段疗效已到瓶颈，亟需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。白血病俗称“血癌”，是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞不断增生，浸润其他非造血组织和器官，并抑制正常造血功能。在中国每年大约有上万名患者被诊断为b系急性淋巴白血病(b-all)，美国大约有80％的人急性白血病都是b-all，其中80％的b-all患者被一线化化疗所缓解，但仍有60％的b-all会复发。由于白血病分型和预后分层复杂，如按起病的缓急可分为急、慢性白血病，按病变细胞种类分类，包括髓系和淋巴系，淋巴系又包括t和b细胞系，因此没有千篇一律的治疗方法。

3、针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。2011年，nature及临床肿瘤最顶级杂志jco分别发表相同题目“ 肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(nature.2011；480(7378):480；j clin oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究高潮，未来有可能在肿瘤治疗中占据相当重要的地位。治疗白血病患者的一个方法是基因修饰t细胞以通过嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的表达，靶向并结合在肿瘤细胞上表达的抗原，将信号传递至细胞内，引起t细胞增殖活化，从而靶向杀伤肿瘤细胞。

4、“免疫作用”可分为细胞免疫及体液免疫，两者具有截然不同杀灭肿瘤或病毒的方式。细胞免疫是以细胞直接发挥效应来清除异物，它是机体免疫应答的参与者，也是免疫功能的执行者。目前用于临床治疗的效应免疫细胞，即杀伤性免疫细胞，主要包括自然杀伤细胞(nature killer，nk)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，lak)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，cik)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(dc-cik)、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、γδt细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，til)、cd3ak细胞(抗cd3单抗的杀伤细胞)等，这些细胞都不表达抗体，它们直接杀灭或通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性细胞效应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，adcc)起作用。

5、体液免疫是由抗体所介导产生作用，人体内的抗体是由b淋巴细胞产生。1997年，第一个用于临床癌症治疗的单抗——抗人cd20(rituximab)获得fda批准。随着抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有10多万种，其中基因工程抗体有1000多种，人源化抗体200多种。截止2016年3月，fda至今已批准50个抗体上市，其中26个用于肿瘤治疗，这些抗体既有作用于肿瘤细胞本身直接发挥作用，也有作用于免疫细胞间接发挥作用。

6、然而，效应免疫细胞虽然具有一定的抗肿瘤作用，但其临床治疗效果有限；而大分子抗体对实体瘤的穿透力不足，且全身用药有可能引起系统性不良反应。例如，her2单抗具有心脏毒性，而pd1抗体打破机体免疫平衡，可引起自身免疫疾病。而且，由于抗体药物涉及复杂的体外生产与制备工艺，纯度要求高且用量大，导致用药费用高昂。因而，如果在细胞免疫效应细胞保持细胞杀伤毒性的前提下，能由其高效表达具有抗肿瘤活性的抗体，将同时克服细胞免疫治疗作用不足与大分子抗体难以进入实体瘤内部的困难，同时可以降低治疗成本。这些既具有细胞杀伤毒性、又能高水平表达抗体的细胞，在趋化因子作用下，经过细胞变形主动进入肿瘤组织内部，从而在肿瘤组织局部高水平表达抗体，可以避免全身性用药带来的副作用。同时，作用于免疫细胞自身的抗体(如her2抗体herceptin)，由于抗体与细胞杀伤毒性免疫细胞双重存在，可产生强烈的adcc效应及cdc效应，高效杀灭肿瘤细胞；而作用于t细胞自身的抗体(如pd1抗体keytruda)，可以避免肿瘤微环境对回输的效应性t细胞的抑制作用，使其持续发挥治疗作用。

7、尽管已经有将外源基因转导入例如nk细胞或t细胞的报导，但目前常用基因转染载体系统对具有细胞杀伤毒性的效应免疫细胞转染率低，或者难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。利用腺病毒载体(非整合型)可以介导外源基因在nk细胞或t细胞内较高效的短时表达，但活化的nk细胞或t细胞增殖速度非常快，携带的外源基因表达框在细胞传代中将快速丢失，表达难以持久；利用逆转录病毒或慢病毒可以介导外源基因在nk细胞或t细胞基因组中的整合，理论上可实现稳定表达，但抗体包含轻链与重链，编码序列长、分子量大，导致携带全长抗体表达框的逆转录病毒或慢病毒的包装与制备存在较大困难、难以高效表达抗体，只能用于表达结构简单的单链抗体(缺乏fc段片段，功能不全且半衰期短)。而通过化学转染的方法基本不能将外源物质转染进入免疫细胞外源物质。

8、靶向cd19分子的car-t细胞在针对难治、复发的b细胞来源的血液肿瘤的治疗上，获得了传统疗法无法达到的临床疗效，完全缓解率(cr)普遍达到了80％，有些临床试验甚至高达100％，成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过也暴露出在car-t细胞持久性较差、抗原逃逸导致肿瘤复发及安全性隐患等问题：(1)存活时间短。存活时间的长短已被证明与疗效密切相关，确保回输后的car-t细胞在患者体内的存活时间成为关键；(2)易复发。car-t细胞体内存活时间不够长，抗原丢失产生免疫逃逸机制，最终导致复发；(3)制备成功率不高。常用逆转录病毒系统来制备car-t，能有效感染宿主细胞，但其装载量有限，且重组病毒颗粒制备工艺较复杂。此外，病毒系统可能带来安全隐患。并且患者由于进行过多种治疗，会使其t细胞活性过低，体外培养无法保证回输car-t的量。

9、cn201710539385公开了使用市场上amaxa电转染试剂盒的电转染试剂并将其与cd19car质粒及其转座酶质粒、用于敲除pd-1基因的sgrna质粒及cas9质粒混合后形成混合物；并接收来自pbmc细胞准备系统的pbmc细胞且在其中加入所述混合物进行电转染。

10、但是，由于血液瘤病人经过了一些放化疗治疗，因此病人样品之间的差异性非常大，通过amaxa电转染，不同样品，转染效率和存活率存在非常大的差异，转染效率的下限值可能低于20%。其次，市场上的电转杯均为铝合金材质，在电转的过程中，与离子反应会有部分al3+析出，对细胞造成损伤，在免疫治疗中，电转染后的细胞样品需要回输到人体内，这样如何去除残留的al3+是一个非常繁琐的工艺。

技术实现思路

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2、本发明是针对上述现有的技术存在的技术问题，提供了一种电转染装置，以克服电转染过程中铝离子析出的问题。

3、本发明还提供一种电转染系统，为将外源物质高效转染进免疫细胞中提供解决方案。

4、本发明还提供一种电转染方法，能够高效将外源物质电转染进免疫细胞中。

5、为了达到上述目的，本发明提供的电转染装置的技术方案概述如下:

6、本发明的电转染装置，电极的材料为钛镀铂，所述电极为平面电极或针电极，优选电极为平面电极；所述平面电极的平面间距为1-5mm；优选所述平面电极的平面间距为2mm；

7、优选电转染装置为电转杯，包括一对钛镀铂电极片组成的平面电极和只有一端开口的管体，平面电极平行嵌入不导电的管体侧壁，形成的腔体体积为（5-15 mm）×（10-30mm）×（1-5mm）；优选10.3 mm×20 mm×2mm；

8、本发明的电转染装置与壹达ebxp-h1电转染主机，无线pad控制系统以及电转杯专用基座组合使用，构成电转染系统。

9、本发明的电转染参数为所述脉冲电压为400-500v，优选为420-450v；所述脉冲宽度为300-1000μs，优选为500-800μs；所述脉冲次数为1-8次，优选为2-3次；所述脉冲间隔为10-2000ms，优选为50-2000ms；优选所述脉冲波形为方波。

10、本发明提供一种将外源物质电转染进免疫细胞的方法，将待转染的外源物质与电转染缓冲液配合使用，优选所述电转缓冲液为壹达自主研发的ebel电转缓冲液（产品号h10305）；

11、本发明所述免疫细胞电转染前贴壁处理8-20h。

12、本发明所述免疫细胞电转染后，按照体积比1:8转移至培养基中。

13、本发明所述外源物质包括dna、rna、蛋白质、可表达核酸序列编码治疗多肽或核酸的治疗剂形式或其衍生物。

14、本发明所述免疫细胞包括自然杀伤细胞（nk细胞）、dc细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、t淋巴细胞或其组合；优选所述免疫细胞包括nk细胞、dc细胞和t淋巴细胞。本发明所述免疫细胞还包括哺乳动物细胞cd8+杀伤t细胞、cd4+辅助t细胞、初始t细胞、记忆t细胞、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、恒定t细胞、nkt细胞、细胞因子诱导的杀伤t细胞、g/d t细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。

15、本发明提供一种免疫细胞进行电转染的方法，包括使用本发明的电转染系统进行电转染的步骤，以400-500v的电压对含有免疫细胞和待转染的质粒进行电转染，脉冲宽度为50-2000μs。

16、本发明提供一种制备用于免疫治疗的t细胞的方法，其特征在于，使用本发明的电转染系统。

17、本发明提供一种使用本发明的电转染系统和未激活状态或者激活状态t细胞制备治疗疾病的嵌合抗原受体t细胞（car-t）药物的方法。

18、本发明提供一种通过制备用于免疫治疗的t细胞的方法能够获得的分离的t细胞或细胞系或它们的次代培养物在制备治疗疾病的药物中的应用。

19、优选所述t细胞或细胞系或它们的次代培养物包括编码嵌合抗原受体的外源多核苷酸序列。

20、本发明提供一种使用本发明的电转染系统和人nk细胞、dc细胞、巨噬细胞制备治疗疾病的嵌合抗原受体细胞药物的方法。

21、优选所述嵌合抗原受体是多链嵌合抗原受体，优选所述多链嵌合抗原受体对cd19、cd20、cd22、cd33、cd30、cds、cd38、cd37、cd52、cd70、cd44v6、cd123、cd135、epcam、egfr、egfr变体、gd2、ror1、ror2、cd269、cd319、cd38、bcma或cd138、cd139、cldn6、cea、cspg4、c-met、fr、trbc1、het2、wt1、cll-1、gfr alpha4、il13rα2、meso、tem8、b7-h4、ssea4、muc1、psma、psa具有特异性。

22、优选所述疾病为癌症（恶性肿瘤）、 病毒感染或自身免疫失调。

23、优选所述疾病为淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、胶质瘤、卵巢瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素癌或肝癌。

24、本发明技术方案带来的有益效果：

25、本发明的电转染方案，采用相对低压短脉宽开孔方式，自主研制的电转染缓冲液，pbmc电转前后处理工艺的优化，电转参数优化，电转杯材料优化，显著提高转染效率至70-75%。

26、本发明的电转染方法可用于car-t细胞的制备，并可将作为crisper基因编辑工具的剪切酶蛋白和引导rna转染进细胞中，对细胞进行基因编辑。

27、本发明的电转染材料新颖，具有开创性，且能保证高转染效率同时提高细胞存活率。