一种结构稳定的GelMA微载体及其制备方法

本发明涉及生物医用高分子材料，尤其是指一种结构稳定的gelma微载体及其制备方法。

背景技术：

1、神经损伤是临床常见的难治性疾病，涵盖周围神经损伤、脊髓损伤、脑神经退行性病变等多种类型，具有发病率高、修复难度大、预后效果差的特点。随着交通创伤、运动损伤及人口老龄化相关神经退行性疾病的增多，神经损伤已成为严重影响患者生活质量的公共健康问题。目前临床治疗手段十分有限：周围神经缺损多采用自体神经移植，但存在供体来源不足、供区功能损伤、匹配度差等缺陷；中枢神经损伤则缺乏有效再生手段，常规药物与手术治疗难以实现神经功能的实质性恢复。

2、近年来，基于细胞移植与药物缓释的神经再生策略成为研究热点。通过递送神经干细胞、施万细胞等种子细胞，联合神经营养因子、小分子治疗药物，可协同调控损伤微环境、促进轴突再生与髓鞘形成，是实现神经结构与功能修复的核心路径。然而，直接局部注射细胞存在细胞存活率低、滞留性差、分布不均的问题；游离药物则存在半衰期短、突释严重、作用时间短的局限，难以满足神经修复过程中长期、平稳的调控需求。因此，构建兼具细胞负载与药物缓释功能的生物相容性递送载体，是神经再生领域的关键需求。

3、微载体载体因比表面积大、尺寸可控、可微创递送的优势，成为神经修复递送系统的理想选择。甲基丙烯酸酐化明胶（gelma）是明胶经甲基丙烯酸酐改性得到的光敏性天然高分子材料，既保留了明胶优异的生物相容性、细胞黏附性与可降解性，又可通过光交联实现温和可控的成型过程，能够为神经细胞提供类细胞外基质的三维微环境，同时可高效负载蛋白类、小分子类神经治疗药物，是构建神经修复递送微载体的核心材料。

4、目前gelma微载体多采用乳化-光交联工艺制备，但现有制备技术仍存在多方面技术缺陷，限制了其在高精度递送场景的应用：

5、交联过程液滴易聚并，微载体均一性不足：乳化后若维持高速搅拌进行光交联，持续剪切力易破坏液滴界面结构；若停止搅拌静置交联，液滴易发生碰撞融合，最终导致微载体球形度差、粒径分布宽，批次间稳定性差。而神经修复递送对微载体均一性要求极高，粒径不均会直接导致细胞负载量差异大、药物释放行为不一致，局部递送后损伤区域修复效果不均一，难以实现精准调控。

6、洗涤过程破损率高，载体结构完整性差：现有工艺普遍采用液体石蜡作为油相，其沸点高、挥发性差，需经异丙醇置换、多步水洗才能彻底去除油相与乳化剂。微载体在油相到水相的转移过程中，溶剂极性突变会引发 gelma 三维网络的不均一溶胀，导致微载体变形、粘连甚至破裂，常规工艺下成品破损率通常高于20%。破损的微载体不仅会造成负载细胞泄漏死亡、药物提前突释，还可能引发局部炎症反应，不利于神经组织再生。

7、有机溶剂残留难以清除，神经生物安全性不足：高沸点的液体石蜡与乳化剂经多步洗涤仍难以完全去除，残留的有机溶剂具有潜在神经细胞毒性，会降低种子细胞存活率、抑制神经突起生长，体内植入后还可能引发局部炎症与组织排异反应，存在显著的生物安全风险，无法满足神经修复植入应用的高标准要求。

8、目前虽有研究从乳化参数优化等角度提升gelma微载体性能，但尚未形成 “交联定型-洗涤纯化-溶剂去除”的系统性配套工艺，无法同时满足神经修复递送载体对高球形度、高均一性、低破损率、高生物安全性的综合需求。因此，提供一种结构稳定的gelma微载体及其制备方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，本发明的目的在于提供一种结构稳定的gelma微载体及其制备方法，同时提供其制备方法，解决的技术问题包括：交联过程液滴易聚并，微载体球形度差、粒径分布宽；洗涤过程溶剂极性突变导致微载体变形破损，成品率低；高沸点油相残留难以去除，生物安全性不足。以自制gelma为原料，采用石油醚为油相，通过 “低速搅拌光交联+降温物理定型”的双重定型策略，配合低温石油醚洗涤与冻干除溶剂工艺，解决现有gelma微载体交联易聚并、洗涤易破损、溶剂残留高的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种结构稳定的gelma微载体，所述gelma微载体由甲基丙烯酸酐化明胶经低速搅拌光交联和低温物理凝胶定型双重固化成型，所述gelma微载体球形度≥0.96，粒径变异系数cv≤6%，所述甲基丙烯酸酐化明胶的甲基丙烯酰基取代度为30%-80%；低速搅拌光交联的搅拌转速为200-500rpm；低温物理凝胶定型的温度为0-4℃。

4、作为一种优选方案：所述gelma微载体为贯通多孔结构，其孔径为80-250nm；所述gelma微载体内部负载有活性药物、细胞或生长因子。

5、作为一种优选方案：所述gelma微载体的溶胀率为150%-300%，体外降解周期为7-30天；洗涤后微载体破损率≤3%，石油醚残留量≤1μg/g。

6、一种所述的gelma微载体的制备方法，包括如下步骤：

7、第一、gelma制备：将甲基丙烯酸酐化明胶溶解于缓冲液中，加热搅拌后滴加甲基丙烯酸酐避光反应，产物经透析、冷冻干燥得到gelma干粉；

8、第二、水油相配制：将gelma干粉与光引发剂溶解于缓冲液中，得到gelma预聚液作为水相；将司盘80乳化剂加入石油醚中，混合均匀得到油相；

9、第三、乳化：将水相滴加至油相中，高速搅拌形成油包水型乳液；

10、第四、交联：调低搅拌转速至低速状态，保持乳液低速搅拌，同时进行紫外光照射，引发gelma初步交联固化；光交联完成后将体系降温，使微载体低温物理凝胶化，稳定微载体形貌结构；

11、第五、洗涤和干燥。

12、作为一种优选方案：所述步骤二中，所述gelma预聚液质量分数为5%-15%；光引发剂为lap，用量为gelma质量的0.5%-2%；所述水相中还添加有活性药物、细胞或生长因子。

13、作为一种优选方案：所述步骤二中，所述gelma 预聚液的质量分数为8%-12%；所述lap光引发剂的用量为gelma质量的1%-1.5%。

14、作为一种优选方案：所述步骤二中，所述石油醚沸程为60-90℃，司盘80的质量分数为2%-6%；步骤三中，水油体积比为1:(4-10)，搅拌转速为800-1500rpm，搅拌时间为5-15min。

15、作为一种优选方案：所述低速搅拌转速为200-500rpm；紫外光波长为365nm，光照时间为1-5min，光照强度为5-20mw/cm2；光交联完成后将体系降温至0-4℃静置定型，或采用液氮淬冷定型；定型时间为5-30min。

16、作为一种优选方案：所述洗涤和干燥具体为：加入预冷的低温石油醚重悬洗涤，弃上清，重复多次去除残留乳化剂；洗涤后gelma微载体经预冻后冷冻干燥，残留石油醚升华去除，得到成品gelma微载体；所述低温石油醚的温度为-10-4℃，洗涤次数为3-5次。

17、作为一种优选方案：所述步骤一中，滴加甲基丙烯酸酐避光反应的反应温度为45-55℃，反应时间为20h；透析截留分子量为8000-14000da，透析时间为5-7天。

18、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知：

19、（1）本发明采用低速搅拌光交联 + 低温物理凝胶化双重定型策略，既避免高速剪切破坏液滴界面，又防止静止交联时液滴碰撞聚并，最终微载体球形度高，粒径变异系数低，批次重复性好。

20、（2）本发明全程采用石油醚体系洗涤，微载体无需经历油相-水相的极性突变，从根源避免溶胀变形与破裂，配合低温洗涤条件，洗涤后破损率低，成品率可达95%以上。

21、（3）本发明采用低沸点石油醚替代传统液体石蜡，残留溶剂可随冷冻干燥升华过程完全去除，无需多步溶剂置换，最终石油醚残留量小，无细胞毒性风险。

22、（4）本发明可通过调控gelma取代度、交联参数灵活调节微载体降解周期与力学性能，兼容载药、载细胞等多种功能化需求。

23、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。