一种甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子及制备方法和应用与流程

本技术属于有机超分子材料与功能性健康保健品，涉及一种甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子及制备方法和应用。

背景技术：

1、α-酮戊二酸（akg）、甜菜碱均是具备生理活性的营养物质。α-酮戊二酸是三羧酸循环关键中间产物，可提升细胞能量、减轻氧化应激、抑制细胞凋亡；甜菜碱为高效甲基供体，具备细胞渗透压保护、调节脂质代谢、清除自由基作用，二者组合具备协同调理细胞的潜力。现有相关技术存在诸多缺陷：

2、（1）原料复配形式简单，无共晶结构，协同效果差

3、目前行业内仅将两种原料简单物理混合，或制备普通有机酸盐，未通过分子间氢键、静电作用构筑规整共晶结构。物理混合体系中两种分子独立存在，体内吸收速率不匹配，易产生代谢拮抗，无法实现1+1＞2的抗氧化协同效果；普通盐类晶体稳定性差，吸湿性强，长期存放易结块、活性成分氧化分解。

4、（2）复合工序繁琐，原料损耗大

5、现有复配方式需先将发酵液提纯、干燥得到固体α-酮戊二酸，再重新溶解后与甜菜碱混合反应，多次浓缩干燥大幅降低活性成分收率，生产能耗高、操作步骤多。

6、（3）抗氧化、细胞修复效果有限

7、单一原料或物理混合物作用通路单一，对高温诱导肠道氧化损伤的修复能力弱，提升细胞活力、抗氧化酶活性、降低细胞凋亡的效果有待提高。

8、综上，现有技术无法同时兼顾原料安全性、晶体储存稳定性与细胞协同抗氧化活性。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本技术的目的在于提供一种甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子及制备方法和应用。

2、为达到此发明目的，本技术采用以下技术方案：

3、一方面，本技术提供一种甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子，所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子包括甜菜碱和α-酮戊二酸分子，所述甜菜碱与α-酮戊二酸摩尔配比为2:1，所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子的x-射线粉末衍射图谱包括如下2θ角特征峰：12.3±0.2°、16.1±0.2°、20.5±0.2°、26.8±0.2°。

4、在本技术中，所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子的x-射线粉末衍射图谱包括如下2θ角特征峰：10.4±0.2°、12.3±0.2°、14.1±0.2°、16.1±0.2°、18.0±0.2°、20.5±0.2°、22.2±0.2°、24.4±0.2°、26.8±0.2°、29.0±0.2°、31.5±0.2°、34.1±0.2°、37.4±0.2°。本技术的甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子通过分子间静电作用与多重氢键构筑有序共晶晶格，消除单体易吸潮缺陷，提升产物储存稳定性；借助共晶独特分子排布实现多通路协同抗氧化，显著提升细胞活力、抗氧化酶水平，抑制细胞凋亡，克服单一原料、物理混合物功效不足的问题。

5、另一方面，本技术提供了如上所述的甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

6、将甜菜碱和α-酮戊二酸进行混合，自组装，得到所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子。

7、在一些实施方式中，所述α-酮戊二酸为通过利用l-谷氨酸为底物进行谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵得到的。

8、针对现有技术存在的α-酮戊二酸合成杂质多、提纯工序冗长；甜菜碱与α-酮戊二酸仅物理混合或普通成盐，无规整共晶结构，吸潮易降解、生物活性低；复配生产流程繁琐、活性原料损耗大、细胞抗氧化协同作用差等缺陷，本技术通过将甜菜碱和α-酮戊二酸进行混合，自组装，通过分子间静电作用与多重氢键构筑有序共晶晶格，消除单体易吸潮缺陷，提升产物储存稳定性。

9、在本技术中，甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子是一种全新超分子共晶，并非二者物理混合物或普通有机酸盐，在其制备过程中，甜菜碱解离出季铵阳离子，α-酮戊二酸解离形成羧酸根阴离子，阴阳离子间形成静电引力；同时甜菜碱的羟基、α-酮戊二酸的酮基、两端羧基相互交织形成大量分子间氢键，两种分子有序排布，构建三维规整全新晶胞结构。

10、在本技术中，利用谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵制备得到的α-酮戊二酸与甜菜碱进行混合，可以不对α-酮戊二酸进行纯化，大幅节省成本。

11、在一些实施方式中，所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子的制备方法包括以下步骤：

12、（1）对谷氨酸棒状杆菌工程菌经过扩培后得到的二级种子液进行发酵得到菌体发酵液；

13、（2）向菌体发酵液中加入l-谷氨酸，进行催化反应，离心，收集上清液，得到含有α-酮戊二酸的上清液；

14、（3）向α-酮戊二酸的上清液中加入甜菜碱，所述甜菜碱与α-酮戊二酸摩尔配比为2:1，搅拌，得到所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子。

15、在本技术中，所述二级种子液是通过将低温保藏的谷氨酸棒状杆菌依次经过斜面活化、一级种子培养、二级种子扩培得到的。

16、在一些实施方式中，步骤（1）所述发酵使用的发酵培养基为以所述每升培养基计，其含有葡萄糖 10g、蛋白胨 10g、酵母粉 10g、nacl 5g，并在110-120℃（例如110℃、112℃、115℃、118℃或120℃等）灭菌15-20 min（例如15min、16min、17min、18min或20min等）。

17、在一些实施方式中，步骤（1）所述发酵的温度为28～32℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃或32℃等。

18、在一些实施方式中，步骤（1）所述发酵在ph 6.5～7.5（例如6.5、6.7、7、7.2或7.5等）下进行。

19、在一些实施方式中，步骤（1）所述发酵在溶氧20%～40%（例如20%、22%、25%、28%、30%、35%、38%或40%等）下进行。

20、在一些实施方式中，步骤（1）所述发酵的时间为18～24 h（例如18h、19h、21h、22h或24h等）。

21、在本技术中，通过高效液相色谱法测定步骤（2）得到的上清液中α-酮戊二酸的含量，进而计算投入甜菜碱的量。

22、在一些实施方式中，步骤（2）所述催化反应的温度为25～30℃（例如25℃、26℃、27℃、28℃或30℃等）。

23、在一些实施方式中，步骤（2）所述催化反应的时间为8～12 h（例如8h、9h、10h、11h或12h等）。

24、在一些实施方式中，步骤（2）所述催化反应在ph 6.0～7.0（例如6.0、6.3、6.5、6.7或7.0）下进行。

25、在本技术中，依靠菌体胞内高表达谷氨酸脱氢酶实现谷氨酸定向氧化脱氨，完全转化生成α-酮戊二酸。

26、在一些实施方式中，步骤（2）所述离心在温度4～10℃（例如4℃、5℃、7℃、8℃或10℃等）下进行，所述离心的时间为10～20 min（例如10min、12min、15min、17min或20min等）。

27、在一些实施方式中，步骤（2）所述离心的转速为8000～12000 r/min（例如8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min或12000r/min等）。

28、在本技术中，通过低温高速离心完全沉降菌体、菌体碎片、发酵不溶残渣，收集澄清透明上清液，该上清液含原生态α-酮戊二酸，无需浓缩、脱色、结晶预处理。

29、在一些实施方式中，步骤（3）所述甜菜碱与α-酮戊二酸摩尔比为 2:1。

30、在一些实施方式中，步骤（3）所述搅拌在25～35℃（例如25℃、27℃、30℃、32℃或35℃等）下进行，搅拌时间为2～4 h（例如2h、2.5h、3h、3.5h或4h等）。

31、在本技术中，向α-酮戊二酸的上清液中加入甜菜碱，搅拌，依靠静电引力与氢键发生分子识别、有序自组装，形成共晶悬浮液。

32、在一些实施方式中，步骤（3）所述搅拌之后进行浓缩析晶、干燥，得到所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子。

33、在一些实施方式中，所述浓缩析晶为在温度40～50℃（例如40℃、42℃、45℃、47℃或50℃等）、真空度≥0.09 mpa（例如0.09mpa、0.10mpa、0.12 mpa、 0.14 mpa或0.15mpa等）的条件下进行浓缩，而后静置缓慢析晶，真空过滤收集晶体滤饼。

34、在一些实施方式中，所述干燥为在40～60℃（例如40℃、45℃、50℃、55℃或60℃等）下进行真空干燥6～12 h（例如6h、7.5h、9h、10h或12h等）。

35、在一些实施方式中，所述干燥后，将得到的固体过100～120目筛（例如100目、105目、110目、115目或120目等），得到所述甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子。

36、本技术采用谷氨酸棒状杆菌工程菌作为生物催化菌株，首先通过高密度液体深层发酵培养获得高活性菌体生物量，再通过离心、洗涤、浓缩收集高活性新鲜菌泥，以完整菌体作为天然生物催化剂，利用菌体胞内高表达的谷氨酸脱氢酶及代谢关键酶系，在温和水相体系中对底物l-谷氨酸进行高效生物转化，特异性催化谷氨酸发生氧化脱氨反应，精准制备高纯度α-酮戊二酸。

37、本技术的制备工艺条件温和，设备常规；甜菜碱、谷氨酸、工程菌均为工业化成熟原料，采购成本低，工艺可直接落地投产。

38、另一方面，本技术提供了如上所述的甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子在保健品或动物饲料中的应用。

39、相对于现有技术，本技术具有以下有益效果：

40、本技术的甜菜碱α-酮戊二酸共晶超分子通过分子间静电作用与多重氢键构筑有序共晶晶格，消除单体易吸潮缺陷，提升产物储存稳定性；借助共晶独特分子排布实现多通路协同抗氧化，显著提升细胞活力、抗氧化酶水平，抑制细胞凋亡，克服单一原料、物理混合物功效不足的问题。