一种祖先亚胺还原酶、编码基因、载体、宿主细胞及其应用和生产拉罗替尼手性中间体的方法与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种祖先亚胺还原酶、编码基因、载体、宿主细胞及其应用和生产拉罗替尼手性中间体的方法。

背景技术：

1、拉罗替尼（larotrectinib），商品名为维泰凯，化学名称为(3s)-n-[5-[(2r)-2-(2,5-二氟苯基)-1-吡咯烷基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-3-羟基-1-吡咯烷甲酰胺，其分子结构式如下：

2、。

3、(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷是拉罗替尼的关键手性中间体，其分子结构式如下：

4、。

5、(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷的合成主要通过亚胺底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯的不对称还原，反应路线如下：

6、。

7、关于该反应的化学法报道较少，仅报道鏻正离子催化的不对称亚胺还原反应，但是立体选择性较低，对映体比例为97:3（j. am. chem. soc., 2019, 141, 14083-14088）。

8、cn 111057729 a公开一种在亚胺还原酶和还原型辅酶nadph的存在下，将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯进行加氢还原反应制备(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷的方法，其中亚胺还原酶可以为ired71或ired72，该方法适用于5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯初始浓度为0.01~0.05 g/ml的情况，

ee值至少可达94%，通过hplc检测转化率至少可达84%。cn 115838697 a构建一种亚胺还原酶突变体

scirm3，反应5 h即可完全转化80 g/l亚胺底物，

ee值为>99.5%，时空产率384 g/(l·d)，但当底物上载量提升至100 g/l时，24 h转化率仅为68%。由此可见，生物合成法最具开发优势，但是目前底物浓度尚未达到具有工业潜力的100 g/l以上，仍然亟待开发具有更高催化效率的亚胺还原酶。

9、祖先酶是指处于地球进化早期的特殊酶，往往具有比现代酶更高的催化活性、稳定性、底物谱，为工业生物催化提供了更多可能性。通过搜集同源序列、多序列比对、系统发育树构建、祖先序列推断等祖先序列重建技术，可以方便的重建和“复活”祖先酶，进一步通过异源表达和功能筛选，为工业生物催化提供更多优质属性催化剂。通过构建高活力和高稳定性的祖先亚胺还原酶，有望实现拉罗替尼中间体高效生物合成，构建具有工业开发潜力的拉罗替尼中间体生物合成路线。

技术实现思路

1、针对生物合成(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷时反应存在的底物上载量低等问题，本发明提供一种祖先亚胺还原酶、编码基因、载体、宿主细胞及其应用和生产拉罗替尼手性中间体的方法，该祖先亚胺还原酶具有高催化活性和热稳定性，能够应用于高底物上载量的工业生产。

2、本发明技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种具有高稳定性和活性的祖先亚胺还原酶，所述的祖先亚胺还原酶是如下（a）或（b）的酶：

4、（a）氨基酸序列如seq id no.2所示的酶；

5、（b）由（a）中所述亚胺还原酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有亚胺还原酶活性的衍生蛋白质。

6、seq id no.2的序列具体如下：

7、msnktdvsviglglmgtalaraflkaghrvtvwnrtpgkaeplvaegatvaesvaaavaaspiviicvtdydavreileeagvagalsgktivnlstgtpdearemaewveehgaryldgaimcypqdigtpesailysgprevfeehrptlrvlggntryvgedpgaaavldlamlvfyfaalaafleavalaraegidperfleltqamlpildealkdavrriekgdysgdqatidvhaaamehlresmreagirtplmeavrelfqravaaghgeddfsalfqilrkpp。

8、进一步的，所述的衍生蛋白质是将氨基酸序列如seq id no.2所示的祖先亚胺还原酶的第177位亮氨酸突变为丙氨酸，第240位缬氨酸突变为丙氨酸，该衍生蛋白质（突变体l177a/v240a）的氨基酸序列如seq id no.4所示。

9、seq id no.4的序列具体如下：

10、msnktdvsviglglmgtalaraflkaghrvtvwnrtpgkaeplvaegatvaesvaaavaaspiviicvtdydavreileeagvagalsgktivnlstgtpdearemaewveehgaryldgaimcypqdigtpesailysgprevfeehrptlrvlggntryvgedpgaaavldlamavfyfaalaafleavalaraegidperfleltqamlpildealkdavrriekgdysgdqatidahaaamehlresmreagirtplmeavrelfqravaaghgeddfsalfqilrkpp。

11、进一步的，本发明所述亚胺还原酶的来源较佳地包括：采用祖先序列重建法构建祖先亚胺还原酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的亚胺还原酶，通过基因工程方法克隆表达所得的亚胺还原酶。

12、本发明所述亚胺还原酶通过祖先序列重建的方法获得，通过测定比较亚胺还原酶的活力及其对亚胺底物的活性、对映选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的祖先亚胺还原酶，所述亚胺还原酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

13、进一步的，本发明所述亚胺还原酶的基因来源包括：通过人工全基因合成的方法得到所述亚胺还原酶基因。本发明所述亚胺还原酶基因来源较佳地为：通过祖先序列重建的方法获得了编号165的祖先序列。其具体制备方法较佳地包括：依据相应的氨基酸序列，通过密码子优化获得全长基因序列（seq id no.1），命名ancired165，全长为882个核苷酸碱基。其编码序列从第1个碱基起至第882个碱基止，起始密码子为atg，终止密码子为tga。该序列无内含子，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示。

14、seq id no.1的序列具体如下：

15、atgagcaacaaaaccgatgtgagcgtgattggcctgggcctgatgggcaccgcgctggcgcgcgcgtttctgaaagcgggccatcgcgtgaccgtgtggaaccgcaccccgggcaaagcggaaccgctggtggcggaaggcgcgaccgtggcggaaagcgtggcggcggcggtggcggcgagcccgattgtgattatttgcgtgaccgattatgatgcggtgcgcgaaattctggaagaagcgggcgtggcgggcgcgctgagcggcaaaaccattgtgaacctgagcaccggcaccccggatgaagcgcgcgaaatggcggaatgggtggaagaacatggcgcgcgctatctggatggcgcgattatgtgctatccgcaggatattggcaccccggaaagcgcgattctgtatagcggcccgcgcgaagtgtttgaagaacatcgcccgaccctgcgcgtgctgggcggcaacacccgctatgtgggcgaagatccgggcgcggcggcggtgctggatctggcgatgctggtgttttattttgcggcgctggcggcgtttctggaagcggtggcgctggcgcgcgcggaaggcattgatccggaacgctttctggaactgacccaggcgatgctgccgattctggatgaagcgctgaaagatgcggtgcgccgcattgaaaaaggcgattatagcggcgatcaggcgaccattgatgtgcatgcggcggcgatggaacatctgcgcgaaagcatgcgcgaagcgggcattcgcaccccgctgatggaagcggtgcgcgaactgtttcagcgcgcggtggcggcgggccatggcgaagatgattttagcgcgctgtttcagattctgcgcaaaccgccgtga。

16、将基因序列交付基因合成公司进行人工合成，获得相应的基因后，通过pcr的手段对该基因进行扩增，并将该序列连接入pet28a中。

17、所述的引物如下：

18、上游引物：5'-gtgccgcgcggcagccatatgatgagcaacaaaaccgatg-3'（seq id no.5）；

19、下游引物：5'-acggagctcgaattcggatcctcacggcggtttgcgcaga-3'（seq id no.6）。

20、其中，上游引物核苷酸序列下划线部分为

ndei酶切位点，下游引物下划线部分为

bamhi酶切位点。然后以人工合成的基因为模板，利用聚合酶链式反应（pcr）进行基因扩增，获得完整的亚胺还原酶全长基因dna片段。

21、由于密码子的兼并性，编码上述亚胺还原酶（氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示）的核酸分子不仅仅局限于序列如seq id no.1所示的核酸分子。还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示的核酸分子的一个或多个碱基在保持亚胺还原酶活性范围内进行替换、缺失或增加来获得。所述亚胺还原酶基因的突变优选地为2个碱基的突变，分别为将前述亚胺还原酶基因编码序列的第177位亮氨酸突变为丙氨酸，第240位缬氨酸突变为丙氨酸，从而得到所述亚胺还原酶基因的突变体，其核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。

22、seq id no.3的序列具体如下：

23、atgagcaacaaaaccgatgtgagcgtgattggcctgggcctgatgggcaccgcgctggcgcgcgcgtttctgaaagcgggccatcgcgtgaccgtgtggaaccgcaccccgggcaaagcggaaccgctggtggcggaaggcgcgaccgtggcggaaagcgtggcggcggcggtggcggcgagcccgattgtgattatttgcgtgaccgattatgatgcggtgcgcgaaattctggaagaagcgggcgtggcgggcgcgctgagcggcaaaaccattgtgaacctgagcaccggcaccccggatgaagcgcgcgaaatggcggaatgggtggaagaacatggcgcgcgctatctggatggcgcgattatgtgctatccgcaggatattggcaccccggaaagcgcgattctgtatagcggcccgcgcgaagtgtttgaagaacatcgcccgaccctgcgcgtgctgggcggcaacacccgctatgtgggcgaagatccgggcgcggcggcggtgctggatctggcgatggcagtgttttattttgcggcgctggcggcgtttctggaagcggtggcgctggcgcgcgcggaaggcattgatccggaacgctttctggaactgacccaggcgatgctgccgattctggatgaagcgctgaaagatgcggtgcgccgcattgaaaaaggcgattatagcggcgatcaggcgaccattgatgcacatgcggcggcgatggaacatctgcgcgaaagcatgcgcgaagcgggcattcgcaccccgctgatggaagcggtgcgcgaactgtttcagcgcgcggtggcggcgggccatggcgaagatgattttagcgcgctgtttcagattctgcgcaaaccgccgtga。

24、第二方面，本发明提供一种编码上述祖先亚胺还原酶的基因。

25、进一步的，所述编码上述祖先亚胺还原酶的基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.3所示。

26、第三方面，本发明提供一种携带编码上述祖先亚胺还原酶的基因的重组表达载体。该重组表达载体可通过本领域常规方法将上述祖先亚胺还原酶基因克隆到各种表达载体上构建而成，其中，表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述表达载体优选为pet-28a质粒。

27、进一步的，可通过下述方法制得所述重组表达载体：将通过pcr扩增所得的祖先亚胺还原酶基因产物用限制性内切酶

ndei和

bamhi双酶切，同时将表达载体pet-28a用限制性内切酶

ndei和

bamhi双酶切，形成互补的粘性末端，回收上述祖先亚胺还原酶基因酶切产物以及酶切后的pet-28a质粒，利用t4 dna连接酶连接，构建包含所述祖先亚胺还原酶基因的重组表达载体pet28a-

ancired165。

28、第四方面，本发明提供一种表达上述祖先亚胺还原酶的宿主细胞。

29、进一步的，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的祖先亚胺还原酶基因可被有效表达即可，如细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等。

30、进一步的，所述细菌优选为大肠埃希氏菌，更优选地为：大肠埃希氏菌

e.

colibl21(de3)或大肠埃希氏菌

e. colidh5α。将前述重组表达载体pet28a-

ancired165转化至大肠埃希氏菌

e. colibl21(de3)中，即可得基因工程菌株，即大肠埃希氏菌

e.

colibl21(de3)/pet28a-

ancired165。

31、进一步的，上述祖先亚胺还原酶由以下步骤制备得到：将表达上述祖先亚胺还原酶的宿主细胞接种至培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得上述祖先亚胺还原酶。

32、进一步的，所述的培养基可为本领域中任何可使转化体生长并产生祖先亚胺还原酶的培养基。所述培养基优选lb培养基：蛋白胨5-15 g/l，酵母膏1-10 g/l，nacl 5-15 g/l，ph 6.0-8.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生祖先亚胺还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。菌株培养方法优选的包括：将本发明所述的重组大肠埃希氏菌（优选

e. colibl21(de3)）接种至含卡那霉素的lb培养基中培养，当培养液的光密度od600达到0.6-0.8（优选0.6）时，在终浓度为0.1-1.0mmol/l（优选0.2 mmol/l）的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（iptg）的诱导下，即可高效表达本发明所述祖先亚胺还原酶。

33、第五方面，本发明提供一种上述祖先亚胺还原酶、编码基因、载体或宿主细胞在生产拉罗替尼手性中间体中的应用；

34、拉罗替尼手性中间体为(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷，结构式如下：

35、。

36、第六方面，本发明还提供一种生产拉罗替尼手性中间体的方法，包括以下步骤：

37、以氨基酸序列如seq id no.2所示的祖先亚胺还原酶或由其经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有祖先亚胺还原酶活性的衍生蛋白质（例如氨基酸序列如seq id no.4所示的祖先亚胺还原酶）为催化剂，通过不对称还原合成反应制备拉罗替尼手性中间体；

38、拉罗替尼手性中间体为(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷，结构式如下：

39、。

40、进一步的，以5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯为底物制备拉罗替尼手性中间体。

41、进一步的，不对称还原合成反应的条件如下：将表达上述祖先亚胺还原酶的宿主细胞溶解于缓冲液中，加入底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯至终浓度为50-1000mmol/l，机械搅拌，控制反应温度和反应体系ph值，直至底物转化完全。

42、进一步的，缓冲液为磷酸钠盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或甘氨酸-naoh缓冲液。具体地，以5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯化合物为底物，在磷酸钠盐缓冲液中，在所述祖先亚胺还原酶的催化下，利用5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2h-吡咯化合物进行不对称还原合成反应，形成拉罗替尼手性中间体。

43、进一步的，反应温度为20-60℃，优选为30℃。

44、进一步的，反应体系的ph值为6.0-8.0，优选为6.0。

45、进一步的，反应结束后调节ph值至10.0，用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，得到拉罗替尼手性中间体。

46、本发明的有益效果在于：

47、本发明的祖先亚胺还原酶作为催化剂在不对称还原制备拉罗替尼手性中间体(r)-2-(2,5-二氟苯基）吡咯烷的应用中，酶的活性高，底物上载量高，收率可达90%，光学纯度高，

ee值达99%以上，反应条件温和，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。