一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程和酶工程，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段、包含该突变体或其活性片段的基因工程菌及它们在制备2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸中的应用。

背景技术：

1、l-抗坏血酸（维生素c，l-aa）是人体必需的一种营养元素，具有抗氧化、提高免疫力、美白等多种生理功效。然而，l-aa分子中存在的连烯二醇结构极不稳定，对氧气、光照、热以及金属离子等条件极其敏感，容易发生氧化失活，这严重制约了其在食品、医药和化妆品等领域的广泛应用。

2、2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸（aa-2g）是l-aa的一种糖苷衍生物，通过将葡萄糖基转移至l-aa分子的2位羟基上形成。相较于l-aa，aa-2g具有显著的结构稳定性和非还原性，且进入人体后能够在α-葡萄糖苷酶的作用下缓慢水解，持续释放出l-aa以发挥生理功能，因此被誉为“稳定型维生素c”，具有极高的工业应用价值。

3、目前，aa-2g的合成方法主要包括化学合成法和生物酶法。其中，化学合成法存在步骤繁琐、选择性差以及环境污染严重等弊端，已逐渐被淘汰。生物酶法则凭借反应条件温和、底物特异性高和环境友好等突出优势，成为当前制备aa-2g的主流方法。在多种生物酶法中，利用蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，spase，ec 2.4.1.7）以廉价蔗糖为糖基供体，一步催化抗坏血酸的糖基化反应合成aa-2g，是最具经济性和产业化应用前景的路线。

4、然而，野生型蔗糖磷酸化酶（bbrspase）对非天然受体（l-抗坏血酸）的亲和力较低、催化速度缓慢，且在催化过程中存在较强的水解副反应，导致酶促反应时间过长、l-aa转化率偏低、aa-2g产量普遍不高，难以满足工业化生产的需求。

5、为解决上述问题，研究人员已尝试对现有工艺进行改进。例如，专利cn114703158b将来源于短双歧杆菌（bifidobacterium breve）的蔗糖磷酸化酶进行多点组合突变，获得了高比酶活和高选择性的蔗糖磷酸化酶突变体，但其催化反应48小时后转化率仅为51%。专利申请cn113174417a公开了一种酶法制备维生素c葡萄糖苷的方法，其维生素c的转化率虽可达90%以上，但反应体系中维生素c的浓度最高仅为50 g/l，且采用离子交换层析除糖工艺进行纯化时，杂质去除率仅为70%。专利申请cn120366254a公开了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其在制备aa-2g中的应用，然而，其实施例中l-抗坏血酸的浓度仅为0.5 mol/l，且aa-2g产量仅达140.4 g/l。由此可见，该专利申请在底物耐受浓度和催化效率方面存在明显不足，难以满足高底物浓度工业化生产的需求。

6、现有技术中利用蔗糖磷酸化酶催化合成aa-2g的方法仍然存在底物耐受浓度低、反应周期长且催化效率不高的问题。

7、因此，本领域亟需开发一种能够耐受高浓度底物并兼具高催化效率的aa-2g的制备方法。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种蔗糖磷酸化酶突变体及其活性片段。本发明人经研究发现，通过对来源于短双歧杆菌（bifidobacterium breve）的野生型蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列进行特定位点的突变或组合突变，能够有效克服野生型蔗糖磷酸化酶对非天然受体l-抗坏血酸亲和力低、催化效率低以及热稳定性差的技术瓶颈。由此，本发明提供了一种兼具高催化活性和高热稳定性的蔗糖磷酸化酶突变体以及该突变体在催化合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸中的应用。

2、本发明的上述目的是通过提供以下技术方案实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段，其中，所述蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段的氨基酸序列与seq id no: 1所示的野生型蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列相比，包含至少一个，例如1、2、3或4个选自以下的突变：

4、（1）第135位精氨酸r突变为半胱氨酸c（r135c）；

5、（2）第332位丙氨酸a突变为甘氨酸g（a332g）；

6、（3）第334位苏氨酸t突变为甲硫氨酸m（t334m）；以及

7、（4）第342位天冬氨酸d突变为谷氨酸e（d342e）。

8、根据本发明的一些实施方案，所述蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段的氨基酸序列与seq id no: 1所示的野生型蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列相比，包含以下四个突变：r135c、a332g、t334m和d342e。

9、在本发明中，所述野生型蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列seq id no: 1来源于短双歧杆菌，seq id no: 1如下所示：

10、mknkvqliayadhlgdgtlssmtdilrtrfdgvydgvhilpfftpfdgadagfdpidhtkvdprlgswddvaelskthgimvdaivnhmswesaqfqdvlkngenseyypmfltmssvfpngateeelagiyrprpglpfthykfagktrlvwvsftpqqvdidtdsdkgweylmsifdqmaashvryirldavgygakeagtscfmtpktfklisrlreegvkrgleilievhsyykkqveiaskvdrvydfalpplllhslftghvspvahwteirpnnavtvldthdgigvidigsdqldrslkglvpdedvdnlvntihanthgesqaatgaaasnldlyqvnstyysalgcndqhylaaravqfflpgvpqvyyvgalagrndmellrktnngrdinrhyystaeidenlerpvvkalnalakfrnelpafngefsyeadgdtsitfrwiaadgktkaalifepgrglgadnttpvaslawtdaagdhetddllsnppiadid

11、在本发明中，所述野生型蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列（seq id no: 2）如下所示：

12、atgaaaaacaaagtgcagctgattgcgtatgcggatcatctgggcgatggcaccctgagcagcatgaccgatattctgcgcacccgctttgatggcgtgtatgatggcgtgcatattctgccgttttttaccccgtttgatggcgcggatgcgggctttgatccgattgatcataccaaagtggatccgcgcctgggcagctgggatgatgtggcggaactgagcaaaacccatggcattatggtggatgcgattgtgaaccatatgagctgggaaagcgcgcagtttcaggatgtgctgaaaaacggcgaaaacagcgaatattatccgatgtttctgaccatgagcagcgtgtttccgaacggcgcgaccgaagaagaactggcgggcatttatcgcccgcgcccgggcctgccgtttacccattataaatttgcgggcaaaacccgcctggtgtgggtgagctttaccccgcagcaggtggatattgataccgatagcgataaaggctgggaatatctgatgagcatttttgatcagatggcggcgagccatgtgcgctatattcgcctggatgcggtgggctatggcgcgaaagaagcgggcaccagctgctttatgaccccgaaaacctttaaactgattagccgcctgcgcgaagaaggcgtgaaacgcggcctggaaattctgattgaagtgcatagctattataaaaaacaggtggaaattgcgagcaaagtggatcgcgtgtatgattttgcgctgccgccgctgctgctgcatagcctgtttaccggccatgtgagcccggtggcgcattggaccgaaattcgcccgaacaacgcggtgaccgtgctggatacccatgatggcattggcgtgattgatattggcagcgatcagctggatcgcagcctgaaaggcctggtgccggatgaagatgtggataacctggtgaacaccattcatgcgaacacccatggcgaaagccaggcggcgaccggcgcggcggcgagcaacctggatctgtatcaggtgaacagcacctattatagcgcgctgggctgcaacgatcagcattatctggcggcgcgcgcggtgcagttttttctgccgggcgtgccgcaggtgtattatgtgggcgcgctggcgggccgcaacgatatggaactgctgcgcaaaaccaacaacggccgcgatattaaccgccattattatagcaccgcggaaattgatgaaaacctggaacgcccggtggtgaaagcgctgaacgcgctggcgaaatttcgcaacgaactgccggcgtttaacggcgaatttagctatgaagcggatggcgataccagcattacctttcgctggattgcggcggatggcaaaaccaaagcggcgctgatttttgaaccgggccgcggcctgggcgcggataacaccaccccggtggcgagcctggcgtggaccgatgcggcgggcgatcatgaaaccgatgatctgctgagcaacccgccgattgcggatattgat

13、在本发明中，所述蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列（seq id no: 3）如下所示：

14、mknkvqliayadhlgdgtlssmtdilrtrfdgvydgvhilpfftpfdgadagfdpidhtkvdprlgswddvaelskthgimvdaivnhmswesaqfqdvlkngenseyypmfltmssvfpngateeelagiyrpcpglpfthykfagktrlvwvsftpqqvdidtdsdkgweylmsifdqmaashvryirldavgygakeagtscfmtpktfklisrlreegvkrgleilievhsyykkqveiaskvdrvydfalpplllhslftghvspvahwteirpnnavtvldthdgigvidigsdqldrslkglvpdedvdnlvntihanthgesqgamgaaasnlelyqvnstyysalgcndqhylaaravqfflpgvpqvyyvgalagrndmellrktnngrdinrhyystaeidenlerpvvkalnalakfrnelpafngefsyeadgdtsitfrwiaadgktkaalifepgrglgadnttpvaslawtdaagdhetddllsnppiadid

15、第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其核苷酸序列包含编码根据本发明第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段的核苷酸序列或由其组成。

16、在本发明中，所述蔗糖磷酸化酶突变体的核苷酸序列（seq id no: 4）如下所示：

17、atgaaaaacaaagtgcagctgattgcgtatgcggatcatctgggcgatggcaccctgagcagcatgaccgatattctgcgcacccgctttgatggcgtgtatgatggcgtgcatattctgccgttttttaccccgtttgatggcgcggatgcgggctttgatccgattgatcataccaaagtggatccgcgcctgggcagctgggatgatgtggcggaactgagcaaaacccatggcattatggtggatgcgattgtgaaccatatgagctgggaaagcgcgcagtttcaggatgtgctgaaaaacggcgaaaacagcgaatattatccgatgtttctgaccatgagcagcgtgtttccgaacggcgcgaccgaagaagaactggcgggcatttatcgcccgtgcccgggcctgccgtttacccattataaatttgcgggcaaaacccgcctggtgtgggtgagctttaccccgcagcaggtggatattgataccgatagcgataaaggctgggaatatctgatgagcatttttgatcagatggcggcgagccatgtgcgctatattcgcctggatgcggtgggctatggcgcgaaagaagcgggcaccagctgctttatgaccccgaaaacctttaaactgattagccgcctgcgcgaagaaggcgtgaaacgcggcctggaaattctgattgaagtgcatagctattataaaaaacaggtggaaattgcgagcaaagtggatcgcgtgtatgattttgcgctgccgccgctgctgctgcatagcctgtttaccggccatgtgagcccggtggcgcattggaccgaaattcgcccgaacaacgcggtgaccgtgctggatacccatgatggcattggcgtgattgatattggcagcgatcagctggatcgcagcctgaaaggcctggtgccggatgaagatgtggataacctggtgaacaccattcatgcgaacacccatggcgaaagccagggcgcgatgggcgcggcggcgagcaacctggaactgtatcaggtgaacagcacctattatagcgcgctgggctgcaacgatcagcattatctggcggcgcgcgcggtgcagttttttctgccgggcgtgccgcaggtgtattatgtgggcgcgctggcgggccgcaacgatatggaactgctgcgcaaaaccaacaacggccgcgatattaaccgccattattatagcaccgcggaaattgatgaaaacctggaacgcccggtggtgaaagcgctgaacgcgctggcgaaatttcgcaacgaactgccggcgtttaacggcgaatttagctatgaagcggatggcgataccagcattacctttcgctggattgcggcggatggcaaaaccaaagcggcgctgatttttgaaccgggccgcggcctgggcgcggataacaccaccccggtggcgagcctggcgtggaccgatgcggcgggcgatcatgaaaccgatgatctgctgagcaacccgccgattgcggatattgat

18、第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含根据本发明第二方面所述的分离的核酸分子。

19、根据本发明的一些实施方案，所述表达载体的骨架为pet28a(+)。

20、第四方面，本发明提供了一种基因工程菌，其包含根据本发明第二方面所述的分离的核酸分子，或根据本发明第三方面所述的表达载体。

21、根据本发明的一些实施方案，所述基因工程菌的表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)。

22、根据本发明的一些具体实施方案，所述基因工程菌通过包括以下步骤的方法获得：将seq id no: 4所示的核苷酸序列进行全基因合成，并连接至表达载体pet28a(+)中，得到重组表达载体；然后将所述重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，筛选获得所述基因工程菌。

23、第五方面，本发明提供了一种用于制备2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的方法，其包括：以根据本发明第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突变体或其活性片段或根据本发明第四方面所述的基因工程菌为催化剂，催化蔗糖和l-抗坏血酸反应。

24、根据本发明的一些实施方案，所述方法包括以下步骤：

25、s1. 提供含有蔗糖和l-抗坏血酸的底物溶液，并使所述底物溶液与所述催化剂接触，以进行酶促反应；

26、s2. 反应结束后，将所得反应混合液进行纯化分离，获得所述2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸。

27、优选地，所述底物溶液中蔗糖和l-抗坏血酸的摩尔比为1:（0.8-1.5），优选为1:（0.9-1.2）。

28、优选地，所述底物溶液中蔗糖的摩尔浓度为0.8-1.5 mol/l。

29、优选地，所述底物溶液中l-抗坏血酸的摩尔浓度为0.8-1.4 mol/l。

30、优选地，所述底物溶液以水为溶剂（即不含有缓冲溶液）。

31、优选地，所述底物溶液的ph值为4-5.5，优选为4.5-5.0。

32、优选地，所述蔗糖和l-抗坏血酸以一次性投加或在反应过程中分批补料的方式加入反应体系中。

33、根据本发明的一些实施方案，所述反应的条件包括：反应温度为25-60℃，优选为35-50℃；反应时间为12-20小时，优选为14-18小时。

34、根据本发明的一些实施方案，所述催化剂为所述基因工程菌；优选地，以所述基因工程菌的湿菌体的重量计，所述基因工程菌的添加量为所述蔗糖总重量的5-30%，优选为10-25%；进一步优选地，所述湿菌体的含水量为50-60重量%。

35、根据本发明的一些实施方案，所述纯化分离包括以下步骤：

36、（1）将所述反应混合液进行热处理，然后进行微滤，收集微滤滤液；

37、（2）将所述微滤滤液进行纳滤浓缩和透析，收集浓缩液；

38、（3）将所述浓缩液进行蒸发浓缩，然后加入有机溶剂进行重结晶，分离得到2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸结晶物。

39、在本发明中，所述热处理用于终止酶促反应；所述微滤主要用于脱除反应液中的残留菌体；所述纳滤浓缩则主要用于去除反应液中残留的果糖、葡萄糖、无机盐及未反应的抗坏血酸。

40、优选地，所述热处理的条件包括：热处理温度为70-90℃，热处理时间为20-40min。

41、优选地，所述微滤采用的膜孔径为0.2-0.3 μm。

42、优选地，所述纳滤浓缩和透析包括：将所述微滤滤液用水稀释至折光为8-15%后，纳滤浓缩至折光为20-30%，然后加入纳滤浓缩液体积的30-40%的水进行透析，透析次数为2-5次。

43、优选地，所述纳滤采用的纳滤膜截留分子量为200-300 da。

44、优选地，所述蒸发浓缩至折光为75-90%。

45、优选地，所述有机溶剂为无水乙醇。

46、优选地，所述重结晶包括：先升温至45-55℃，待所述2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸溶解完全后，再降温至20-30℃进行析晶。

47、根据本发明的一些具体实施方案，所述大肠杆菌湿菌体的制备方法包括如下步骤：

48、（1）将包含所述表达载体的大肠杆菌的单菌落接种至含有卡那霉素（kanamycinsulfate, kan）的lb（luria-bertani）培养基中，于36-38℃、200-240 rpm条件下培养过夜，获得种子液；

49、（2）将所述种子液按体积比为1-5%的接种量接种至含有卡那霉素的tb培养基中，于36-38℃下培养至菌液od600值为0.6-1.0，然后降温至28-32℃，在160-200 rpm条件下继续培养20-40 min；

50、（3）向所得的菌液中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）至终浓度为0.05-1.5mmol/l，于25-35℃、150-200 rpm条件下继续诱导培养4-10小时；

51、（4）培养结束后，将所得的发酵液于4-10℃、6000-10000 g条件下离心10-30 min，收集菌体沉淀；然后用生理盐水重悬所述菌体沉淀并洗涤1-3次，再次离心收集菌体，得到表达所述蔗糖磷酸化酶突变体的大肠杆菌湿菌体，低温保存。

52、本发明至少具有如下有益效果：

53、1. 本发明通过对来源于短双歧杆菌的野生型bbrspase进行了特定位点的突变，获得了兼具高活性和高稳定性的bbrspase突变体。相较于野生型bbrspase，本发明的bbrspase突变体显著提高了催化活性，并缩短了反应时间。具体而言，本发明的突变体对非天然受体l-抗坏血酸的催化活性得到显著提升。在相同条件下反应16小时后，采用本发明的突变体，l-抗坏血酸的转化率达到73.5%，为野生型的1.37倍，大幅提高了反应效率，缩短了生产周期。

54、2. 本发明的突变体展现出优异的温度稳定性，其最适反应温度由野生型的35℃提升至45℃。在45℃的反应条件下，采用本发明的突变体催化16小时后，l-抗坏血酸的转化率高达80.51%，且在25℃至60℃的宽温度区间内，其活性均显著高于野生型。这一特性使得反应可在较高温度下进行，不仅有利于降低工业生产中的冷却能耗，还能有效减少杂菌污染风险，更符合工业化生产的工艺需求。

55、3. 本发明的突变体能够耐受高浓度的底物体系。具体而言，在底物浓度高达1.5mol/l蔗糖和1.4 mol/l l-抗坏血酸的反应条件下，采用分批补料方式，反应仅需16小时即可达到平衡，l-抗坏血酸的摩尔转化率达到85.21%，aa-2g的产量可达403.54 g/l。相较于现有技术中l-抗坏血酸浓度低（如50 g/l）、反应周期长（如48小时）的工艺，本发明的突变体显著提升了单位体积产能和时空产率，有效降低了aa-2g的生产成本，为大规模工业化生产奠定了坚实基础。

56、4. 本发明的纯化分离方法简捷高效，可操作性强，避免了传统离子交换层析工艺中大量使用酸、碱对环境造成的污染，易于实现工业化放大生产。

57、5. 通过本发明的纯化分离方法制得的aa-2g结晶物的纯度及含量均≥99.9%，产品纯化总收率高达92.0%。本发明的纯化分离采用“微滤+纳滤浓缩与透析除盐”的组合膜分离技术，结合精确的折光控制和重结晶工艺，不仅高效地除去了反应液中残留的果糖、葡萄糖、无机盐及未反应的抗坏血酸等小分子杂质，还具有极佳的分离选择性和质量稳定性，在保证极高纯度的同时极大减少了目标产物的流失，显著提高了工业生产的综合效益。