与黑羽番鸭精子存活率相关的SNP分子标记、检测引物组和应用

本发明涉及动物分子育种，具体地，涉及与黑羽番鸭精子存活率相关的snp分子标记、检测引物组和应用。

背景技术：

1、番鸭是我国重要的特色肉鸭种质资源，公鸭繁殖性能直接影响种鸭群体的扩繁效率和商品代鸭苗的生产。精子存活率是评价公鸭精液品质和繁殖性能的重要指标之一，其高低直接关系到精子的生存能力、受精潜力及人工授精效果。

2、目前，公鸭精子存活率的评价主要依赖精液采集后的显微镜观察、染色检测等表型测定方法，存在检测过程较为繁琐、受环境和检测条件影响较大、检测成本较高等问题。同时，精子存活率属于复杂数量性状，仅依靠传统表型选择难以及早识别具有优良繁殖性能的种公鸭，限制了选育效率。

3、随着全基因组重测序和分子标记技术的发展，利用与精子存活率相关的单核苷酸多态性（snp）标记进行早期分子辅助选择，可在种鸭尚未表现稳定繁殖表型前对其遗传潜力进行筛选。然而，目前对于番鸭种鸭的繁殖潜力筛选尚无较好的方法。

4、因此，开发一种与番鸭精子存活率显著相关、检测简便且适用于分子标记辅助育种的snp标记，提高黑羽番鸭种公鸭繁殖性能和育种效率是本发明亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中黑羽番鸭公鸭精子存活率主要依赖表型检测、检测过程较为繁琐以及难以实现早期遗传选择的问题，从而提供一种与黑羽番鸭精子存活率相关的snp分子标记、该snp分子标记的检测方法及其在精子存活率鉴定和分子标记辅助选育中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种与黑羽番鸭精子存活率相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于黑羽番鸭gwhbjbf00000002号染色体第174422位点的碱基处，该snp分子标记位点存在一个c/t单核苷酸多态性。

3、具体地，该snp位点的基因型具体包括：c/c基因型、c/t基因型和t/t基因型。

4、用于定位该snp位点的基因组序列为黑羽番鸭gwhbjbf00000002号染色体第174222-174622位碱基序列（401bp）。具体地，用于定位该snp位点的基因组序列如seq idno:1或seq id no:2所示。即，seq id no:1对应等位基因为c的序列，seq id no:2对应等位基因为t的序列。

5、即，该snp位点位于如seq id no:1或seq id no:2所示的序列的第201位，对应参考基因组gwhbjbf00000002号染色体第174422位。

6、本发明还提供了针对上述snp分子标记设计两条等位基因特异性上游引物和一条通用下游引物。其中，针对c等位基因设计的特异性上游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示（具体为：gaaggtgaccaagttcatgctgccagggctttggtgtcg），其前段序列为fam通用荧光标签序列；针对t等位基因设计的特异性上游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示（具体为：gaaggtcggagtcaacggattgccagggctttggtgtca），其前段序列为vic通用荧光标签序列；通用下游引物的核苷酸序列如seq id no:5所示（具体为：cagcaactgccccgaacc）。

7、进一步地，本发明还提供了基于上述snp分子标记的辅助选育方法，通过利用上述snp分子标记进行黑羽番鸭公鸭精子存活率早期鉴定和分子标记辅助选育，其具体包括以下步骤：

8、步骤一、采集待测个体样品

9、采集待测黑羽番鸭公鸭的翅静脉血液样品，提取基因组dna。

10、步骤二、进行snp基因分型

11、采用上述kasp特异性引物及pcr反应体系，对gwhbjbf00000002:174422位点进行基因分型。

12、步骤三、确定基因型

13、根据kasp荧光信号确定待测个体属于c/c、c/t或t/t基因型。

14、步骤四、依据基因型进行选择

15、在进行黑羽番鸭种公鸭繁殖性能选择时，优先选择c/c基因型个体作为候选种公鸭，减少或淘汰c/t基因型个体，以提高群体中与较高精子存活率相关的等位基因频率。

16、通过上述技术方案，本发明至少具有以下有益效果：

17、1、本发明筛选获得了与黑羽番鸭精子存活率显著相关的snp分子标记。

18、本发明通过全基因组重测序和全基因组关联分析，在黑羽番鸭公鸭群体中筛选获得gwhbjbf00000002:174422 c/t snp位点，其与精子存活率达到显著关联水平，emmax模型p值达到1.638×10-10，可作为黑羽番鸭精子存活率候选分子标记。

19、2、分子标记具有明确的基因型与表型对应关系。

20、kasp验证结果表明，c/c基因型个体精子存活率平均值为82.81%，c/t基因型个体平均值为65.86%，c/c型个体较c/t型个体平均精子存活率提高约16.94个百分点，表明该位点具有较好的精子存活率鉴别潜力。

21、3、检测方法快速、准确，适合批量检测。

22、本发明采用kasp技术进行snp基因分型，反应体系小、操作简便，可利用常规荧光pcr仪完成检测，适合多个个体的批量基因分型。

23、4、可用于早期分子标记辅助选择。

24、传统精子存活率评价需要待公鸭达到种用阶段后采集精液进行检测，而本发明只需采集血液提取dna即可进行基因型检测，可在早期阶段筛选具有潜在较高精子存活率的候选种公鸭，从而缩短育种周期、降低表型测定成本。

25、5、有利于提高黑羽番鸭种公鸭繁殖性能选育效率。

26、将本发明的snp标记应用于黑羽番鸭种公鸭选育，可以将精子存活率纳入分子标记辅助育种体系，为黑羽番鸭繁殖性能遗传改良提供新的技术手段。

1.一种与黑羽番鸭精子存活率相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于黑羽番鸭gwhbjbf00000002号染色体第174422位点的碱基处，该snp分子标记位点存在c/t单核苷酸多态性。

2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记对应如seq idno:1或seq id no:2所示的核苷酸序列中的第201位碱基。

3.一种用于检测如权利要求1或2所述的snp分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no:3所示的c等位基因特异性上游引物，如seq id no:4所示的t等位基因特异性上游引物，以及如seq id no:5所示的通用下游引物。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述c等位基因特异性上游引物的5'端连接有第一荧光基团，所述t等位基因特异性上游引物的5'端连接有第二荧光基团；且，

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述第一荧光基团为fam，所述第二荧光基团为vic。

6.如权利要求1或2所述的snp分子标记在筛选具有高精子存活率的黑羽番鸭公鸭中的应用，其特征在于，所述应用为选择所述snp分子标记为c/c基因型的黑羽番鸭公鸭。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述筛选过程具体包括：采用如seq idno:3、seq id no:4和seq id no:5所示的引物组扩增含有snp标记的位点的基因片段，得到扩增产物；对得到的扩增产物采用测序技术进行基因分型，筛选c/c基因型的黑羽番鸭公鸭。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含有snp标记的位点的基因片段如seqid no:1或seq id no:2所示。