一种用于调控花生荚果和籽粒大小的基因及其分子标记与应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于调控花生荚果和籽粒大小的基因及其分子标记与应用。

背景技术：

1、花生（arachis hypogaea l.）是全球重要的油料作物和经济作物，兼具食用、油料和饲用价值，荚果和籽粒大小是花生的重要农艺性状，直接决定花生产量和商品品质。培育荚果大、籽粒饱满的花生品种是花生育种的核心目标之一。传统花生育种主要依赖于表型选择和杂交育种，存在育种周期长、筛选效率低、受环境影响大等问题，难以快速精准地改良荚果和籽粒大小性状。随着分子生物学和基因工程技术的发展，挖掘调控花生荚果和籽粒大小的关键功能基因，通过分子育种手段定向改良花生性状，成为提升花生育种效率的重要途径。

2、yabby 基因家族是植物特有的转录因子家族，其编码的蛋白质含有保守的锌指结构域和 yabby 结构域，在植物器官形态建成、极性发育、组织分化等过程中发挥重要调控作用。已有研究表明，yabby 基因在拟南芥、水稻、番茄等植物中参与叶片、花器官、果实等的发育调控，但在花生中，关于 yabby 基因的克隆及功能研究尚未见报道，更无关于yabby 基因调控花生荚果和籽粒大小的相关研究。

3、因此，挖掘花生中调控荚果和籽粒大小的 yabby 基因，明确其功能和应用价值，对于推动花生分子育种、培育高产优质花生新品种具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种花生荚果和籽粒大小调控基因ahyabby，所述ahyabby基因包含来源于花生两套亚基因组的两个同源基因，分别为ah08yabby和ah18yabby；所述ah08yabby基因位于8号染色体上，其基因组全长序列如seq id no.1所示；所述ah18yabby基因位于18号染色体上，其基因组全长序列如seq id no.2所示。

2、进一步的，所述ah08yabby基因的野生型cds序列如seq id no.3所示，突变型cds序列如seq id no.4所示；所述ah18yabby基因的野生型cds序列如seq id no.5所示，突变型cds序列如seq id no.6所示。

3、进一步的，所述ah08yabby基因的野生型蛋白序列如seq id no.7所示，突变型蛋白序列如seq id no.8所示；所述ah18yabby基因的野生型蛋白序列如seq id no.9所示，突变型蛋白序列如seq id no.10所示。

4、进一步的，所述引物对的序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

5、进一步的，所述引物对的序列如seq id no.13和seq id no.14所示。

6、本发明还提供了一种用于检测权利要求1所述ah08yabby基因999 bp缺失位点的kasp引物组，所述引物组包含如seq id no.17和seq id no.18所示的两条正向引物，以及如seq id no.19和seq id no.20所示的两条通用反向引物。

7、本发明还提供了一种用于检测上述ah18yabby基因220 bp缺失位点的kasp引物组，所述引物组包含如seq id no.21和seq id no.22所示的两条正向引物，以及如seq idno.23和seq id no.24所示的两条通用反向引物。

8、本发明还提供了一种用于鉴定权上述ahyabby基因阳性转基因或基因编辑花生株系的特异性引物对，所述引物对为ah08yabby鉴定引物对或ah18yabby鉴定引物对；所述ah08yabby鉴定引物对的序列如seq id no.25和seq id no.26所示；所述ah18yabby鉴定引物对的序列如seq id no.27和seq id no.28所示。

9、本发明还提供了上述引物对或引物组在花生分子标记辅助育种中的应用，利用所述引物对或引物组进行pcr扩增或kasp检测，鉴定花生中ah08yabby和/或ah18yabby基因的基因型，筛选荚果和/或籽粒性状优良的花生单株或株系。

10、本发明还提供了一种培育荚果和/或籽粒增大的转基因花生品种的方法，包括以下步骤：

11、1）构建含有权利要求1所述ahyabby基因的重组植物表达载体；

12、2）将所述重组表达载体导入花生受体细胞或愈伤组织；

13、3）对转化后的细胞或愈伤组织进行培养，获得再生花生植株；

14、4）对再生植株进行分子检测和表型鉴定，筛选获得荚果和/或籽粒增大的转基因花生株系。

15、本发明具有以下有益效果：

16、本发明利用大果花生品种豫花15（yh15）和小果花生资源w1202构建的重组自交家系群体，结合全基因组重测序获得的基因型数据和多个环境的表型数据在8和18号染色体上定位到控制花生荚果和籽粒大小的主效qtl位点；通过精细定位、转录组差异表达分析及结构变异检测，筛选并鉴定出两个同源ahyabby基因为控制花生荚果和籽粒大小的关键候选基因；进一步利用 crispr/cas9 基因编辑技术创制突变体，验证了ahyabby基因对花生荚果与籽粒大小的正调控作用。

17、通过分析yh15和w1202的原始测序数据与参考基因组比对后生成的bam文件发现，与yh15相比，w1202在8号染色体上的yabby基因（yh15.ah08g165700）中存在999 bp的缺失，该缺失覆盖了末端内含子和外显子区域的一部分。与w1202相比，yh15在18号染色体上的yabby基因（yh15.ah18g072600）中存在220 bp的缺失，该缺失位于第三个内含子起始位点下游4 bp处，导致基因结构发生改变和翻译提前终止。基于ahyabby基因在8号和18号染色体上的突变位点分别开发了两个kasp分子标记，在“豫花15和w1202”重组自交系群体中验证了该标记与花生荚果和籽粒大小高度连锁，证明了该标记的准确性。这两个kasp标记能应用于大果花生品种的分子辅助标记选择。

1.一种花生荚果和籽粒大小调控基因ahyabby，其特征在于：所述ahyabby基因包含来源于花生两套亚基因组的两个同源基因，分别为ah08yabby和ah18yabby；所述ah08yabby基因位于8号染色体上，其基因组全长序列如seq id no.1所示；所述ah18yabby基因位于18号染色体上，其基因组全长序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的ahyabby基因，其特征在于：所述ah08yabby基因的野生型cds序列如seq id no.3所示，突变型cds序列如seq id no.4所示；所述ah18yabby基因的野生型cds序列如seq id no.5所示，突变型cds序列如seq id no.6所示。

3.根据权利要求2所述的ahyabby基因，其特征在于：所述ah08yabby基因的野生型蛋白序列如seq id no.7所示，突变型蛋白序列如seq id no.8所示；所述ah18yabby基因的野生型蛋白序列如seq id no.9所示，突变型蛋白序列如seq id no.10所示。

4.一种用于扩增权利要求1所述ah08yabby基因中999 bp缺失片段的pcr引物对，其特征在于，所述引物对的序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

5.一种用于扩增权利要求1所述ah18yabby基因中220 bp缺失片段的pcr引物对，其特征在于，所述引物对的序列如seq id no.13和seq id no.14所示。

6.一种用于检测权利要求1所述ah08yabby基因999 bp缺失位点的kasp引物组，其特征在于，所述引物组包含如seq id no.17和seq id no.18所示的两条正向引物，以及如seqid no.19和seq id no.20所示的两条通用反向引物。

7.一种用于检测权利要求1所述ah18yabby基因220 bp缺失位点的kasp引物组，其特征在于，所述引物组包含如seq id no.21和seq id no.22所示的两条正向引物，以及如seqid no.23和seq id no.24所示的两条通用反向引物。

8.一种用于鉴定权利要求1所述ahyabby基因阳性转基因或基因编辑花生株系的特异性引物对，其特征在于，所述引物对为ah08yabby鉴定引物对或ah18yabby鉴定引物对；所述ah08yabby鉴定引物对的序列如seq id no.25和seq id no.26所示；所述ah18yabby鉴定引物对的序列如seq id no.27和seq id no.28所示。

9.权利要求4至8中任一项所述的引物对或引物组在花生分子标记辅助育种中的应用，其特征在于：利用所述引物对或引物组进行pcr扩增或kasp检测，鉴定花生中ah08yabby和/或ah18yabby基因的基因型，筛选荚果和/或籽粒性状优良的花生单株或株系。

10.一种培育荚果和/或籽粒增大的转基因花生品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：