一种用于原位捕获抗原和淋巴结靶向递送的阴离子脂质体的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物已用材料，具体涉及一种用于原位捕获抗原和淋巴结靶向递送的阴离子脂质体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、治疗性肿瘤疫苗已成为癌症治疗的一种重要手段。治疗性肿瘤疫苗是通过启动肿瘤抗原、抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，apcs）和细胞毒性t淋巴细胞（cytotoxic t cell，ctl）之间的免疫应答发挥抗肿瘤效果，包括基于树突状细胞的疫苗、mrna疫苗和个性化疫苗等。

2、同时，纳米载体在开发治疗性肿瘤疫苗方面具有巨大潜力。其中，脂质体是一类安全高效的药物递送载体，可以负载蛋白质、dna、mrna等疫苗组分。同时，据研究表明，脂质体一定的佐剂效应。免疫佐剂通过延长抗原的滞留时间、改善内化、激活模式识别受体（pattern recognition receptor，prr）等机制促进抗原提呈，从而增强免疫效果。

3、因此，本发明开发一种生物相容性好，且有良好的原位捕获抗原和淋巴结靶向递送效果，可用作治疗性肿瘤疫苗的递送载体。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种生物相容性好、具有良好的原位捕获抗原和淋巴结靶向递送效果的阴离子脂质体及其制备方法和应用。

2、本发明的第一方面，一种如式(i)所示的阴离子脂质化合物、其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，

3、      (i)

4、式中，r1和r2各自独立地为c10-20烷基；

5、r3为天冬氨酸残基、谷氨酸残基、酪氨酸残基、或丝氨酸残基。

6、在另一优选例中，所述r1和r2各自独立地为c14-18烷基。

7、在另一优选例中，所述r1和r2均为c14-18烷基。

8、在另一优选例中，所述阴离子脂质化合物选自下组：

9、、、、。

10、在另一优选例中，所述阴离子脂质化合物用于制备脂质组合物。

11、在另一优选例中，所述脂质组合物为药物递送载体。

12、在另一优选例中，所述药物递送载体为脂质纳米颗粒。

13、在另一优选例中，所述药物是小分子、核酸、蛋白质、或其组合。

14、在本发明第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的阴离子脂质化合物的方法，包括步骤：

15、(s1)在有机溶剂和碱性催化剂的存在下，3,4-二羟基苯甲醛和r1br/r2br进行反应，生成中间化合物a；

16、

17、(s2)在催化剂的存在下，中间化合物a与亚磷酸二甲酯和选自下组的氨基酸反应：天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、或丝氨酸，得到如本发明第一方面所述的阴离子脂质化合物；

18、其中，r1、r2的定义如本发明第一方面中所述。

19、在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述有机溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺。

20、在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述碱性催化剂选自下组：碳酸钾、碘化钾、或其组合。

21、在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述反应的温度为70-100℃，较佳地70-90℃，更佳地75-85℃，例如约80℃。

22、在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述反应的时间为8-16h，较佳地10-14h，例如约12h。

23、在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述反应的温度为70-100℃，较佳地70-90℃，更佳地75-85℃，例如约80℃。

24、在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述反应的时间为0.1-5h，较佳地0.3-3h，更佳地0.3-1h，例如约0.5h。

25、在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述催化剂包括高氯酸镁。

26、在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述3,4-二羟基苯甲醛和r1br/r2br的摩尔比为1-3：1-5，较佳地1：1-3，更佳地1：2；

27、在步骤(s2)中，中间化合物a与氨基酸的摩尔比为1-3：1-5，较佳地1-3：1-3，更佳地1：1-3，例如约1：1；

28、中间化合物a与亚磷酸二甲酯的摩尔比为1-3：1-5，较佳地1-3：1-3，更佳地1：1-3，例如约1：1。

29、在本发明第三方面，提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包括如本发明第一方面所述的阴离子脂质化合物。

30、在另一优选例中，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为80-220nm，较佳地90-150nm，更佳地120-150nm。

31、在另一优选例中，所述脂质纳米颗粒的平均zeta电位为-60~-10mv。

32、在另一优选例中，所述脂质纳米颗粒包括式(i)所示的阴离子脂质化合物、dmg-peg、cho-hp和dope。

33、在另一优选例中，所述脂质纳米颗粒还包括其他脂质；

34、其中，所述其他脂质选自下组：磷脂、固醇类脂质、peg类脂质、或其组合。

35、在另一优选例中，所述阴离子脂质化合物、dmg-peg、cho-hp和dope的摩尔比为5-55：1-40：1-40：5-55；较佳地5-50：1-10：30-40：9-54；更佳地5-50：1：40：9-54。

36、在另一优选例中，所述dmg-peg与cho-hp的摩尔比为1：40。

37、在另一优选例中，所述阴离子脂质化合物、dope的摩尔比为5-50：9-54。

38、在另一优选例中，所述脂质纳米颗粒通过以下步骤制备：

39、(1)将阴离子脂质化合物、dmg-peg、cho-hp和dope溶于有机溶剂中，超声，旋蒸，得到阴离子脂质体薄膜；

40、(2)向阴离子脂质体薄膜加入超纯水水化，搅拌，超声，得到所述脂质纳米颗粒。

41、在另一优选例中，在步骤(1)中，所述有机溶剂包括甲醇、三氯甲烷、或其混合溶液。

42、在另一优选例中，在步骤(1)中，通过在200-400mbar旋蒸5-15min去除有机溶剂，随后0mbar旋蒸5-15min，得到阴离子脂质体薄膜。

43、在另一优选例中，在步骤(2)中，所述搅拌在50-70℃下进行，较佳地55-65℃，更佳地60℃。

44、在另一优选例中，在步骤(2)中，所述超声的功率为250-350w，较佳地280-320w，例如约300w。

45、在另一优选例中，在步骤(2)中，所述超声的条件为超声25-35s，间隔25-35s，次数8-15次；较佳地超声28-32s，间隔28-32s，次数8-12次；更佳地超声30s，间隔30s，次数10次。

46、在本发明第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的阴离子脂质化合物、其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，或本发明第三方面所述的脂质纳米颗粒的用途，用于：

47、(1)包封治疗剂和/或预防剂；

48、(2)制备治疗剂和/或预防剂的体内递送系统；和/或

49、(3)治疗性肿瘤疫苗。

50、在本发明第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本发明第三方面所述的脂质纳米颗粒、包封于所述脂质纳米颗粒中的生物活性剂和药学上可接受的载体、辅料和赋形剂。

51、在本发明第六方面，提供了一种如本发明第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗炎症、感染性疾病、癌症、增生性疾病、遗传性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病的药物。

52、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。