一种二酮哌嗪二聚体化合物及其制备方法

本发明属于生物医药，具体地说，涉及来源于催吐萝芙木内生真菌次生代谢产物的二酮哌嗪二聚体化合物及其制备方法。

背景技术：

1、催吐萝芙木（

rauvolfia vomitoriaafzel.）为夹竹桃科萝芙木属植物，广泛分布于热带及亚热带地区，是我国传统医药中用于治疗高血压、精神紧张及感染性疾病的重要药用植物。萝芙木属植物是单萜吲哚类生物碱的重要天然来源，已分离出超过290个该类化合物，显示出抗阿尔茨海默病、抗氧化、抗炎、抗菌及血管舒张等多种药理活性。近年来，从催吐萝芙木中不断发现新结构单萜生物碱，部分化合物在与顺铂联用时对人卵巢癌细胞表现出显著的协同增殖抑制作用。因此，催吐萝芙木仍是挖掘活性天然产物的宝贵植物资源。

2、植物内生真菌能够产生结构多样且活性显著的次生代谢产物，已成为天然产物化学研究的热点领域。曲霉属（

aspergillus）真菌是一类分布广泛的子囊菌，已知菌种超过260种，因其丰富的次生代谢产物而备受关注，是发现新型生物活性分子的重要来源。研究表明，曲霉属真菌能产生聚酮、萜类、生物碱、二酮哌嗪二聚体、丁烯内酯等多种结构类型的化合物，其中许多具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒及农用杀菌等活性。然而，尽管曲霉属真菌在工业酶制剂生产（如黑曲霉、米曲霉）及次生代谢产物研究方面取得显著进展，但不同菌种间的化学研究深度差异较大。其中，

a. costaricensis 属于黑曲霉组，近年来因其强大的碳水化合物活性酶分泌能力而受到生物技术领域的关注，表现出高木聚糖酶和果胶酶活性，在植物生物质降解及农业废弃物资源化利用方面具有重要应用潜力。然而，目前关于

a. costaricensis 次生代谢产物的化学成分研究仍十分有限，仅有少数文献报道从其发酵产物中分离得到丁烯内酯、萘并吡喃酮等少数化合物，且相关活性研究主要集中于抗炎及抗弹性蛋白酶活性。该菌株在抗肿瘤、抗菌等其他药理活性方面的化学物质基础尚不明确，亟需系统深入的化学成分研究。

3、在微生物次生代谢产物研究中，大量微生物的生物合成基因簇在常规培养条件下处于沉默或低表达状态，导致已知化合物的重复分离率居高不下，新化合物发现效率降低。为克服这一瓶颈，osmac（one strain many compounds，单菌株多次级代谢产物）策略被广泛应用于调控微生物代谢途径。该策略通过改变培养基组成（如种类、卤盐添加）、培养条件（如固/液状态、ph值、温度）或采用共培养方式，能够有效激活沉默基因簇，显著增加单一菌株产生的次生代谢产物化学多样性。然而，目前尚未见将osmac策略系统应用于

a.

costaricensis 次生代谢产物挖掘的研究报道，该菌株在不同培养条件下的代谢潜力及其活性成分的化学本质仍有待揭示。

4、综上所述，现有技术中对于催吐萝芙木来源的内生真菌

a. costaricensis 的化学成分研究尚不系统，尤其是缺乏基于osmac策略对其代谢产物多样性及抗肿瘤活性进行的系统评价。因此，有必要提供一种从催吐萝芙木内生真菌

a. costaricensis 中制备次生代谢产物的方法，以丰富该菌株的化学成分库，并为开发新型抗肿瘤先导化合物提供物质基础和实验依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题对植物内生真菌

a. costaricensis的次生代谢产物制备的化合物进行体外抗肿瘤活性的初步筛选，提供一种二酮哌嗪二聚体化合物及其制备方法。

2、为了实现上述技术问题， 本发明的目的在于提供一种二酮哌嗪二聚体化合物

3、，所述化合物的结构式为式1或式2。

4、具体是按下述步骤制备的：

5、步骤1、准备阶段：取健康无病害的催吐萝芙木茎段，去除表面泥土与杂质，在超净工作台中，将茎段依次用75%乙醇浸泡30 s~1 min、2.5%次氯酸钠溶液浸泡2~5 min，再用无菌水漂洗3~4次，吸干表面水分，取最后一次漂洗的无菌水涂布于pda平板，于28 ℃培养3天，再将表面消毒后的茎段切成约0.5 cm的小块，置于pda平板上，于28℃恒温培养3~7天，待组织块边缘长出真菌菌丝后，挑取边缘新生菌丝转接至新鲜pda平板，经多次纯化获得单一菌落

a. costaricensis；

6、步骤2、

aspergillus costaricensis内生真菌发酵：在超净台中将已经活化的

a.

costaricensis接种于pda中，置于培养箱中培养3~5天，将大米培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌后，将

a.costaricensis菌株接种到大米培养基中，在28℃，60％rh条件下培养30~40天；

7、步骤3、

aspergillus costaricensis发酵物的提取与萃取：发酵后的大米培养基采用甲醇室温浸提3次，每次7天，合并提取液，过滤后减压浓缩，得到粗提取浸膏，将粗提物浸膏加温水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行分级萃取，静置后分层，将各个萃取相分别过滤并减压浓缩，得到相应极性部位的萃取物浸膏，称重；

8、步骤4、

aspergillus costaricensis发酵物的分离纯化：对

a.costaricensis乙酸乙酯部位进行分离，用100~200目柱层析硅胶拌样，正相常压色谱柱进行分离，以体积比8:1→1:5的石油醚-乙酸乙酯和体积比为20:1→6:1的二氯甲烷-甲醇对该样品进行梯度洗脱，将所得组分运用薄层色谱法将相同组分进行合并，得到9个组分fr.1~fr.9；

9、对组分fr.9用反相硅胶柱层析进一步分离，以体积比20%→90%甲醇-水进行梯度洗脱，得到9个组分fr.9-1~fr.9-9；

10、其中将fr.9-5经200~300目正相硅胶柱层析进行进一步分离，以体积比为80:1→15:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂对该组分进行洗脱，得到6个组分fr.9-5-1~fr.9-5-6，再将fr.9-5-5经正相硅胶柱分离，lh-20凝胶柱进一步纯化得到组分fr.9-5-5-1和fr.9-5-5-2，将fr.9-5-5-1通过半制备hplc进一步纯化，流动相条件为meoh-h2o，65:35，2 ml/min，v/v，得到化合物1；

11、fr.9-6经200~300目正相硅胶柱层析进行进一步分离，以二氯甲烷-甲醇80:1→20:1为洗脱剂对该组分进行洗脱，得到6个组分fr.9-6-1~fr.9-6-6，fr.9-6-5经正相硅胶柱分离，lh-20凝胶柱进一步纯化得到组分fr.9-6-5-1，fr.9-6-5-1通过半制备hplc进一步纯化，流动相条件为meoh-h2o，65:35，2 ml/min，v/v，得到化合物2。

12、进一步的步骤2中大米培养基的包括：200 g大米，1 g蛋白胨，1 g酵母提取物，1 g谷氨酸钠，4％海盐，250 ml水置且121℃高压锅灭菌20 min。

13、本发明具有以下有益效果：本发明基于osmac策略，对催吐萝芙木内生真菌曲霉属真菌

a. costaricensis进行规模发酵，得到丰富的次级代谢产物，经提取分离纯化并鉴定得到了2个新的二酮哌嗪二聚体二聚体。其中，化合物1和化合物2均为首次从曲霉属中分离得到，可知在含卤盐的培养基条件下，菌株能够产生结构丰富且多样的次级代谢产物。

14、从化学分类学角度来看，本发明所分离的二酮哌嗪二聚体类为曲霉属真菌的特征性代谢产物类型。化合物1和化合物2中新颖的二聚体连接模式（c–c键与c–n键），进一步拓展了曲霉属特征性次级代谢产物的结构多样性。

15、本发明不仅丰富了曲霉属真菌的次级代谢产物，拓展了pestalazine类二酮哌嗪二聚体化合物的结构多样性，同时初步揭示了部分化合物的抗肿瘤活性潜力，为后续深入开展活性评价、作用机制及构效关系研究奠定了物质基础与实验依据。