一种AAV衣壳蛋白及其应用

本发明属于基因治疗载体工程与生物医药，具体涉及一种aav衣壳蛋白及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒（adeno-associated virus, aav）因免疫原性低、宿主基因组整合风险低、可在多种组织中介导治疗基因长期稳定表达等特性，已成为当前基因治疗领域公认安全性与有效性最突出的递送载体之一，且已在眼科疾病领域展现出临床转化潜力。

2、眼部是基因治疗的理想靶器官：多种致盲性视网膜疾病（如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、leber先天性黑蒙症等）具有明确的遗传背景与病理机制，同时眼部具备免疫赦免特性，大幅降低了基因治疗的免疫风险。

3、目前aav载体的眼部递送主要采用视网膜下注射与玻璃体腔注射两种途径。其中视网膜下注射可高效转导视网膜色素上皮细胞与感光细胞，但手术侵入性强、操作难度高，易引发视网膜脱离、黄斑损伤等并发症，且仅能实现局部视网膜转导，难以覆盖弥漫性视网膜病变的治疗需求。相比之下，玻璃体腔注射操作简便、手术创伤与风险更低，可实现全视网膜范围的药物暴露，是更具临床普及性的给药方式。然而野生型aav血清型（如aav2、aav5、aav8、aav9）经玻璃体腔给药后，视网膜穿透与深层细胞转导效率普遍不足：视网膜内界膜（internal limiting membrane，ilm）、玻璃体网状结构与细胞外基质构成多重物理屏障，同时病毒颗粒易与视网膜表层的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等成分发生非特异性结合，阻碍病毒穿透至外核层感光细胞与 rpe 细胞。例如野生型aav2（wild-type aav2,wtaav2）经玻璃体腔注射后，仅能有效转导视网膜神经节细胞，对视锥、视杆细胞及rpe细胞的转导效率极低，无法满足多数视网膜退行性疾病的治疗需求。

4、为解决这一问题，研究者致力于通过工程化改造aav衣壳蛋白赋予其新的组织嗜性和穿透能力。aav载体的组织亲嗜性及转导效率主要由其衣壳蛋白决定。通过对aav衣壳进行dna混编、易错pcr或定点突变，尤其是对衣壳表面暴露的可变区（variable region,vr）进行多肽插入或置换，可筛选出具有新功能的衣壳变体。例如，通过对aav2衣壳表面关键酪氨酸残基进行定点突变，阻断病毒颗粒进入细胞后的泛素化降解通路，可显著提升玻璃体腔给药后视网膜神经节细胞及感光细胞的转导效率；另有研究通过构建aav2衣壳可变区的随机多肽展示文库，结合体外视网膜组织筛选获得靶向变体，一定程度上增强了病毒穿透视网膜屏障的能力。此外，对aav2衣壳中负责硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的关键氨基酸残基进行突变，可显著改变病毒的组织嗜性，减少其在视网膜表层的非特异性截留。这些研究表明，衣壳工程化改造是优化 aav 载体眼部递送效率的有效策略。

5、因此，提供一种经工程化改造的aav2衣壳蛋白变体，使其能够突破玻璃体腔给药的生理屏障，兼具强视网膜穿透能力与高深层细胞转导效率，对解决眼科基因治疗载体递送效率不足的问题具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中野生型腺相关病毒经玻璃体腔给药后视网膜穿透能力弱、深层视网膜细胞转导效率低，且现有衣壳难以有效突破玻璃体给药生理屏障的缺陷，提供一种aav衣壳蛋白及其应用，具体包括具有优异视网膜穿透能力与靶细胞转导效率的aav衣壳蛋白变体，以及编码该变体的核酸分子、包含该变体的重组aav载体、药物组合物，以及上述产品在制备眼部疾病基因治疗药物中的应用。

2、本发明通过构建大容量aav衣壳突变文库并进行体内定向筛选，获得性能更优异的全新衣壳变体。建立基于玻璃体腔给药的体内筛选体系，直接在活体视网膜屏障环境下完成衣壳文库的富集与筛选，获得具有更强视网膜穿透能力、更高深层细胞转导效率的aav衣壳变体，在推动眼科基因治疗载体的临床转化方面具有重要的科学意义与应用价值。

3、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

4、本发明提供一种aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白为aav2突变体，以野生型aav2衣壳蛋白vp1为骨架，将野生型aav2衣壳蛋白第581至592位氨基酸替换为 seq id no.1所示的短肽。

5、进一步地，所述短肽替换位于aav2衣壳蛋白的vr viii 可变区内。

6、本发明还提供一种编码上述aav衣壳蛋白的核酸分子，所述核酸分子中编码替换短肽的核苷酸序列如 seq id no.2所示。

7、本发明还提供一种表达载体，包括上述的核酸分子。

8、本发明还提供一种宿主细胞，包括上述的核酸分子或表达载体。

9、本发明还提供一种重组腺相关病毒，所述载体包含上述aav衣壳蛋白。

10、进一步地，所述重组腺相关病毒还包含编码治疗性基因产物的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸的侧翼设有至少一个aav反向末端重复序列；所述治疗性基因产物包括治疗性蛋白质、sirna、shrna、mirna或反义寡核苷酸。

11、本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述重组腺相关病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

12、本发明还提供上述aav衣壳蛋白变体、核酸分子、表达载体、宿主细胞或重组腺相关病毒在制备将基因产物递送至眼部的药物中的应用。

13、本发明还提供一种病毒颗粒，包括上述的aav衣壳蛋白。

14、本发明的有益效果是：

15、（1）视网膜穿透能力显著提升，转导范围广泛

16、本发明的aav衣壳变体经玻璃体腔给药后，能够有效突破视网膜内界膜等物理屏障，从视网膜浅层扩散至内核层及外核层，实现从中心区域到周边区域的全视网膜广泛分布，克服了野生型aav2玻璃体给药仅能转导神经节细胞等浅层细胞、且转导范围局限的缺陷。

17、（2）靶细胞转导效率显著增强

18、与野生型aav2相比，本发明变体对感光细胞等视网膜深层治疗靶细胞的转导效率显著提升，为黄斑变性、视网膜色素变性等致盲性眼病的基因治疗提供了更具临床潜力的载体工具。

19、（3）微创给药适配性好

20、本发明提供的变体适用于制备微创的玻璃体腔注射给药的药物，可降低视网膜脱离等手术并发症风险，同时可实现全视网膜药物覆盖，适用于弥漫性视网膜病变的治疗，具有良好的临床可及性。

21、（4）可规模化制备

22、本发明所提供的衣壳变体保留了aav2正常的包装能力和物理稳定性，可通过常规aav生产工艺规模化制备，具备良好的临床转化潜力。

1.一种aav衣壳蛋白，其特征在于，所述aav衣壳蛋白为aav2突变体，将野生型aav2衣壳蛋白的第581至592位氨基酸替换为氨基酸序列如seq id no.1所示的短肽，所述野生型aav2衣壳蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

2.一种编码权利要求1所述aav衣壳蛋白的核酸分子。

3.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达载体。

5.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求1所述的aav衣壳蛋白。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求5所述的重组腺相关病毒以及药学上可接受的载体或赋形剂。

7.根据权利要求4所述的宿主细胞、权利要求5所述的重组腺相关病毒以及权利要求6所述的药物组合物在制备将基因产物递送至眼部的药物中的应用。

8.一种病毒颗粒，其特征在于，包括权利要求1所述的aav衣壳蛋白。