RALB蛋白作为药物靶点在制备和治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用

本发明属于医药，具体涉及ralb蛋白作为药物靶点在制备和治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术：

1、心肌梗死是心血管疾病死亡的主要原因。目前临床最有效的治疗是尽早恢复缺血心肌的血流灌注，手段包括溶栓、pci介入等，但血流恢复本身会诱发心肌缺血/再灌注（i/r），造成心肌细胞凋亡、梗死面积扩大，严重影响患者预后。目前临床上尚无专门针对心肌i/r损伤的有效药物。因此，寻找在再灌注过程中能主动对抗细胞凋亡和氧化应激的内源性保护靶点，是心血管药物研发的前沿热点。

2、目前该研究领域存在两大核心技术瓶颈与研究空白。一方面，学界对于心肌缺血/再灌注损伤进程中发挥内源性保护作用的关键蛋白、调控靶点认知十分有限，诸多潜在的保护性基因与分子机制尚未被发掘。另一方面，临床可用于干预miri 的新型靶点储备严重不足，极大制约了靶向基因治疗与创新小分子药物的研发进程。

3、牛磺酸（taurine）是一种广泛分布于心肌组织中的内源性氨基酸，既往研究显示其具有抗炎、抗氧化及维持线粒体功能等生物学效应，在心肌缺血损伤模型中表现出一定的保护作用。然而，现有技术存在明显缺陷：牛磺酸的作用靶点始终未被阐明。由于不清楚牛磺酸究竟通过与哪个蛋白直接结合来发挥其心肌保护效应，研究者无法基于其作用机制进行药物结构优化或靶向衍生物开发，严重制约了其临床转化。

4、ralb（ras like proto-oncogene b；gene id：116546；mrna转录本：nm_053821.2；refseq蛋白：np_446273.1）隶属于ras超家族，与rala（ras like proto-oncogene a）高度同源。值得注意的是，rala已被报道在心肌保护中发挥重要作用，提示ral家族蛋白可能具有心脏保护功能的共性特征。然而，与rala形成鲜明对比的是，ralb的现有研究几乎全部聚焦于肿瘤领域，主要探究其调控胰腺癌、膀胱癌细胞迁移与侵袭的分子机制；该基因在心血管系统中的生理及病理功能尚未得到任何系统研究。迄今为止，尚无研究报道ralb参与调控心肌细胞存活，亦无研究阐明其在心肌缺血、缺血再灌注损伤病理进程中的作用。更未有研究揭示牛磺酸是否通过靶向ralb发挥其心肌保护效应。

5、鉴于rala已被证实具有心肌保护功能，而高度同源的ralb在心脏领域的研究却完全空白，且牛磺酸的心脏保护靶点尚不明确。因此，本发明首次将ralb引入心肌缺血再灌注损伤的研究视野，系统探究其在心脏损伤中的潜在保护作用及其作为牛磺酸下游靶点的可能性。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种全新心肌缺血保护靶点及其应用：首次阐明ralb蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的表达规律，证实调控ralb蛋白（尤其是过表达ralb蛋白）可显著减轻该损伤，并首次提出以ralb为靶点筛选、制备治疗心肌缺血再灌注损伤的靶向药物。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了过表达ralb蛋白的试剂在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，所述ralb蛋白的氨基酸序列如seq id no. 2所示。

4、优选地，所述过表达ralb蛋白的试剂包括携带ralb编码基因的重组腺病毒；所述ralb编码基因的cds序列如seq id no. 1所示。

5、更优选地，所述过表达ralb蛋白的试剂还包括携带ralb编码基因的重组腺相关病毒、慢病毒、表达质粒、脂质体纳米递送载体中的任一种或多种。

6、优选地，所述过表达ralb蛋白的试剂通过上调ralb蛋白表达，同时抑制心肌细胞凋亡，进而实现心肌保护效果；所述抑制心肌细胞凋亡表现为上调抗凋亡蛋白bcl-2、下调促凋亡蛋白bax，提升bcl-2/bax比值。

7、优选地，所述药物为注射制剂，包括心肌原位注射用病毒制剂、冻干粉针、注射液。

8、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

9、更优选地，所述辅料包括润湿剂、溶剂、赋形剂、稳定剂、缓冲盐、冻干保护剂、渗透压调节剂中的一种或多种。其中，润湿剂用于降低溶液表面张力，促进病毒、质粒粉末快速复溶分散；溶剂作为液相介质溶解过表达ralb的各类活性载体；赋形剂为冻干粉提供骨架支撑，避免冻干制剂塌陷失活；稳定剂可保护病毒、核酸及脂质体结构稳定，延长活性保存时间；缓冲盐稳定药液ph，减少注射时心肌局部刺激并防止载体降解；冻干保护剂、渗透压调节剂分别用于低温冻干过程防护活性成分、调节药液渗透压适配心肌组织生理环境，上述辅料可单独或复配用于制备本发明注射类药物。

10、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

11、本发明借助蛋白质组热稳定性分析（thermal proteome profiling, tpp） 联合液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）技术，成功鉴定出牛磺酸在心肌细胞内的直接结合靶蛋白ralb。进一步证实，牛磺酸的心肌保护效应依赖于ralb蛋白，敲低ralb可抵消牛磺酸的心肌保护作用，且单独过表达ralb即可发挥心肌的保护效果。本研究首次系统阐释了ralb蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的表达特征，证实调控ralb蛋白表达，尤其是过表达ralb，能够显著改善心肌缺血再灌注损伤，并首次提出以ralb为核心靶点，筛选、制备用于干预心肌缺血再灌注损伤的靶向治疗药物。相较于现有广谱干预手段，本发明将心肌损伤干预策略由广谱多效的牛磺酸补充治疗，升级为精准靶向ralb的基因干预或特异性激动剂开发方案，明确了牛磺酸发挥心肌保护作用的分子机制，解决了现有技术作用靶点模糊、机制尚不明确的技术瓶颈，为研发高效、低毒副作用的心肌缺血再灌注损伤靶向药物提供了明确且可靠的蛋白靶点，具备重要的基础研究价值与临床转化前景。

1.过表达ralb蛋白的试剂在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述ralb蛋白的氨基酸序列如seq id no. 2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达ralb蛋白的试剂包括携带ralb编码基因的重组腺病毒；所述ralb编码基因的cds序列如seq id no. 1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述过表达ralb蛋白的试剂还包括携带ralb编码基因的重组腺相关病毒、慢病毒、表达质粒、脂质体纳米递送载体中的任一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达ralb蛋白的试剂通过上调ralb蛋白表达，同时抑制心肌细胞凋亡，进而实现心肌保护效果；所述抑制心肌细胞凋亡表现为上调抗凋亡蛋白bcl-2、下调促凋亡蛋白bax，提升bcl-2/bax比值。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为注射制剂，包括心肌原位注射用病毒制剂、冻干粉针、注射液。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括润湿剂、溶剂、赋形剂、稳定剂、缓冲盐、冻干保护剂、渗透压调节剂中的一种或多种。