一种丝素蛋白基ROS响应性可注射水凝胶及其在骨缺损修复中的应用

本发明属于生物医用材料，尤其涉及一种丝素蛋白基ros响应性可注射水凝胶制备方法及其在骨缺损修复中的应用。

背景技术：

1、组织损伤修复与再生是生物医学领域的重要研究方向。近年来，随着组织工程和再生医学的发展，水凝胶材料因具有高含水量、类似天然细胞外基质的三维网络结构以及良好的细胞相容性，被广泛应用于组织修复、药物递送和微环境调控等领域。目前，基于天然高分子、合成高分子及复合材料构建的水凝胶体系已成为组织修复的重要材料平台。

2、现有水凝胶材料主要通过物理交联、化学交联或光诱导交联等方式形成稳定网络结构。其中，传统物理交联水凝胶通常存在力学性能不足、结构稳定性较差及功能调控能力有限等问题；部分化学交联水凝胶依赖外源交联剂、光照或其他刺激条件实现成胶，不仅制备过程复杂，而且可能存在交联剂残留、细胞毒性以及组织适应性不足等问题。此外，多数现有水凝胶主要发挥填充支撑或细胞承载作用，缺乏对损伤组织局部复杂微环境的主动响应和调控能力，难以满足慢性炎症、氧化应激等病理状态下组织修复的需求。

3、在多种组织损伤和疾病状态下，局部微环境异常是影响组织再生的重要因素。其中，活性氧（reactive oxygen species，ros）水平升高、持续氧化应激以及免疫稳态失衡被认为是导致细胞功能受损和组织修复障碍的重要原因。因此，开发能够感知病理微环境变化，并实现主动调控的新型智能水凝胶材料，对于提高组织修复效率具有重要意义。目前已有部分ros响应性水凝胶被报道，但其通常依赖复杂的合成体系，存在响应效率有限、生物相容性不足、功能单一或需要额外外源刺激触发等问题，限制了其进一步应用。

4、丝素蛋白（silk fibroin，sf）作为一种天然生物高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性和优异的力学性能，在组织工程领域具有广泛应用前景。然而，天然丝素蛋白缺乏主动响应病理微环境的能力，需要通过功能化改性赋予其更多生物学功能。因此，如何基于丝素蛋白构建一种具有快速成胶能力、良好生物安全性以及智能微环境响应功能的多功能水凝胶体系，仍是当前组织修复领域亟需解决的问题。

5、综上所述，尽管已有多种水凝胶体系被报道用于骨缺损修复，但现有材料普遍存在成胶条件苛刻、缺乏病理微环境响应能力、生物相容性不足或功能单一等缺陷。因此，本领域目前仍缺乏一种兼具快速原位成胶能力、内源性ros响应降解特性、抗氧化应激、免疫微环境调控及促成骨活性等多重功能于一体的可注射水凝胶材料。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述问题，本发明提出一种丝素蛋白基ros响应性多功能可注射水凝胶体系。本发明通过对丝素蛋白进行巯基化改性，利用巯基化丝素蛋白（sf-sh）与8-arm peg-mal之间快速、高选择性的巯基-马来酰亚胺生物正交反应，构建无需光照、加热或其他外源刺激即可原位形成的三维交联水凝胶网络。同时，通过引入具有ros响应特性的硫醚键结构，使材料能够响应组织微环境中的内源性ros变化，实现智能降解和功能调控；进一步结合天然多酚类功能组分及生物活性无机组分，赋予水凝胶抗氧化、免疫微环境调节以及促进组织再生等多重功能。

2、本发明所构建的新型水凝胶体系解决了现有组织修复材料中存在的成胶条件苛刻、生物相容性不足、缺乏病理微环境响应能力以及功能单一等技术问题，为开发具有智能响应、多功能调控和广泛组织修复应用潜力的新型生物材料提供了一种有效技术方案。

3、为实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

4、本发明目的之一是提供一种丝素蛋白基ros响应性可注射水凝胶，所述水凝胶由巯基化丝素蛋白与八臂聚乙二醇马来酰亚胺通过巯基-马来酰亚胺反应交联形成三维网络结构，所述水凝胶中还分散有单宁酸和纳米羟基磷灰石。

5、进一步的，所述巯基化丝素蛋白由丝素蛋白经酰胺化反应接枝胱胺后，再经还原反应获得；所述三维网络结构中包含由所述巯基与所述八臂聚乙二醇马来酰亚胺的马来酰亚胺基团反应生成的硫醚键。

6、进一步的，所述巯基化丝素蛋白的质量浓度为18%~22%，所述八臂聚乙二醇马来酰亚胺的质量浓度为13%~17%，所述单宁酸的质量浓度为1.5%~2.5%，所述纳米羟基磷灰石的质量浓度为2.5%~3.5%。

7、进一步的，所述单宁酸与所述纳米羟基磷灰石的质量比为1:1~1:2。

8、进一步的，所述水凝胶具有相互连通的三维多孔网络结构，所述纳米羟基磷灰石在所述水凝胶中呈均匀分散状态。

9、本发明目的之二是提供所述丝素蛋白基ros响应性可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

10、（1）对丝素蛋白进行巯基化改性，获得巯基化丝素蛋白；

11、（2）将单宁酸与纳米羟基磷灰石在溶液中混合，经持续分散处理使两者充分复合，获得复合功能组分；

12、（3）将所述巯基化丝素蛋白与所述复合功能组分混合，获得预混液；

13、（4）将所述预混液与八臂聚乙二醇马来酰亚胺溶液混合，经巯基-马来酰亚胺反应交联，获得所述水凝胶。

14、进一步的，步骤（1）中所述巯基化改性具体包括：将丝素蛋白溶于缓冲液中，在缩合剂存在下进行羧基活化，加入胱胺进行酰胺化反应，得到胱胺修饰的丝素蛋白；再经还原剂还原胱胺中的二硫键，得到巯基化丝素蛋白。

15、进一步的，所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，所述还原剂为二硫苏糖醇；所述酰胺化反应在室温条件下进行24~72小时；所述还原反应的时间为4~8小时。

16、进一步的，步骤（2）中所述持续分散处理为涡旋分散；步骤（4）中所述交联反应在无外源刺激条件下原位进行。

17、本发明目的之三是提供所述水凝胶或由所述制备方法制得的水凝胶在制备用于骨缺损修复的医疗器械或药物中的应用。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、（1）构建了一种无需外源刺激、生物相容性优异，基于生物正交反应的新型丝素蛋白基可注射水凝胶体系，具备良好的的可注射性能，能够贴合不规则区域。

20、相较于现有水凝胶材料通常依赖光照、温度变化、化学引发剂或其他外源刺激实现交联成胶，本发明通过生物正交化学策略构建丝素蛋白基三维交联网络，在温和条件下即可实现快速成胶，无需额外引入刺激条件或潜在有害交联试剂，降低了材料制备及应用过程中对细胞和组织的不利影响。同时，该水凝胶以天然丝素蛋白为主要基质，具有良好的生物相容性，且其降解过程主要产生具有良好生物安全性的降解产物，不易引起明显的炎症反应或组织毒性。相比现有部分合成高分子水凝胶存在交联剂残留、降解产物刺激性以及生物相容性不足等问题，本发明构建的水凝胶体系兼具可注射性、稳定性和生物安全性，为组织修复及再生应用提供了一种更加安全有效的材料平台。

21、上述技术效果基于以下机制：丝素蛋白功能化改性及生物正交交联策略，无外源刺激条件下的原位成胶设计，前驱液可以直接注射到缺损区域，快速成胶，并且天然生物高分子基材赋予的良好生物相容性。

22、（2）具有内源ros响应性降解特征，可实现材料与病理微环境的智能匹配。

23、相较于现有水凝胶材料通常依赖被动水解降解或缺乏对局部微环境变化响应的特点，本发明通过在水凝胶网络中引入具有ros敏感性的硫醚键结构，使所构建的水凝胶能够感知组织微环境中活性氧水平变化，并在ros升高条件下发生氧化响应，实现网络结构调控和智能降解。该ros响应过程无需额外光、热、电等外源刺激，仅依赖组织内源性氧化应激信号即可触发，使材料降解行为与病理微环境变化相匹配，有利于维持适宜的组织修复空间并促进后续组织再生过程。

24、上述技术效果基于以下机制：硫醚键引入赋予水凝胶ros敏感响应特性；ros诱导硫醚键氧化断裂实现响应性网络降解；内源性病理信号驱动智能调控机制。

25、3）具有多功能微环境调控能力，可实现氧化应激缓解、免疫调节及骨组织再生协同促进。

26、本发明构建的丝素蛋白基ros响应性多功能可注射水凝胶，通过引入天然多酚功能组分及生物活性无机组分，赋予材料优异的抗氧化、免疫调节及组织再生能力。该水凝胶可有效清除局部过量ros，缓解氧化应激损伤，改善炎症微环境，促进巨噬细胞向修复相关表型转变，同时通过调控细胞行为促进血管生成和成骨分化，从而实现对复杂病理微环境的多维度调控。相比现有功能单一的组织修复材料，本发明通过ros响应网络、ta多功能调节作用及nha骨诱导作用的协同结合，实现了氧化应激调控、免疫稳态恢复及组织再生促进的一体化功能，显著拓展了其在组织修复领域的应用潜力。

27、上述技术效果基于以下机制：丝素蛋白基ros响应网络实现病理微环境感知与调控；ta多酚结构赋予抗氧化及免疫微环境调节功能；nha提供生物活性及组织矿化诱导作用。