一种酸代谢调控型双模磁共振纳米探针、制备方法及应用

本发明属于生物医药及磁共振成像，具体涉及一种酸代谢调控型双模磁共振纳米探针、制备方法及应用。

背景技术：

1、肝纤维化（liver fibrosis）是慢性肝损伤过程中细胞外基质异常、进行性沉积形成的病理过程，是多种慢性肝病进一步发展为肝硬化乃至肝细胞癌的重要阶段。早期肝纤维化具有一定可逆性，因此，实现肝纤维化的早期、精准和无创检测，对于及时干预肝纤维化进展具有重要意义。

2、目前，肝穿刺活检是肝纤维化评价的重要手段之一，但其属于侵入性检查，存在操作风险、取样局限以及重复检测受限等问题。磁共振成像（mri）具有软组织分辨率高及无电离辐射等特点，能够用于肝脏结构和功能成像。然而，在早、中期肝纤维化阶段，病变范围和胶原沉积程度相对有限，肝脏宏观结构、硬度和常规影像学信号改变并不显著，常规t1、t2加权mri对早期纤维化病灶与正常肝组织的区分能力仍然有限。

3、相较于单一模式磁共振造影，t1-t2双模磁共振探针能够利用两种成像信号进行互补，有利于提高病灶与正常组织之间的成像对比度和检测可靠性。然而，双模mri探针仍面临不同磁性造影组分之间相互干扰、早期病理微环境对探针激活程度有限以及探针在纤维化病灶中的有效富集不足等问题。

4、肝星状细胞（hepatic stellate cells，hscs）的活化是肝纤维化发生发展的重要细胞学过程。hscs活化后可高表达血小板衍生生长因子受体β（pdgfrβ），该分子改变可作为活化肝星状细胞（activated hepatic stellate cells，ahscs）的识别靶点。因此，通过靶向pdgfrβ提高磁共振探针在ahscs中的富集，可为提高肝纤维化成像特异性提供技术基础。

5、此外，如果仅依赖肝纤维化病灶本身相对有限的酸性或氧化微环境实现响应型造影剂激活，特别是在纤维化早期，可能难以获得足够的信号放大效果。因此，有必要构建一种兼具活化肝星状细胞靶向、t1-t2双模微环境响应以及胞内酸代谢调控能力的磁共振纳米探针，使靶向富集、微环境响应和信号增强能够在同一体系内配合发挥作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种酸代谢调控型双模磁共振纳米探针、其制备方法及应用，以解决现有肝纤维化mri成像中探针病灶富集不足、早期信号较弱以及双模造影信号有效激活程度有限的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种酸代谢调控型双模磁共振纳米探针。

4、纳米探针包括由fe3o4与mns形成的复合材料、血小板衍生生长因子肽ppb以及质子泵抑制剂。

5、具体的，本发明所示使用的质子泵抑制剂为泮托拉唑钠c16h14f2n3nao4s·1.5h2o（ppi）。

6、具体的，本发明所使用的ppb为市售成品，名称为ppb(csrnlidc) 环肽。公司为西安瑞禧。

7、其中，ppb经sh-peg连接单元修饰于fe3o4与mns形成的复合材料上；ppi负载于经ppb修饰后的复合材料上，从而形成fe3o4@mns-ppb-ppi复合纳米探针，简称fmpp。

8、ppb能够靶向活化肝星状细胞相关的pdgfrβ，使纳米探针在活化肝星状细胞中富集。

9、mns具有酸性和/或h2o2环境响应性能，在相应环境中发生响应并释放mn2+；所释放的mn2+用于增强t1磁共振成像信号，fe3o4用于提供t2磁共振造影功能。

10、ppi能够影响v-atpase相关质子转运，提高活化肝星状细胞的胞内酸化程度。胞内酸性增强进一步促进mns响应和mn2+释放，从而提高探针的磁共振响应程度。

11、优选地，纳米探针通过sh-peg-nhs与ppb反应获得sh-peg-ppb中间体，再利用sh-peg-ppb中间体对fe3o4与mns形成的复合材料进行修饰，随后负载ppi获得；所制备fmpp呈花状结构，平均粒径约为60 nm。

12、第二方面，本发明提供一种酸代谢调控型双模磁共振纳米探针的制备方法，包括如下步骤：

13、s1、获得fe3o4纳米颗粒；

14、s2、使锰源、硫源及fe3o4纳米颗粒在醇溶剂体系中反应，以在fe3o4纳米颗粒上形成mns组分得到复合材料；

15、s3、通过连接剂将能够靶向活化肝星状细胞的靶向肽连接于复合材料，得到靶向肽修饰的复合材料；

16、s4、将质子泵抑制剂负载于靶向肽修饰的复合材料，得到酸代谢调控型双模磁共振纳米探针。

17、优选地，s1中，使铁源在多元醇溶剂体系中与聚乙烯亚胺和三乙醇胺反应生成fe3o4。

18、进一步优选地，s1中，多元醇溶剂体系包括乙二醇和一缩二乙二醇。

19、优选地，铁源为乙酰丙酮铁。

20、优选地，s2中，反应在络合剂的存在下进行，络合剂包括柠檬酸盐和醇胺类化合物。

21、优选地，柠檬酸盐为柠檬酸三钠，醇胺类化合物为三乙醇胺。

22、优选地，锰源为乙酰丙酮锰；硫源为硫代乙酰胺。

23、优选地，连接剂为sh-peg-nhs；靶向肽为血小板衍生生长因子肽ppb。

24、在一个优选实施例中，本发明提供的制备方法包括如下步骤：

25、制备方法包括如下步骤：

26、s1、将乙酰丙酮铁溶解于乙二醇和一缩二乙二醇组成的混合溶剂中，加入聚乙烯亚胺和三乙醇胺，搅拌后进行溶剂热反应，对反应产物进行分离和洗涤，得到fe3o4纳米颗粒；

27、s2、将乙酰丙酮锰和柠檬酸三钠加入乙二醇中进行混合，加入硫代乙酰胺和三乙醇胺，再加入s1所得fe3o4纳米颗粒，进行溶剂热反应，对反应产物进行分离和洗涤，得到由fe3o4与mns形成的复合材料，简称fm；

28、s3、将sh-peg-nhs与ppb反应形成sh-peg-ppb中间体，再将sh-peg-ppb中间体与s2所得fm混合反应，得到ppb修饰的复合材料，简称fm-ppb或fmp；

29、s4、将s3所得fm-ppb与ppi混合反应，反应结束后除去未结合的游离ppi，得到fe3o4@mns-ppb-ppi复合纳米探针fmpp。

30、优选地，s1中，乙酰丙酮铁、乙二醇和一缩二乙二醇的用量分别为1.0～1.5 g、5～7.5 ml和45～67.5 ml，聚乙烯亚胺和三乙醇胺的加入量分别为1.0～1.5 g和3～4.5 ml；乙酰丙酮铁于80 ℃搅拌30 min，加入聚乙烯亚胺和三乙醇胺后继续搅拌30 min，随后于200 ℃进行溶剂热反应24 h；反应产物采用无水乙醇洗涤3次，并将所得fe3o4纳米颗粒分散于无水乙醇中，于4 ℃保存。

31、优选地，s2中，乙酰丙酮锰和柠檬酸三钠的用量分别为0.6-0.9 mmol和0.2～0.3mmol，乙二醇用量为15～22.5 ml，硫代乙酰胺以0.05 m乙二醇溶液形式加入且用量为15～22.5 ml，三乙醇胺加入量为0.5～0.75 ml，fe3o4纳米颗粒加入量为25～37.5 mg；乙酰丙酮锰和柠檬酸三钠以800～1000 rpm搅拌120～180 min，加入硫代乙酰胺和三乙醇胺后以800～1000 rpm搅拌5～10 min，再加入fe3o4纳米颗粒于室温搅拌20～30 min，随后于200 ℃进行溶剂热反应24 h，所得产物经离心结合磁性吸附收集并采用无水乙醇洗涤3次；s3中，将2～3 mg sh-peg-nhs和0.2～0.3 mg ppb加入2 ml去离子水中反应0.5～1 h，所得sh-peg-ppb中间体与1～1.5 mg分散于1～1.5 ml去离子水中的fm在冰浴、避光条件下反应2～3 h；s4中，将1～1.5 mg所得fm-ppb与1～1.5 mg ppi在冰浴、避光条件下搅拌0.5-1 h，并经3次离心洗涤除去未结合的游离ppi。

32、第三方面，本发明提供上述酸代谢调控型双模磁共振纳米探针的应用。

33、本发明提供fe3o4@mns-ppb-ppi复合纳米探针在制备用于肝纤维化t1-t2双模磁共振成像的造影剂中的应用。

34、复合纳米探针可通过ppb靶向活化肝星状细胞，并利用酸性和/或h2o2微环境促进mns响应；同时，ppi通过提高活化肝星状细胞的胞内酸化程度进一步促进mns响应和mn2+释放，从而提高t1-t2双模磁共振成像信号。

35、造影剂能够获得不同程度肝纤维化对应的t1和t2加权磁共振成像信号，可用于肝纤维化程度的成像评价或分级辅助。

36、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

37、1.本发明将fe3o4和环境响应型mns形成复合纳米材料。mns在酸性和/或h2o2环境中响应并释放mn2+，用于增强t1磁共振信号，同时fe3o4提供t2磁共振造影功能，从而实现t1-t2双模磁共振成像。

38、2.本发明在复合材料上引入ppb，通过ppb对活化肝星状细胞相关pdgfrβ的识别，提高探针在肝纤维化相关细胞中的靶向富集，有利于提高病灶成像的特异性。

39、3.本发明在ppb修饰的复合材料上进一步负载ppi，利用ppi对v-atpase相关质子转运的影响提高活化肝星状细胞内酸化程度，并进一步促进mns响应和mn2+释放，从而提高mri信号响应程度。

40、4.本发明将主动靶向、环境响应和胞内酸代谢调控结合于同一纳米探针体系。实验结果显示，fmpp具有ph/h2o2响应型t1-t2磁共振性能，并能够在不同程度肝纤维化动物模型中产生随纤维化程度变化的磁共振信号。