一种钙化软骨诱导型DNA-海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法与应用

本发明属于生物医用材料，涉及一种钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、关节软骨损伤是骨关节炎及创伤后关节退变的重要病理基础。由于关节软骨缺乏血管、神经和淋巴组织，软骨细胞数量有限且代谢活性较低，损伤后难以实现自发修复。现有临床治疗方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植和骨软骨移植等，但仍存在修复组织质量不佳、纤维软骨形成、供区损伤、供体来源有限和长期力学稳定性不足等问题。

2、天然关节软骨并非单一均质组织，而是具有明显的分层结构。其表层主要为透明软骨层，富含ii型胶原和aggrecan，主要承担润滑、缓冲和分散应力功能；其深层存在钙化软骨层，富含肥大化软骨细胞和矿化基质，位于透明软骨与软骨下骨之间，是连接软骨和骨的重要过渡界面。钙化软骨层能够增强透明软骨与软骨下骨之间的机械锚定，缓冲二者之间的力学差异，并维持骨软骨界面稳定。

3、然而，现有软骨组织工程材料大多以促进透明软骨形成为主要目标，主要关注colii、aggrecan等透明软骨基质的生成，而忽视了钙化软骨层在骨软骨界面修复中的重要作用。缺乏钙化软骨层的修复组织虽然能够在缺损区域形成一定软骨样组织，但其与软骨下骨之间缺少稳定过渡界面，容易导致界面整合不足、应力传导不连续和修复组织长期稳定性差。因此，开发一种能够诱导钙化软骨层形成的功能性材料，对于提高软骨缺损修复质量具有重要意义。

4、软骨细胞肥大化是天然钙化软骨形成过程中的关键生物学事件。适度的软骨细胞肥大化可促进col x、alp等钙化软骨相关标志物表达，并诱导矿化基质沉积，从而形成具有一定硬度和矿化特征的钙化软骨层。需要说明的是，钙化软骨层形成所需的肥大化不同于病理性过度成骨化。前者是一种受控的软骨成熟过程，有助于建立透明软骨与软骨下骨之间的过渡结构；后者则可能导致软骨表型丧失和异常骨化。因此，如何诱导软骨细胞发生适度肥大化而避免明显成骨化，是构建钙化软骨层的关键。

5、专利cn119950814a公开了一种基于dna-丝素蛋白杂化水凝胶缓释系统构建的软骨类器官及其制备方法与应用，此dna-丝素蛋白杂化水凝胶缓释系统由dna-丝素蛋白杂化水凝胶为主要体系，通过丙烯酰化聚乙二醇nhs酯将两种药物(氨糖和td-198946)共价锚定于丝素蛋白水凝胶网络上，从而实现能够通过持续释放长期支持骨髓间充质干细胞软骨向分化的药物，实现骨髓间充质干细胞在该体系中的长期培养。但是该dna-丝素蛋白杂化水凝胶缓释系统为可持续提供促骨髓间充质干细胞软骨向分化、促软骨细胞外基质合成效率且防止骨髓间充质干细胞在长期分化过程中发生去分化和肥大化的功能。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有软骨工程材料难以有效模拟钙化软骨层、矿化诱导能力有限等缺陷，从而提供一种钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法与应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一为提供一种钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶，包括dna超分子网络、海藻酸钠类高分子、碳酸钙颗粒和光引发剂；

4、所述dna超分子网络由y型dna单链和l型dna单链通过互补粘性末端自组装形成；所述dna超分子网络和海藻酸钠类高分子共同形成复合水凝胶网络，所述碳酸钙颗粒分散于所述复合水凝胶网络中。

5、在一些具体实施方式中，所述y型dna单链包括dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3，其中，dna单链y1的核苷酸序列如seq id no.1所示，dna单链y2的核苷酸序列如seq idno.2所示，dna单链y3的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、所述l型dna单链包括dna单链l1和dna单链l2，dna单链l1的核苷酸序列如seq idno.4所示，dna单链l2的核苷酸序列如seq id no.5所示。

7、在本发明中，所述dna单链y1、dna单链y2、dna单链y3均具有三个粘性末端，所述dna单链l1、dna单链l2的两端各有粘性末端，所述l型dna单链能与y型dna单链的粘性末端完全互补。

8、在一些具体实施方式中，所述海藻酸钠类高分子选自甲基丙烯酰化海藻酸钠、氧化海藻酸钠、羧甲基化海藻酸钠中的任意一种或多种的组合。

9、在一些具体实施方式中，所述光引发剂选自苯基（2,4,6-三甲基苯甲酰基）磷酸锂、irgacure 2959中的任意一种或多种的组合。

10、在一些具体实施方式中，所述海藻酸钠类高分子的质量浓度为5-20 wt%；

11、所述y型dna单链和l型dna单链的总浓度为100-1000 nmol/ml；dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3的摩尔比是1：1：1；dna单链l1和dna单链l2的摩尔比是1：1；y型dna单链和l型dna单链的总摩尔比为1:1~1:2；

12、所述碳酸钙颗粒的质量浓度为0.1-10 wt%。

13、在本发明中，所述dna超分子网络中含有的磷酸基、羟基和碱基结构，所述海藻酸钠类高分子中含有羧基结构，磷酸基和羧基能够与ca2+发生相互作用，以调控碳酸钙颗粒在水凝胶网络中的分散、滞留和释放行为，使得钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶能够持续释放ca2+，并促进软骨细胞适度肥大化、col x表达、alp活性增强和矿化基质沉积。

14、本发明的技术方案之二为提供一种如上述技术方案之一所述的钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

15、s1、将y型dna单链和l型dna单链溶解于缓冲液中，通过碱基互补配对自组装形成dna超分子网络；

16、s2、将海藻酸钠类高分子和光引发剂加入步骤s1所得的dna超分子网络中，混合均匀，得到dna-海藻酸钠前驱液；

17、s3、将碳酸钙颗粒加入步骤s2所得dna-海藻酸钠前驱液中，混合均匀，得到钙化软骨诱导型水凝胶前驱液；

18、s4、将步骤s3所得水凝胶前驱液经光照交联，得到钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶。

19、在一些具体实施方式中，s1步骤，所述缓冲液为ph为7.2-7.6的pbs缓冲液。

20、在一些具体实施方式中，s4步骤，光照交联所用光源波长为365-405 nm，光照时间为10-120 s，光照强度为3-20 mw/cm2。

21、本发明的技术方案之三为提供一种如上述技术方案之一所述的钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶的应用，选自以下应用中的任意一种：

22、（1）细胞培养；

23、（2）组织结构的构建；

24、（3）类器官构建。

25、在一些具体实施方式中，所述钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶在钙化软骨类器官、骨软骨界面修复支架、透明-钙化双层软骨类器官、关节软骨缺损修复材料、组织工程产品或医疗器械中的应用。

26、本发明的技术方案之四为提供一种基于上述技术方案之一所述的钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶培养细胞构建得到的具有钙化软骨表型的类器官。

27、在一些具体实施方式中，所述细胞选自软骨细胞、软骨祖细胞、间充质干细胞中的任意一种或多种。

28、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

29、（1）本发明强调软骨细胞“适度肥大化”在钙化软骨层形成中的积极意义。适度肥大化有利于形成天然骨软骨界面中的钙化软骨层，增强软骨与软骨下骨之间的界面锚定和力学稳定性，而非诱导病理性过度成骨化。

30、因此本发明将dna超分子网络、海藻酸钠类高分子和碳酸钙颗粒进行复合，构建得到一种兼具三维细胞负载、力学支撑、持续钙离子释放和钙化软骨诱导功能的新型水凝胶。

31、不同于传统仅促进透明软骨形成的水凝胶材料，本发明的钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶为专门面向钙化软骨层构建的功能性水凝胶，具有良好的成胶性能、可打印性、细胞相容性、力学稳定性和持续钙离子释放能力，可为软骨细胞提供适宜的三维微环境，并通过caco3持续释放ca2+促进软骨细胞适度肥大化和矿化基质沉积，增强col x表达、alp活性和矿化基质沉积，为钙化软骨层形成提供生物活性微环境，从而用于钙化软骨类器官和骨软骨界面修复材料的构建。

32、（2）本发明采用dna超分子网络与海藻酸钠类高分子复合构建水凝胶，dna分子可通过氢键、静电作用和碱基互补配对形成动态物理网络，海藻酸钠类高分子则提供稳定的三维水凝胶骨架，二者共同提高水凝胶的结构稳定性和细胞负载能力。

33、（3）本发明引入碳酸钙颗粒作为无机增强相和ca2+释放源，一方面能够提高水凝胶的压缩强度、杨氏模量和硬度，使其更符合天然钙化软骨层相对较高刚度的力学特征，另一方面，通过释放的ca2+调控软骨细胞向钙化软骨表型成熟，促进col x表达、alp活性增强和矿化基质沉积。

34、（4）本发明的钙化软骨诱导型dna-海藻酸钠复合水凝胶可用于构建钙化软骨类器官、透明-钙化双层软骨类器官、骨软骨界面修复支架及关节软骨缺损修复材料，为重建天然软骨-钙化软骨界面提供一种功能性材料平台。