用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法。

背景技术：

1、骨质疏松症是以骨量减少和骨微结构退化为特征的全身性骨骼疾病，在老年人群中高发，其核心病理机制在于随机体衰老逐渐加剧的骨形成与骨吸收失衡，严重威胁全球老年人群的健康与生活质量。骨髓间充质干细胞（bmscs）是成骨细胞的前体来源，是骨形成和骨再生的核心细胞基础，随机体衰老发生功能性衰退，表现为增殖能力下降、成骨分化潜能减弱及衰老相关分泌表型（sasp）激活、持续分泌il-6、il-1β等促炎因子，这些因子加重骨损伤的修复困难，是老年性骨质疏松骨形成减少的重要细胞病理基础。然而，目前针对于老龄性骨质疏松骨缺损，缺乏有效的治疗策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，以解决目前针对于老龄性骨质疏松骨缺损，缺乏有效的治疗策略的技术问题。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、制备共负载tspan9 mrna与线粒体靶向抗氧化剂mitoq的工程化外泌体tm-exo；

5、s2、制备gelma溶液；

6、s3、将所述gelma溶液与所述工程化外泌体tm-exo复合形成所述水凝胶复合递送平台。

7、进一步的，所述步骤s1中的工程化外泌体tm-exo的制备方法，包括以下步骤：

8、s11、构建tspan9过表达质粒，并将tspan9过表达质粒转染至bmscs中，将转染tspan9过表达质粒后的bmscs于完全培养基中继续培养48h；

9、s12、从培养转染tspan9过表达质粒后的bmscs的培养基中提取负载tspan9 mrna的工程化外泌体；

10、s13、将mitoq装载至所提取的负载tspan9 mrna的工程化外泌体中。

11、进一步的，构建tspan9过表达质粒的方法：将tspan9编码序列克隆至pcdna3.1(+)过表达载体，形成tspan9过表达质粒：pcdna3.1-tspan9。

12、进一步的，将tspan9过表达质粒转染至bmscs中的方法：采用lipofectamine 3000转染试剂按说明书将质粒转染至bmscs中。

13、进一步的，从培养转染tspan9过表达质粒后的bmscs的培养基中提取负载tspan9mrna的工程化外泌体的方法：收集培养转染tspan9过表达质粒后的bmscs的培养基，采用差速超速离心法分离外泌体。

14、进一步的，将mitoq装载至所提取的负载tspan9 mrna的工程化外泌体中的方法：将所提取的负载tspan9 mrna的工程化外泌体与mitoq按质量比1:1混合后，置于冰浴中进行超声处理，超声结束后于37℃孵育30min以促进外泌体膜结构自我修复，随后于100,000×g超速离心70min去除游离未包封的mitoq，收集含mitoq的外泌体沉淀，重悬于pbs中备用。

15、进一步的，制备gelma溶液的方法：将甲基丙烯酰化明胶粉末溶于pbs中，配制重量/体积浓度为10％的gelma溶液，加入重量/体积浓度为0.5％w/v的光引发剂irgacure2959，充分混匀后于37℃水浴中保温备用。

16、进一步的，将所述gelma溶液与所述工程化外泌体tm-exo复合形成所述水凝胶复合递送平台的方法：将所述工程化外泌体tm-exo与gelma溶液均匀混合后，经405nm蓝光照射30s完成光交联固化。

17、本发明的有益效果在于：

18、本发明构建了共负载tspan9 mrna与线粒体靶向抗氧化剂mitoq的工程化外泌体/gelma复合递送平台，在体外和体内层面均实现了优于单一功能制剂的协同骨再生效果；

19、本发明创新性地通过tspan9 mrna的工程化外泌体递送，实现了衰老细胞迁移体生成能力的主动恢复，而非简单的外源替代。这种从"被动补充"到"主动恢复"的策略转变，使衰老bmscs能够恢复自身的线粒体质量控制能力，建立起"tspan9→迁移体分泌→受损线粒体清除→线粒体稳态恢复"的完整调控链条。

20、本发明同步激活两个维度的线粒体稳态调控：一方面主动清除受损线粒体，通过激活"有丝细胞分裂"这一内源性线粒体质量控制通路，从源头上减少衰老细胞中受损线粒体的蓄积。另一方面通过mitoq中和mtros，保护线粒体膜电位，改善电子传递链效率。这种"主动清除+被动保护"的协同模式显著优于单一策略。

21、本发明通过恢复衰老bmscs的线粒体功能和降低其氧化应激状态，使这些衰老细胞能够恢复自身合成和分泌促血管生成、促成骨分化因子的能力。

22、构建的tm-exo/gelma工程化外泌体复合平台通过同步递送tspan9 mrna与mitoq，实现了对衰老骨髓微环境的系统性重塑，在体外和体内均表现出优异的协同促成骨再生效果，为老龄性骨质疏松骨缺损的临床治疗提供了有效的治疗策略。

23、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

1.一种用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的工程化外泌体tm-exo的制备方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，构建tspan9过表达质粒的方法：将tspan9编码序列克隆至pcdna3.1(+)过表达载体，形成tspan9过表达质粒：pcdna3.1-tspan9。

4.根据权利要求2所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，将tspan9过表达质粒转染至bmscs中的方法：采用lipofectamine 3000转染试剂按说明书将质粒转染至bmscs中。

5.根据权利要求2所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，从培养转染tspan9过表达质粒后的bmscs的培养基中提取负载tspan9mrna的工程化外泌体的方法：收集培养转染tspan9过表达质粒后的bmscs的培养基，采用差速超速离心法分离外泌体。

6.根据权利要求2所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，将mitoq装载至所提取的负载tspan9 mrna的工程化外泌体中的方法：将所提取的负载tspan9 mrna的工程化外泌体与mitoq按质量比1:1混合后，置于冰浴中进行超声处理，超声结束后于37℃孵育30min以促进外泌体膜结构自我修复，随后于100,000×g超速离心70min去除游离未包封的mitoq，收集含mitoq的外泌体沉淀，重悬于pbs中备用。

7.根据权利要求1所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，制备gelma溶液的方法：将甲基丙烯酰化明胶粉末溶于pbs中，配制重量/体积浓度为10％的gelma溶液，加入重量/体积浓度为0.5％w/v的光引发剂irgacure 2959，充分混匀后于37℃水浴中保温备用。

8.根据权利要求1所述的用于促进骨质疏松骨再生的水凝胶复合递送平台的制备方法，其特征在于，将所述gelma溶液与所述工程化外泌体tm-exo复合形成所述水凝胶复合递送平台的方法：将所述工程化外泌体tm-exo与gelma溶液均匀混合后，经405nm蓝光照射30s完成光交联固化。