CX3CR1+CD8+T细胞联合化疗免疫疗法在治疗食管鳞状细胞癌中的应用

本发明属于生物医药，具体地，涉及cx3cr1+cd8+t细胞联合化疗免疫疗法在治疗食管鳞状细胞癌中的应用。

背景技术：

1、食管癌是起源于食管黏膜上皮的高度恶性肿瘤，其发病与吸烟、饮酒、化学物质、微量元素及维生素缺乏、饮食习惯、生物因素、遗传及食管慢性炎症等有关。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer, escc）是食管癌的主要组织学类型，其典型的症状是进行性吞咽困难，肿瘤侵犯未达食管周径1/3时症状往往不明显，容易被忽视，这导致大多数患者就诊时已发展为局部晚期或发生远处转移。

2、新辅助治疗联合手术治疗是目前可切除escc诊疗的首选手段，可以显著延长患者的生存期。除了传统的新辅助化疗、新辅助放化疗以外，近些年化疗联合免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ici）治疗（也称化疗免疫疗法），正逐渐成为新辅助治疗的新兴方式。对于不可切除的escc，化疗免疫疗法成为一线治疗的首选方案，大多数患者可以从中获益，甚至可以通过化疗免疫疗法达到肿瘤的临床完全缓解，但是，同时也存在一部分患者对化疗免疫疗法的敏感性仍然不足，无法获得预期的治疗效果。因此，探寻评价化疗免疫疗法效果的标志物、开发其他治疗escc的药物，提升escc治疗效率成为本领域重要的技术问题。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供cx3cr1+cd8+t细胞或cx3cr1+cd8+t细胞联合化疗免疫疗法在治疗食管鳞状细胞癌中的应用，以及检测样本中cx3cr1+cd8+t细胞水平的试剂在制备评价化疗免疫疗法治疗食管癌疗效的产品中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了cx3cr1+cd8+t细胞联合化疗免疫疗法在制备治疗食管癌的药物中的应用。

4、进一步，所述化疗免疫疗法为化疗药物与免疫检查点抑制剂联合使用。

5、进一步，所述化疗药物为nab-paclitaxel，所述免疫检查点抑制剂为pd-1抗体。

6、在一些实施方案中，所述化疗药物和免疫检查点抑制剂并不局限于上述药物，任何具备治疗食管癌效果的化疗药物和免疫检查点抑制剂均将落入本发明的保护范围内，例如化疗药物包括铂类药物（顺铂、奥沙利铂、卡铂等）；氟尿嘧啶类抗代谢药（5-氟尿嘧啶、卡培他滨等）；紫杉类（紫杉醇、多西他赛等）；喜树碱类（伊立替康等），免疫检查点抑制剂包括pd-1抑制剂（帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗等）、pd-l1抑制剂（阿替利珠单抗等）、ctla-4抑制剂（伊匹单抗等）。

7、进一步，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌、食管腺癌。

8、进一步，所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

9、本发明第二方面提供了cx3cr1+cd8+t细胞在制备治疗食管癌的药物中的应用。

10、进一步，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌、食管腺癌。

11、进一步，所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

12、本发明第三方面提供了一种治疗食管癌的药物，所述药物包括cx3cr1+cd8+t细胞以及药学上可接受的辅料。

13、本发明第四方面提供了一种治疗食管癌的药物组合物，所述药物组合物包括cx3cr1+cd8+t细胞、化疗药物、免疫检查点抑制剂以及药学上可接受的辅料。

14、在一些实施方案中，所述药学上可接受的辅料为制成各种剂型所需要的辅料，可以是填充剂，如乳糖、糊精、微晶纤维、淀粉、山梨醇、甘露醇、预胶化淀粉等；可以是崩解剂，如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、羟丙基纤维素等，可以是粘合剂，如淀粉浆、淀粉浆钠、羟丙甲纤维素、聚维酮等，可以是表面活性剂，如十二烷基磺酸钠、十六烷基硫酸钠、硬脂酸、油酸、月桂酸等，可以是润滑剂，如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇等。

15、在一些实施方案中，本发明所述药物组合物以药学上的有效量施用。所述“药学上的有效量”是指足够以可适用于医学治疗的合理效益/风险比来治疗疾病的量，有效剂量水平可根据患者的疾病类型、患病程度、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排出率、治疗期限、包括同时使用的药物在内的因素以及其它医学领域已知的因素而决定。本发明的组合物可作为单独的治疗剂来施用，或者与其它治疗剂组合施用，可与传统的治疗剂依次或同时施用，并且可以单次或多次施用。重要的是在考虑上述所有因素的情况下施用能够以最少的量获得最大的效果且无副作用的量，这可以由所属领域技术人员容易地确定。

16、进一步，所述化疗药物为nab-paclitaxel，所述免疫检查点抑制剂为pd-1抗体。

17、本发明第五方面提供了检测样本中cx3cr1+cd8+t细胞水平的试剂在制备评价化疗免疫疗法治疗食管癌疗效的产品中的应用。

18、在一些实施方案中，所述检测样本中cx3cr1+cd8+t细胞水平的试剂包括检测cd8+t细胞中cx3cr1 mrna的表达量的方法以及检测cd8+t细胞中cx3cr1蛋白表达量的方法。

19、在一些实施方案中，用于确定cd8+t细胞中cx3cr1 mrna的量的方法是本领域技术人员公知的。可以通过杂交（例如，northern印迹分析）、特别是通过nanostring方法和/或通过扩增（例如，rt-pcr）、特别是通过定量或半定量rt-pcr来检测mrna。其它扩增方法包括连接酶链式反应（lcr）、转录介导扩增（tma）、链置换扩增（sda）和基于核酸序列的扩增（nasba）。

20、在一些实施方案中，cd8+t细胞cx3cr1蛋白质的表达量可通过技术人员已知的任何方法来测量。通常，这些方法包括使样本与能够与该样本中存在的蛋白质选择性相互作用的结合配偶体接触。结合配偶体通常是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。这样的抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生。该抗体特别包括由杂交瘤产生的那些抗体、以及利用以携带该抗体编码基因的重组表达载体转化的宿主细胞进行基因工程而产生的那些抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤可以如下获得：根据常规免疫接种方法，将蛋白质或其免疫原性片段用作抗原进行免疫接种。由此 产生的免疫细胞根据常规细胞融合方法与已知的亲本细胞融合，从而使用常规筛选方法从融合细胞中筛选产生该抗体的细胞。

21、在一些实施方案中，cd8+t细胞cx3cr1蛋白质的表达量还可通过半定量western印迹、酶标记和介导的免疫测定如elisa、生物素/亲和素类型测定、放射免疫测定、免疫组织化学、免疫电泳或免疫沉淀、蛋白质或抗体阵列、或流式细胞术如荧光激活细胞分选（facs）来测量。所述反应通常包括显示标记物如荧光标记物、化学发光标记物、放射性标记物、酶标记物或染料分子，或其它用于检测抗原和与其反应的抗体之间形成复合体的方法。

22、在一些实施方案中，所述样本包括但不限于：受试者来源的组织、血液、细胞、淋巴液、滑膜液、外泌体、细胞提取物、粪便、尿液、唾液、痰液、关节腔液、胸腹水、浆膜腔积液、淋巴液、脑脊液、宫腔液、消化液、胆汁、肺泡支气管清洗液、脏器及其任意组合。

23、在本发明中，所述受试者包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物（例如哺乳动物和非哺乳动物），例如非人灵长类（例如，食蟹猴）、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。

24、在本发明中，经本发明收集的真实临床样本验证发现，cx3cr1+cd8+t细胞对化疗免疫治疗的疗效具有较好的评估效能，其中，所述评估效能是通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic, roc）进行验证的，曲线下面积（area under thecurve, auc）的测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。

25、在一些实施方案中，所述roc曲线是以假阳性概率（1-特异性）为横轴，真阳性概率（敏感度）为纵轴所组成的坐标图，和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。可根据roc曲线选择最佳的诊断界限值：roc曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。最靠近左上角的roc曲线的点是错误最少得最佳阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。还可通过roc曲线进行两种或两种以上不同评价试验对疗效识别能力的比较：在对同一种疾病的两种或两种以上评价方法进行比较时，可将各试验的roc曲线绘制到同一坐标中，以直观地鉴别优劣，靠近左上角的roc曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的roc曲线下面积（auc）进行比较，哪种试验的auc最大，则哪一种试验的评价效能最佳。

26、本发明第六方面提供了一种评价化疗免疫疗法治疗食管癌疗效的产品，所述试剂盒包括检测样本中cx3cr1+cd8+t细胞水平的试剂。

27、进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸条、高通量测序平台。

28、在一些实施方案中，所述试剂盒的组件可以在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器工具通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器工具，组分可以放置在其中、并且优选适当地等分。在试剂盒中有多于一个组分的情况下，所述试剂盒通常还包含第二个、第三个或其它附加的容器，附加的组件可以单独放置在其中。然而，小瓶中可以包含组分的各种组合。所述试剂盒还可以包含用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其它稀释剂的工具。任选地，提供介绍这样的试剂盒的使用指导的说明书。

29、在一些实施方案中，所述芯片具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种标志物或其他样品来源标志物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样品中标志物，其任何数量或任何组合的浓度。

30、本发明第七方面提供了一种非治疗目的的体外抑制食管癌细胞活力的方法，所述方法包括使用本发明第三方面所述的药物或本发明第四方面所述的药物组合物处理食管癌细胞。

31、进一步，所述食管癌细胞为食管鳞状细胞癌细胞。

32、进一步，所述食管鳞状细胞癌细胞包括akr细胞、kyse150细胞。

33、本发明的优点和有益效果：

34、本发明发现cx3cr1+cd8+t细胞具有抑制食管鳞状细胞癌细胞活力的效果，且当cx3cr1+cd8+t细胞与化疗免疫疗法联合使用时可在食管鳞状细胞癌小鼠模型中产生协同抑瘤作用。本发明为食管鳞状细胞癌的治疗提供了有效的治疗药物和药物联用策略，在食管鳞状细胞癌治疗药物的开发这一技术领域具有广阔的应用前景。