一种提高脂肪酶活性与热稳定性的分子改造设计方法及其突变体

本发明属于酶工程和蛋白质工程，具体涉及一种基于分子动力学模拟、动态相关性分析、序列保守性分析、热稳定性预测和组合突变筛选的脂肪酶分子改造设计方法，尤其涉及一种通过关键区域柔性维持与全域骨架刚性化实现脂肪酶活性和稳定性同步提升的方法。

背景技术：

1、脂肪酶(e.c.3.1.1.3)属于丝氨酸水解酶，通常具有典型的α/β水解酶折叠结构，并依赖由ser、asp和his残基组成的催化三联体完成催化反应。脂肪酶能够催化水解、酯化和酯交换等多种反应，已广泛应用于食品加工、医药中间体合成、精细化学品制备及其他工业生物催化过程。

2、在实际工业应用中，提高反应温度有利于增强底物溶解度、降低体系黏度并提高传质效率，但多数天然酶在较高温度或有机溶剂环境下容易发生构象扰动、结构展开或失活。虽然通过理性设计、半理性设计或定向进化等蛋白质工程手段能够改善酶的稳定性，但过度增强蛋白整体刚性往往限制催化相关区域的构象变化，导致酶活性下降，形成“活性-稳定性权衡”。

3、已有研究通过柔性区域改造提高脂肪酶热稳定性。ahmad等(protein science，2012,21(3)，433-446)对bsla的86个柔性位点进行饱和突变，筛选约16000个克隆后仅获得17个增稳突变体，阳性率约为0.11％，其熔解温度仅提高1-6℃。jones等(biochemistry，2017,56(50)，6521-6532)发现，以α/β水解酶sabp2为模型酶，通过rosetta和foldx预测的13个突变中仅4个稳定性提升，部分稳定性增强的突变体催化效率降低约80％，说明单一计算参数难以兼顾稳定性与催化活性。

4、管武太等(cn106047838b)在耶氏解脂酵母脂肪酶lip2中设计了5组二硫键突变，其中3组存在二硫键未形成、热稳定性下降或催化活性受损等问题，仅2组兼顾稳定性和活性；其50℃半衰期由1.65min提高至13.61min和12.57min，但催化效率仅提高4.0％和12.8％。因此，现有方法仍存在筛选效率低、预测准确性有限及过度刚性化损害催化动态等问题，需要建立同步提升脂肪酶活性与稳定性的改造方法。

5、本发明的目的在于提供一种能够同步提升脂肪酶热稳定性和催化活性的分子改造设计方法。该方法通过分子动力学模拟识别催化相关关键柔性区域，通过动态相关性分析和保守性分析筛选可维持关键区域柔性的突变位点；同时利用fireprot、foldx、b-factor和保守性分析筛选有利于全域骨架刚性化的候选突变位点；最终通过饱和突变和组合突变筛选获得兼具高活性与高热稳定性的脂肪酶突变体。

技术实现思路

1、本发明提供的一种提高脂肪酶活性与热稳定性的分子改造设计方法及其突变体，包括以下步骤：

2、1.结构获取与预处理：选择枯草芽孢杆菌脂肪酶a作为改造对象，从蛋白质数据库获得其晶体结构，优选pdb id为1i6w；去除晶体结构中的非必要配体和水分子，获得用于后续模拟和计算分析的初始结构。

3、2.分子动力学模拟与关键柔性区域识别：对预处理后的bsla结构进行分子动力学模拟，在不同温度下模拟数百纳秒。利用rmsf分析高温条件下残基波动变化，结合催化三联体ser77、asp133和his156的空间位置，确定与催化功能相关的关键柔性区域。

4、3.关键区域柔性维持位点筛选：对步骤2确定的关键柔性区域进行动态相关矩阵分析，筛选与关键柔性区域存在强动态耦联的残基；结合consurf分析结果剔除高度保守残基；排除催化三联体ser77、asp133和his156，获得用于关键区域柔性维持的候选位点。

5、4.全域骨架刚性化位点筛选：利用fireprot在线服务器对bsla进行全酶尺度稳定化突变预测；进一步结合foldx预测的折叠自由能变化δδg、conservation评分和突变位点的空间结构位置，筛选能够增强全域骨架刚性且不直接干扰催化中心的候选单点突变。

6、5.单策略验证与模板突变体筛选：分别对关键区域柔性维持候选位点和全域骨架刚性化候选位点进行nnk定点饱和突变或定点突变，构建单突变体库并进行表达筛选。

7、6.双策略协同组合突变：以最优单点突变体为模板，将潜力位点分别引入并进行饱和突变，筛选得到二重突变体；随后以最优二重突变体为基础，对其余潜力位点进行不连续多点同时饱和突变，构建包含三重、四重和五重突变体的组合突变体文库。

8、7.突变体表达与性能筛选：将突变体质粒转化至表达宿主中，诱导表达后获得酶液；采用对硝基苯基棕榈酸酯(pnpp)比色法测定相对酶活和热处理后残余酶活，并进一步测定热半衰期，最终筛选出活性和稳定性同步提升的优选突变体。

9、在本发明的优选实施方式中，所述协同组合突变所得优选突变体为m4，其包含a15k/f17e/a132d/r142q突变。

10、在本发明的优选实施方式中，m4突变体在热处理后的残余活性较野生型提高21.37倍；催化活性较野生型提高4.35倍；半衰期较野生型提高94.52倍。

11、有益效果

12、(1)本发明将关键区域柔性维持与全域骨架刚性化相结合，避免了单纯增强酶分子刚性导致催化活性下降的问题。

13、(2)本发明通过rmsf、dccm、consurf、fireprot、foldx、b-factor及结构位置分析等多维度信息协同筛选突变位点，提高了候选突变位点筛选的合理性和成功率。

14、(3)本发明采用不连续多点同时饱和突变构建组合突变体文库，能够扩大序列搜索空间，避免简单叠加单点突变导致错过优势组合。

15、(4)本发明获得的优选突变体m4在热稳定性、催化活性及有机溶剂耐受性方面均较野生型得到提升，能够为高性能脂肪酶的开发提供可行方案。

16、(5)本发明建立的分子改造流程具有较强的通用性，可为其他脂肪酶或结构明确的工业酶的稳定性与活性协同提升提供参考。

1.一种提高脂肪酶活性与热稳定性的分子改造设计方法及其突变体，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(1)中所述枯草芽孢杆菌脂肪酶a的晶体结构优选为pdb id：1i6w，分辨率为所述野生型枯草芽孢杆菌脂肪酶a的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求1所述的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(2)中所述分子动力学模拟优选在至少两个不同温度条件下进行，模拟时间数百纳秒。

4.根据权利要求1所述的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(3)中所述关键区域柔性维持位点的筛选标准包括：1)候选残基位于关键柔性区域或其相邻结构单元内；2)候选残基与关键柔性区域的呈动态相关；3)候选残基的consurf保守性较低；4)候选残基不为ser77、asp133或his156。

5.根据权利要求1所述的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(4)中所述全域骨架刚性化候选位点的筛选标准包括：1)foldx预测折叠自由能变化δδg＜0；2)b-factor处于较高水平；3)ml pred.评分较高；4)conservation评分为低保守或中等保守；5)突变位点远离ser77、asp133和his156组成的催化三联体。

6.根据权利要求1所述的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(5)中以全域骨架刚性化策略筛选所得的最优突变体为模板，分别引入关键区域柔性维持策略筛选所得的潜力位点进行饱和突变，筛选得到二重突变体；以最优二重突变体为模板，对其余潜力位点进行不连续多点同时饱和突变，构建含三重、四重和五重突变体的组合突变体文库。

7.利用权利要求1-6任一项所述方法获得的枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型枯草芽孢杆菌脂肪酶a至少包含f17e和r142q突变；所述突变体为m4，包含a15k/f17e/a132d/r142q突变。

8.根据权利要求7所述的枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，其特征在于，所述m4突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，编码核苷酸序列如seq id no.4所示。

9.根据权利要求7或8所述的枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，其特征在于，所述m4突变体在热处理后的残余酶活较野生型提高21.37倍；半衰期较野生型提高94.52倍；催化活性较野生型提高4.35倍。

10.权利要求1-6任一项所述的分子改造设计方法或权利要求7-9任一项所述的枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体在制备高活性、高热稳定性脂肪酶中的应用。