一种雪莲细胞培养物及其在制备用于治疗卵巢功能损伤的药物中的用途的制作方法

本说明书涉及医药和生物，特别涉及一种雪莲细胞培养物及其在制备用于治疗卵巢功能损伤的药物中的用途。

背景技术：

1、女性在40岁前出现卵巢功能提前衰退，常表现为卵泡数量减少、激素分泌紊乱及生育能力下降。化疗药物（如环磷酰胺等烷化剂）是引起卵巢损伤的常见原因之一，其可损伤卵母细胞和卵巢颗粒细胞，促进卵泡闭锁并扰乱甾体激素合成。此类化疗相关卵巢功能损伤已成为影响女性患者生育力和内分泌健康的重要临床问题。目前临床上主要采用激素替代疗法或辅助生殖技术进行干预，但疗效有限，且难以从根本上恢复卵巢储备和功能。因此，亟需开发能够针对卵巢损伤病理环节、改善卵泡储备和内分泌功能的治疗药物。

2、雪莲花含有咖啡酰奎宁酸类、苯丙素苷类和黄酮类等多种活性成分，对卵巢功能具有一定的保护潜力。然而，野生雪莲受产地、采收季节和生态环境等因素影响较大，成分不稳定、药效波动明显，难以制成质量可控的标准化药物。

3、因此，有必要提供一种雪莲细胞培养物及其在制备用于治疗卵巢功能损伤的药物中的用途，以改善化疗相关卵巢功能损伤，提高卵巢储备和内分泌功能恢复效果，降低卵泡闭锁比例，并减少对野生雪莲资源的依赖，实现质量可控和批次一致。

技术实现思路

1、本说明书一个或多个实施例提供一种标准化雪莲细胞培养物在制备用于治疗化疗相关卵巢功能损伤的药物中的用途，所述标准化雪莲细胞培养物为雪莲属植物的体外培养细胞经扩增培养、采收和干燥后获得的细胞培养物干燥物；所述细胞培养物干燥物中含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中的至少两种。

2、在一些实施例中，所述雪莲属植物为雪莲花（saussurea involucrata (kar. etkir.) sch.-bip.）；所述细胞培养物干燥物中含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁。

3、在一些实施例中，所述化疗相关卵巢功能损伤由环磷酰胺或其活性代谢物诱导产生；所述药物在环磷酰胺给药结束后、且卵巢损伤已经形成后开始给药。

4、在一些实施例中，所述药物的治疗表现包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象血清中抗缪勒管激素（amh）水平升高、雌二醇（e2）水平升高、促卵泡生成素（fsh）水平降低中的一种或多种。

5、在一些实施例中，所述药物的治疗表现还包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象的卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡或次级卵泡的绝对数量增加，和/或闭锁卵泡占总卵泡数的比例降低。

6、在一些实施例中，药物的治疗表现还包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象的卵巢组织中的变化包括以下至少一种：cyp17a1、cyp19a1、hsd17b1或抗缪勒管激素的mrna表达水平上调；类固醇生成急性调节蛋白（star）或清道夫受体b类成员1（scarb1）的mrna表达水平降低；或，孕烯醇酮、链甾醇（desmosterol）、7-酮胆固醇、7α,25-二羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、皮质酮、睾酮、孕酮、雄烯二酮、17α-羟基孕酮或17β-雌二醇向正常生理水平回调。

7、在一些实施例中，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬液和口服前复溶的冻干粉；所述制剂的单位剂量含所述细胞培养物干燥物50～500 mg。

8、本说明书一个或多个实施例提供一种药物组合物，包含标准化雪莲细胞培养物和药学上可接受的辅料；所述标准化雪莲细胞培养物为雪莲花（saussurea involucrata(kar. et kir.) sch.-bip.）体外培养细胞经扩增培养、采收和干燥后获得的细胞培养物干燥物；所述细胞培养物干燥物含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中的至少两种。

9、在一些实施例中，所述药物组合物用于治疗环磷酰胺或其活性代谢物诱导产生的化疗相关卵巢功能损伤；所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬液或口服前复溶的冻干粉。

10、本说明书一个或多个实施例提供一种标准化雪莲细胞培养物的制备方法，包括：获得雪莲属植物的无菌外植体或愈伤组织；建立并扩增体外培养细胞；采收细胞并去除培养液残留；干燥和粉碎得到细胞培养物干燥物；所述细胞培养物干燥物含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中的至少两种。

11、在一些实施例中，所述建立并扩增体外培养细胞包括：将20～30 g细胞鲜重接种于每升培养基，在23～27 ℃、100～120 r/min条件下培养12～16天，并通过摇瓶、种子罐和生产罐中的至少两级培养进行放大。

12、本说明书一个或多个实施例提供一种标准化雪莲细胞培养物的质量控制方法，包括：采用高效液相色谱法，在265 nm检测波长下，将供试品色谱图中各特征峰与绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁对照品峰的保留时间进行比较；采用lc-hrms/ms方法对雪莲内酯进行结构确证；将检出绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中至少两种，且各特征峰与相应对照品峰的保留时间相对偏差不超过2.0%的批次判定为符合特征成分鉴别要求。

13、在一些实施例中，所述方法还包括在采收前对活细胞样品进行过程控制，所述过程控制包括：以gapdh2为内参基因，采用qrt-pcr检测羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（hqt）基因、莽草酸o-羟基肉桂酰转移酶（hct）基因、黄酮合酶（fns）基因、udp-糖基转移酶（ugt）基因、o-甲基转移酶（omt）基因、查尔酮合酶（chs）基因、黄烷酮3-羟化酶（f3h）基因和黄酮3’-羟化酶（f3’h）基因中的至少一种，以及序列如seq id no: 1～24所示的倍半萜内酯候选基因中的至少两种的相对表达水平，用于辅助表征培养阶段和批次一致性。

14、本说明书一个或多个实施例提供一种雪莲细胞培养物富集部位的制备方法，包括以下步骤：将雪莲花（

saussurea involucrata(kar. et kir.) sch.-bip.）体外培养细胞的干燥物，按每克干燥物加入10 ml体积分数50%的乙醇水溶液的比例，在80±2 ℃下回流提取2次，每次1 h，趁热过滤，合并滤液；将合并滤液在≤60 ℃、-0.08～-0.06 mpa条件下减压浓缩至相对密度1.10～1.20（60 ℃测定），得到浓缩液；将所述浓缩液以不超过1个柱体积/小时的流速上样于d101型大孔吸附树脂柱，先用3个柱体积的纯化水洗脱除杂，再用3个柱体积的体积分数30%的乙醇水溶液洗脱，收集30%乙醇洗脱液；将所述30%乙醇洗脱液在≤60 ℃减压浓缩后冷冻干燥，得到富集部位；所述富集部位含有1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁。

1.一种标准化雪莲细胞培养物在制备用于治疗化疗相关卵巢功能损伤的药物中的用途，其特征在于，所述标准化雪莲细胞培养物为雪莲属植物的体外培养细胞经扩增培养、采收和干燥后获得的细胞培养物干燥物；所述细胞培养物干燥物中含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中的至少两种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述雪莲属植物为雪莲花（saussureainvolucrata (kar. et kir.) sch.-bip.）；所述细胞培养物干燥物中含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述化疗相关卵巢功能损伤由环磷酰胺或其活性代谢物诱导产生；所述药物在环磷酰胺给药结束后、且卵巢损伤已经形成后开始给药。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物的治疗表现包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象血清中抗缪勒管激素（amh）水平升高、雌二醇（e2）水平升高、促卵泡生成素（fsh）水平降低中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物的治疗表现还包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象的卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡或次级卵泡的绝对数量增加，和/或闭锁卵泡占总卵泡数的比例降低。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，药物的治疗表现还包括：与未治疗的化疗相关卵巢功能损伤模型相比，给药后受试对象的卵巢组织中的变化包括以下至少一种：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬液和口服前复溶的冻干粉；所述制剂的单位剂量含所述细胞培养物干燥物50～500 mg。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含标准化雪莲细胞培养物和药学上可接受的辅料；所述标准化雪莲细胞培养物为雪莲花（saussurea involucrata (kar. et kir.) sch.-bip.）体外培养细胞经扩增培养、采收和干燥后获得的细胞培养物干燥物；所述细胞培养物干燥物含有绿原酸、紫丁香苷、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和芦丁中的至少两种。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗环磷酰胺或其活性代谢物诱导产生的化疗相关卵巢功能损伤；所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬液或口服前复溶的冻干粉。

10.一种标准化雪莲细胞培养物的制备方法，其特征在于，包括：

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述建立并扩增体外培养细胞包括：

12.一种标准化雪莲细胞培养物的质量控制方法，其特征在于，包括：

13.根据权利要求12所述的质量控制方法，其特征在于，所述方法还包括在采收前对活细胞样品进行过程控制，所述过程控制包括：

14.一种雪莲细胞培养物富集部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：