猫冠状病毒表面展示DNA疫苗及其应用

本发明涉及兽用核酸疫苗，涉及猫冠状病毒表面展示dna疫苗及其应用。

背景技术：

1、猫冠状病毒（feline coronavirus，fcov）属于冠状病毒科α属的单股正链rna病毒，在猫群中广泛传播。fcov通常引起轻度肠道感染，但部分毒株可在体内发生突变，进而引发猫传染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，fip）。该疾病具有较高的致死率，严重威胁猫科动物健康。目前，针对fcov尤其是fip的防控手段仍较为有限，尚缺乏安全性高且免疫效果稳定的疫苗产品。冠状病毒刺突蛋白（spike，s）是介导病毒吸附和进入宿主细胞的关键结构蛋白。其中，s1亚基主要负责宿主受体识别与结合，是决定病毒宿主范围及组织嗜性的关键区域。同时，s1蛋白含有多个重要的中和抗原表位，是诱导机体产生保护性免疫应答的核心靶标。

2、dna疫苗作为一种新型疫苗形式，具有构建简便、生产周期短、安全性高以及可同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点，在动物疫病防控领域具有广阔应用前景。然而，现有dna疫苗普遍存在抗原表达水平有限、抗原递呈效率较低以及免疫原性不足等问题，限制了其实际应用效果。抗原表面展示技术逐渐应用于疫苗设计领域。通过将目标抗原锚定于细胞膜表面或类病毒颗粒表面进行展示，可在空间构象上更好地模拟天然病毒结构，从而提高抗原的暴露程度和免疫系统识别效率，增强免疫应答强度。然而，目前针对猫冠状病毒s1蛋白的表面展示型dna疫苗研究仍较为有限，相关技术方案尚不成熟。因此，开发一种能够高效表达并实现猫冠状病毒s1蛋白表面展示的dna疫苗，对于提高抗原递呈效率、增强免疫原性以及提升疫苗保护效果具有重要意义，也为猫冠状病毒相关疾病的防控提供新的技术途径。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种猫冠状病毒表面展示dna疫苗，该dna疫苗为重组质粒dna疫苗，包括编码猫冠状病毒抗原融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白自n端至c端依次包括信号肽、s1蛋白、hfc片段、跨膜结构域。本发明通过表面展示方式提高猫冠状病毒s1抗原在细胞表面的暴露与呈递，有利于诱导体液免疫应答，并有助于激活细胞免疫相关应答，以此为基础构建的dna疫苗能够有效预防猫冠状病毒感染相关疾病。

2、本发明提供了一种猫冠状病毒表面展示dna疫苗，包括编码猫冠状病毒抗原融合蛋白的核酸，所述猫冠状病毒抗原融合蛋白自n端至c端依次包括：信号肽、猫冠状病毒s1蛋白、hfc片段和跨膜结构域。

3、上述猫冠状病毒表面展示dna疫苗通过在猫冠状病毒抗原融合蛋白n端引入信号肽，提高其分泌转运效率，用于促进所述融合蛋白进入分泌途径并向细胞膜方向转运；通过在c端引入跨膜结构域，使目的蛋白锚定于细胞膜表面，实现目的蛋白在宿主细胞表面的有效表达与暴露，通过在c端融合hfc片段，促进抗原二聚体形成并提高抗原稳定性、抗原递呈效率和免疫原性，从而提高所述dna疫苗的免疫效果。

4、在其中一个实施例中，所述信号肽为真核分泌型信号肽，所述hfc片段为人免疫球蛋白g的fc片段，所述跨膜结构域为pdgfr跨膜区。

5、在其中一个实施例中，所述信号肽为igκ链信号肽。

6、在其中一个实施例中，编码所述信号肽的核酸序列如seq id no:3所示，编码所述猫冠状病毒s1蛋白的核酸序列如seq id no:1所示，编码hfc片段的核酸序列如seq id no:2所示，编码跨膜结构域的核酸序列如seq id no:4所示。

7、编码所述猫冠状病毒s1蛋白的核酸序列如下所示：

8、atgatgttgttactatttgcacttcttaccattgctaggtctgaagatgcgcctcatggtgtaaccctaccgcaattcaatacctcttctaacaatcccaagtttgaacttaatttctacaatttcttacaaacttgggacataccaccacacacagagactgttctgggcggttatctaccatattgtggagcaggtgataattgtgggtggtacaactttgtctacagtcacaatgttggagctaatgccaagtactcatatataaacacacaaaaccttaacataccgaatgtccatggtgtctactttgacgtgagagagcatgattctgatggtgtgtgggacgaacgtgacaaagttggcttactgattgctatacatggtaactcaccttatagcttgctcatggttttgcaagataatgtaaaagaaaatgagcctcacgttgccgttaaaatttgccattggaaatcaggtaacataagtactcttcatagttttactgttgacctaggagatagaggccaatgcgtgtttaatcgaagattctcattagacactgtactgacaactaatgacttttatggctttcaatggactgacacttacgtggacatttaccttggtggcactattacaaaagtatgggttaagaatgattggagtgttgtcgaagctagcatttcgtaccactggaatatacaatttgttaaccgcaccacttactatgcttacaatagtactggtggttcaaattacacacatctgcagttatcagagtgccatagtgattattgtgctggctatgctaagaacgtctttgtgccaattgatggtaagataccagaaagcttttcttttagtaactggtttctgttatcagataaatccactttagtgcaaggacgtgttcttagtagtcaacctgtttttgtacaatgccttaggcctgtaccttcatggtctaataatactgctgtggtgtattttaaaaacgacgtcttctgccctaacgtcacggcagatgttttgaggttcaatttaaattttagtgacactggtgtctatacagattcagctaatgatgaccagttttattttacatttgaagataacacaactgcatccatagcttgttatagcagtgctaatgttactgatttccagcctgcgaacaatagtgtttcccacattccatttgaccaaactgcgcattcttacttctgttttgccaacttttctcactctgttatgagtagacagtttttgggcatacttccaccaattgtccgagagtttgcattcagtagagacggatccatttttgttaacggctataaatatttcagtttaccacccattaagagtgtcaatttctccattagatcagttgagcagtatggtttttggaccatagcttacaccaactacacggatgtaatggtggatgttaatggcacgggtattactagattattctattgtgactcacccctcaatagaattaagtgtcagcaattgaagcatgagttaccggacggtttttattctgctatcatgctcgtcaaaaaggatttacctaagacatttgtaactatgccacaattttacaatttgatgaatgtcacactacacgtcgtgttgaacgatactgaaaagggggctgacatcatcttggctaaggcaccagagctagcatcacttgctgacatacattttgaaatagttcaggcgaatggaagtgtaactaatgtcaccagcctgtgtgtgcaagcaagacaattggctttattctacaagtacactagcctacaaggcttgtacacttattcaaatttggttgagttacaaaattacgactgccctttttcaccacagcagtttaacaatcatctgcagtttgaaactttgtgtttttatgtgagcccagctgtggcaggttgtaagtggtcgttagttcattacaacaggtggcgtacccagtttgccactatcactgtttcttacaaggatggtactatgatcactactatgccaaaagcacagttgggttttcaagacatatctgttttggtaaaagatgagtgcactgattataatatatatggacttcaaggcacaggcattattagaaaaaccacctcaacattagtggcaggcctttactacacatcctctagtggtgaccttcttgcttttaaaaatagtattaatggtgatattttcaccgtagtgccatgtgatttaacagcacaagcagctgtgattaatgatgaaatagtgggagttataacagccgttaatcaaactgatctgtttgagtttgtaaatcacacgagtataagaagatcacgtagg（seq id no:1）。

9、编码hfc片段的核酸序列如下所示：

10、gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa（seq id no:2）。

11、编码所述信号肽的核酸序列如下所示：

12、atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac（seqid no:3）。

13、编码跨膜结构域的核酸序列如下所示：

14、gctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt（seq id no:4）。

15、在其中一个实施例中，所述猫冠状病毒表面展示dna疫苗还包括免疫学上可接受的载体和/或辅料。

16、本发明还提供了所述猫冠状病毒表面展示dna疫苗中编码猫冠状病毒抗原融合蛋白的核酸。

17、在其中一个实施例中，所述核酸经哺乳动物细胞偏好性密码子优化。

18、在其中一个实施例中，所述核酸的序列如seq id no:5所示。

19、atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcccgggatccgcggaatgatgttgttactatttgcacttcttaccattgctaggtctgaagatgcgcctcatggtgtaaccctaccgcaattcaatacctcttctaacaatcccaagtttgaacttaatttctacaatttcttacaaacttgggacataccaccacacacagagactgttctgggcggttatctaccatattgtggagcaggtgataattgtgggtggtacaactttgtctacagtcacaatgttggagctaatgccaagtactcatatataaacacacaaaaccttaacataccgaatgtccatggtgtctactttgacgtgagagagcatgattctgatggtgtgtgggacgaacgtgacaaagttggcttactgattgctatacatggtaactcaccttatagcttgctcatggttttgcaagataatgtaaaagaaaatgagcctcacgttgccgttaaaatttgccattggaaatcaggtaacataagtactcttcatagttttactgttgacctaggagatagaggccaatgcgtgtttaatcgaagattctcattagacactgtactgacaactaatgacttttatggctttcaatggactgacacttacgtggacatttaccttggtggcactattacaaaagtatgggttaagaatgattggagtgttgtcgaagctagcatttcgtaccactggaatatacaatttgttaaccgcaccacttactatgcttacaatagtactggtggttcaaattacacacatctgcagttatcagagtgccatagtgattattgtgctggctatgctaagaacgtctttgtgccaattgatggtaagataccagaaagcttttcttttagtaactggtttctgttatcagataaatccactttagtgcaaggacgtgttcttagtagtcaacctgtttttgtacaatgccttaggcctgtaccttcatggtctaataatactgctgtggtgtattttaaaaacgacgtcttctgccctaacgtcacggcagatgttttgaggttcaatttaaattttagtgacactggtgtctatacagattcagctaatgatgaccagttttattttacatttgaagataacacaactgcatccatagcttgttatagcagtgctaatgttactgatttccagcctgcgaacaatagtgtttcccacattccatttgaccaaactgcgcattcttacttctgttttgccaacttttctcactctgttatgagtagacagtttttgggcatacttccaccaattgtccgagagtttgcattcagtagagacggatccatttttgttaacggctataaatatttcagtttaccacccattaagagtgtcaatttctccattagatcagttgagcagtatggtttttggaccatagcttacaccaactacacggatgtaatggtggatgttaatggcacgggtattactagattattctattgtgactcacccctcaatagaattaagtgtcagcaattgaagcatgagttaccggacggtttttattctgctatcatgctcgtcaaaaaggatttacctaagacatttgtaactatgccacaattttacaatttgatgaatgtcacactacacgtcgtgttgaacgatactgaaaagggggctgacatcatcttggctaaggcaccagagctagcatcacttgctgacatacattttgaaatagttcaggcgaatggaagtgtaactaatgtcaccagcctgtgtgtgcaagcaagacaattggctttattctacaagtacactagcctacaaggcttgtacacttattcaaatttggttgagttacaaaattacgactgccctttttcaccacagcagtttaacaatcatctgcagtttgaaactttgtgtttttatgtgagcccagctgtggcaggttgtaagtggtcgttagttcattacaacaggtggcgtacccagtttgccactatcactgtttcttacaaggatggtactatgatcactactatgccaaaagcacagttgggttttcaagacatatctgttttggtaaaagatgagtgcactgattataatatatatggacttcaaggcacaggcattattagaaaaaccacctcaacattagtggcaggcctttactacacatcctctagtggtgaccttcttgcttttaaaaatagtattaatggtgatattttcaccgtagtgccatgtgatttaacagcacaagcagctgtgattaatgatgaaatagtgggagttataacagccgttaatcaaactgatctgtttgagtttgtaaatcacacgagtataagaagatcacgtaggaagcttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggcggcggcggcagccatcatcatcatcatcatccgcggctgcaggtcgacgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt（seq id no:5）。

20、本发明还提供了一种重组质粒，包括所述的核酸，所述重组质粒的质粒载体为真核表达质粒pcaggs。

21、在其中一个实施例中，所述质粒载体包括启动子、增强子、转录终止元件和多聚腺苷酸化信号序列。

22、在其中一个实施例中，所述启动子的序列如seq id no:6所示，所述增强子的序列如seq id no:7所示，所述转录终止元件的序列如seq id no:8所示，所述多聚腺苷酸化信号序列如seq id no:9所示。

23、启动子为chicken β-actin启动子，序列如下所示：

24、tcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggccccccccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg（seq id no:6）。

25、增强子为cmv enhancer，序列如下所示：

26、gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg（seq id no:7）。

27、转录终止元件为poly(a) signal，序列如下所示：

28、cggcaataaaaagacagaataaaacgcacgggtgttgggtcgtttgttc（seq id no:8）。

29、多聚腺苷酸化信号序列为cap binding site，如下所示：

30、atgagtgagctaactcacatta（seq id no:9）。

31、本发明还提供了所述重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

32、步骤1：根据猫冠状病毒s1基因序列构建融合表达区域，所述融合表达区域包含依次连接的信号肽序列、s1编码序列、hfc编码序列和跨膜结构域编码序列；

33、步骤2：将所述融合表达区域克隆至真核表达载体中，获得重组质粒；

34、步骤3：将所述重组质粒转化至感受态细胞中，筛选阳性克隆，经测序验证后提取质粒，得到所述重组质粒。

35、在其中一个实施例中，所述步骤2中采用的限制性内切酶位点为bamhi和hindiii；所述阳性克隆的筛选方式包括抗性筛选、菌落pcr筛选和测序验证中的一种或多种。

36、更进一步地，所述重组质粒经宿主细胞摄取并表达后，编码的融合蛋白以跨膜锚定形式稳定定位于细胞膜表面，从而实现s1抗原的表面展示。鉴于s1蛋白为复杂糖蛋白片段，其免疫原性与正确折叠、糖基化及空间呈递方式密切相关，且仅依赖病毒自身信号肽表达时易出现分泌效率与表面呈递不足的问题，本发明在s1的n端引入外源信号肽以提高分泌转运与膜外侧呈递效率；同时在s1的c端特定位置连接hfc片段以促使抗原二聚化并提高表面抗原密度；并在hfc片段之后连接跨膜结构域以限定融合蛋白的膜拓扑与空间结构，从而更接近病毒刺突蛋白相关的表面呈递形式。通过上述特定构型的协同设计，可获得稳定的细胞膜表面展示并增强免疫系统对所述s1抗原的识别，从而有利于诱导针对猫冠状病毒的免疫应答。

37、本发明还提供了所述的核酸或所述的重组质粒在制备用于预防猫冠状病毒的dna疫苗中的应用。

38、在其中一个实施例中，所述用于预防猫冠状病毒的dna疫苗可通过肌内注射进行免疫。

39、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

40、本发明通过在猫冠状病毒s1抗原的n端引入信号肽，并在其c端引入跨膜结构域，使所述融合蛋白能够进入分泌转运途径并锚定于宿主细胞膜表面，从而实现目的抗原的表面展示。相较于常规胞内表达方式，本发明有利于提高抗原在细胞表面的暴露水平，增强抗原与免疫系统的接触机会，提高抗原识别与递呈效率，进而有利于提升dna疫苗的免疫效果。

41、本发明通过在猫冠状病毒s1抗原的c端融合hfc片段，可促进所述融合抗原形成二聚体结构，从而提高抗原构象稳定性、体内稳定性及免疫原性；同时，hfc片段还有利于增强抗原递呈作用，提高机体对所述抗原的免疫应答水平。由此，本发明所提供的表面展示型dna疫苗有利于诱导体液免疫应答，并有助于激活细胞免疫相关应答有利于诱导更强的特异性体液免疫和细胞免疫反应。

42、本发明将信号肽、猫冠状病毒s1抗原、hfc片段和跨膜结构域进行融合设计，使所述构建兼具抗原有效转运、膜表面锚定及免疫原性增强等功能，优化了猫冠状病毒dna疫苗中抗原的表达形式和呈递方式。该技术方案设计合理、构建明确，能够为猫冠状病毒感染相关疾病的预防提供一种新的dna疫苗构建策略，具有良好的研发价值和应用前景。