香豆素衍生物及其药物组合物在制备抗日本脑炎病毒药物中的应用

本发明涉及生物医药与抗病毒药物，具体涉及一种香豆素衍生物及其药物组合物在制备抗日本脑炎病毒药物中的应用。

背景技术：

1、日本脑炎病毒（japanese encephalitis virus，jev，又称流行性乙型脑炎病毒）属于黄病毒科（flaviviridae）黄病毒属，是一种极为重要且危害巨大的蚊媒传播（主要由三带喙库蚊传播）嗜神经性病毒。jev是引起流行性乙型脑炎（简称乙脑）的病原体，主要流行于亚洲及西太平洋地区。临床上，jev感染可导致患者出现高热、抽搐、意识障碍、脑膜刺激征以及急性脑炎等严重症状。统计表明，乙脑的病死率高达20%-30%，且高达30%-50%的幸存者会留有永久性的神经系统后遗症，如认知障碍、运动功能瘫痪、癫痫及语言障碍等。针对已经感染jev并出现临床症状的患者，目前国内外临床上尚无任何获得批准的特异性、高效抗 jev治疗药物。

2、天然产物及其衍生物因具有丰富的结构多样性和广泛的生物活性，已成为抗病毒药物研发的重要来源。其中，香豆素类化合物具有抗炎、抗氧化、免疫调节及抗病毒等多种药理作用。已有研究表明，部分香豆素衍生物对一些rna 病毒具有抑制作用，如流感病毒。但不同香豆素衍生物对 jev的抗病毒活性尚缺乏系统研究，也无香豆素衍生物抗jev的报道。

3、硝唑尼特（nitazoxanide，ntz）是一种已获美国fda批准的抗寄生虫药物，其口服进入机体后可被血浆酯酶快速水解脱去乙酰基，代谢生成主要活性产物替唑尼特（tizoxanide，tiz），体内几乎检测不到 ntz 原型药物【broekhuysen j, stockis a, linsrl, de graeve j, rossignol jf. nitazoxanide: pharmacokinetics and metabolismin man. int j clin pharmacol ther. 2000 aug;38(8):387-94.】。近年来，研究证实ntz和tiz都具有广谱抗病毒、抗炎及调控细胞代谢与信号通路的药理活性，ntz在体内是通过代谢成为tiz而发挥药效【rossignol jf. nitazoxanide: a first-in-class broad-spectrum antiviral agent. antiviral res. 2014 oct;110:94-103.】。由于ntz为tiz的前药，一般体外培养细胞无体内代谢酶激活体系，因此，体外细胞水平的药效和机制研究一般直接采用ntz活性代谢产物tiz进行；而体内动物及后续临床转化更适合口服给药、生物利用度更佳的前药ntz【guo s, li f, wang b, zhao y, wang x, wei h, yu k, hai x.analysis of tizoxanide, active metabolite of nitazoxanide, in rat braintissue and plasma by uhplc-ms/ms. biomed chromatogr. 2020 feb;34(2):e4716.】。然而，ntz或tiz 与香豆素类化合物联合抗 jev 感染的作用尚未见报道。双香豆素（dicoumarol，dcm）、硝唑尼特和替唑尼特的结构式如下：

4、

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于如何克服现有技术中针对日本脑炎病毒感染缺乏特异性、高效药物，以及直接作用抗病毒药物易耐药、安全范围较窄等临床瓶颈。

2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

3、本发明提出一种香豆素衍生物在制备抗日本脑炎病毒药物中的应用，所述香豆素衍生物为双香豆素、7-羟基香豆素、香豆素-3-羧酸中的一种或多种。

4、优选的，所述香豆素衍生物能够抑制日本脑炎病毒复制，并降低病毒蛋白表达和病毒rna水平。

5、双香豆素：cas号为66-76-2。

6、7-羟基香豆素：cas号为93-35-6。

7、香豆素-3-羧酸：cas号为531-81-7。

8、优选的，所述药物是以香豆素衍生物作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。

9、优选的，所述剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服剂或注射剂。

10、本发明还提出一种药物组合物，所述药物组合物中的活性成分包括：

11、（1）双香豆素；

12、和

13、（2）硝唑尼特或替唑尼特。

14、优选的，所述药物组合物是以双香豆素、硝唑尼特或替唑尼特作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。

15、优选的，所述剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服剂或注射剂。

16、优选的，所述双香豆素、硝唑尼特或替唑尼特的摩尔比为1:（2~4），进一步优选为1:3。

17、本发明还提出上述药物组合物在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用。

18、优选的，所述药物的功效具体包括：提高jev感染宿主的体内生存率、减缓体重减轻以及减轻中枢神经系统炎症导致的脑组织病理损伤。

19、优选地，体内给药剂量为双香豆素10~50mg/kg，硝唑尼特80~120mg/kg；进一步优选为双香豆素30 mg/kg，硝唑尼特100 mg/kg。

20、本发明还提出上述药物组合物在制备预防和治疗日本脑炎病毒感染导致的流行性乙型脑炎药物中的应用。

21、本发明的有益效果在于：

22、（1）核心天然产物锁定更精准，抗病毒效能具特异性优势：

23、本发明通过系统性的结构差异初筛证实，并非所有香豆素衍生物都具备抗 jev活性，7-hc、dcm和c3ac具备优异的抗jev复制活性，可作为与替唑尼特联合制备抗jev协同增效药物的候选先导化合物。其中双环二聚体结构——双香豆素（dcm）的抗病毒活性最强，其体外抑制 jev 复制的半数抑制浓度ec50达5.714μm，药效显著优于7-hc（ec50= 36.13μm）及 c3ac（ec50= 23.82μm）等单环香豆素衍生物，具有极佳的单药开发前景。

24、（2）发现了特异性协同配伍特征：

25、实验证明，普通的单环香豆素（如 7-hc、c3ac）与广谱抗病毒药替唑尼特联合使用时，无论在蛋白还是mrna水平均未能产生任何叠加或增强效应。然而，本发明将双香豆素与替唑尼特联用时，表现出了显著协同抗病毒增效作用，能显著地降低日本脑炎病毒的 ns3蛋白表达量和 mrna复制水平，能将 jev ns3 mrna转录和蛋白翻译深度压制至接近基线水平，为打破临床上单药疗效瓶颈提供了新路径。

26、（3）体内保护与中枢神经病理逆转效果显著：

27、在balb/c小鼠急性脑炎致死性感染模型中，单药ntz或dcm仅能维持约30% 的终点生存率，而本发明的 dcm+ntz 联合治疗组将存活率大幅提升至50%左右，并能显著延缓死亡发生、稳定发病小鼠体重。同时本发明所述组合物能极其显著地削减jev 诱导的血管周围袖套样改变、微胶质细胞异常增生以及神经元坏死退行性变，实现了对受损脑组织的病理修复与神经保护，具备极高的临床制药转化与产业应用价值。

28、本发明提供了一种双香豆素（dicoumarol，dcm）与硝唑尼特（nitazoxanide，ntz）组成的药物组合物在制备抗日本脑炎病毒药物中的新应用。由于硝唑尼特在体内快速代谢成活性代谢产物替唑尼特（tizoxanide，tiz），双香豆素与硝唑尼特组成的药物组合物中体内发挥药效的活性成分为替唑尼特（tiz）。基于ntz体内快速代谢活化生成活性产物 tiz的药代特征，本发明的体外细胞及分子机制研究采用活性代谢产物tiz进行，而体内动物保护及给药应用采用临床可口服前体药物ntz。本发明公开了双香豆素与硝唑尼特组成的药物组合物不仅在分子和细胞水平上高效抑制 jev 复制，更在动物体内展现出显著提高生存率及逆转中枢神经组织病理损伤的协同保护效应。

29、本发明开发针对 jev 的新型、高效、低毒的香豆素类药物，并探索其与 tiz 联合抗病毒的应用，具有重要的研究价值与临床应用前景。

30、当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。