包含AAV的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及药物领域，尤其涉及包含aav的药物组合物。此外，本发明涉及制备这些药物组合物的方法以及本发明药物组合物的用途。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是细小病毒科(parvovirus)家族的一员，它是小的无包膜病毒，具有4.7 kb至6kb的单链线性dna基因组。aav的生命周期包括潜伏期(aav基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得aav成为用于基因转移的有吸引力的工具(参见cn 106906241 a)。

2、已论证了基于腺相关病毒(aav)的基因递送载体在临床前疾病模型及最近在人临床试验中关于若干疾病靶的前景。由于野生型aav是非致病性的并且与任何已知疾病在病原学上无关，所以基于aav的载体是非常安全的。此外，aav能高效递送基因并且在许多组织中可维持转基因的表达，包括肝脏、肌肉、肺脏、视网膜、以及脑。

3、腺相关病毒的应用前景使得制备合适的aav制剂是合乎需要的。然而，纯化的aav例如aav2病毒颗粒的溶解度是有限的。另外，aav2病毒颗粒容易产生聚集。聚集可能导致多种不利后果，例如导致纯化过程中的损耗和纯化载体制剂测试中的不一致性，影响体内给药后的生物分布，并导致给药后对载体的不利免疫应答等。现有技术例如cn 101018858a对抑制aav病毒颗粒的聚集进行了研究。但是现有技术制剂仍具有各种局限性，例如需要过高的离子强度，aav病毒的溶解度、滴度有待进一步提高等。

4、因此，仍然对改进的aav制剂具有需求。

技术实现思路

1、通过研究，本发明人出乎预料地发现mgcl2能够与aav衣壳蛋白表面的残基结合，在较低浓度下能够避免aav之间形成聚集体，从而稳定aav。可以显著改善包含aav的制剂的性质，例如提高aav的溶解度、滴度、和/或制剂的稳定性、效价等。例如，针对溶解度较低的aav2血清型，mgcl2的添加明显提高了aav病毒的滴度(可提高至1.6e+13 vg/ml)、对aav病毒的聚集有明显抑制效应且使制剂具有良好稳定性(例如参见表14-19)。基于此，本发明提供了相对于现有药物组合物而言具有改善性质的药物组合物。

2、一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含

3、(i) aav；

4、(ii) 约1 mm至约50 mm的缓冲剂；

5、(iii) 约0.1 mm至约10 mm的第一种药学上可接受的盐，该药学上可接受的盐为mgcl2；

6、(iv) 约50 mm至约250 mm的另外的药学上可接受的盐；

7、(v) 约0.0002% (w/v)至约0.01% (w/v)的非离子表面活性剂；和

8、(vi) 约0.2% (w/v)至约10% (w/v)的糖。

9、在一些实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷，优选组氨酸，更优选l-组氨酸。

10、cn 101018858a的研究表明组氨酸对aav病毒的聚集没有抑制效应(见cn101018858a说明书第8页的表1)。然而，本发明人发现组氨酸因其含有咪唑基团，在ph 5～8的范围内能起到较好的ph 缓冲作用，明显改善了高浓度aav易聚集、易吸附的问题，显著提高了aav的滴度。

11、在一些实施方案中，所述另外的药学上可接受的盐选自药学上可接受的钠盐、铵盐或钾盐，优选氯化钠。

12、在一些实施方案中，所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆，优选泊洛沙姆-188。

13、在一些实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖或其组合；优选蔗糖。

14、cn 101018858a的研究表明蔗糖对aav病毒的聚集没有抑制效应(见cn101018858a说明书第8页的表1)。然而，本发明人发现糖(尤其蔗糖)能与aav的衣壳蛋白发生相互作用，抑制aav与溶剂之间的自由能交换，降低aav的聚集；且糖类在冻存过程中不宜形成结晶，因此糖类赋形剂可稳定aav构象。

15、在一些实施方案中，所述aav选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10，优选aav2。

16、在一些实施方案中，所述药物组合物中的缓冲剂的浓度为约1 mm至约50 mm、约5mm至约25mm、约6mm至约20mm、或约8mm至约15mm，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm，优选约10mm。

17、在一些实施方案中，所述药物组合物中的第一种药学上可接受的盐的浓度为约0.1 mm至约10 mm、约0.2 mm至约5 mm、约0.5 mm至约2 mm；例如约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 mm，优选约1 mm。

18、在一些实施方案中，所述药物组合物中的另外的药学上可接受的盐的浓度为约50mm至约250 mm、约100 mm至约200 mm、约120 mm至约180mm；例如约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或210 mm，优选约150mm。

19、在一些实施方案中，所述药物组合物中的非离子表面活性剂的浓度为约0.0002%(w/v)至约0.01% (w/v)、约0.0005% (w/v)至约0.005% (w/v)、约0.001% (w/v)至约0.003%(w/v)；例如约0.0002%、0.0003%、0.0004%、0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%或0.01% (w/v)，优选约0.002% (w/v)。

20、在一些实施方案中，所述药物组合物中的糖的浓度为约0.2% (w/v)至约10% (w/v)、约0.5% (w/v)至约8% (w/v)、约1% (w/v)至约5% (w/v)；例如约0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% (w/v)，优选约2% (w/v)。

21、在一些实施方案中，所述药物组合物具有约6.0-8.0的ph，例如约6.5-7.8的ph，约7.0-7.5，例如约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的ph。

22、在一些实施方案中，所述药物组合物包含介于1.0e+10(vg/ml)至1.0e+15(vg/ml)的aav粒子，例如1.0e+11(vg/ml)至1.0e+13(vg/ml)、1.0e+12(vg/ml)至1.0e+14(vg/ml)，例如1.0e+10(vg/ml)、1.0e+11(vg/ml)、1.0e+12(vg/ml)、1.0e+13(vg/ml)、1.0e+14(vg/ml)、1.0e+15(vg/ml)的aav粒子。

23、在一些实施方案中，所述aav粒子的含量是ddpcr或qpcr滴度。

24、在一些实施方案中，所述药物组合物是液体制剂，优选地还包含溶媒，例如可注射溶媒，包括水、优选注射用水。

25、在一些实施方案中，所述药物组合物是注射剂。

26、在一些实施方案中，所述药物组合物包含以下组分或由其组成：

27、(i) aav；

28、(ii) 约10 mm的组氨酸；

29、(iii) 约1 mm的mgcl2；

30、(iv) 约150 mm的nacl；

31、(v) 约0.002% (w/v)的泊洛沙姆188；

32、(vi) 约2% (w/v)的蔗糖；和

33、(vii) 水。

34、在一些实施方案中，本发明的药物组合物具有为约200至约400 mosm/kg、约250至约380 mosm/kg或约290至约350 mosm/kg的渗透压。在某些实施方案中，本发明的药物组合物将具有以下的渗透压例如约200 mosm/kg、约210 mosm/kg、约220 mosm/kg、约230 mosm/kg、约240 mosm/kg、约250 mosm/kg、约260 mosm/kg、约270 mosm/kg、约280 mosm/kg、约290 mosm/kg、约300 mosm/kg、约310 mosm/kg、约320 mosm/kg、约330 mosm/kg、约340mosm/kg、约350 mosm/kg、约360 mosm/kg、约370 mosm/kg、约380 mosm/kg、约390 mosm/kg或约400 mosm/kg。

35、在一些实施方案中，所述药物组合物是由所述液体制剂冻干而获得的固体制剂。

36、可在使用前，将该固体制剂重构于适当的上述溶媒中，形成本发明的液体制剂。

37、在一些实施方案中，本发明的药物组合物在约-80℃至约45℃、约-20℃至约25℃、约20℃至约40℃，例如约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约42℃或约45℃的条件下储存至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、3年、4年或更长时间后，基因组滴度降低不超过1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%或30%，和/或aav活性保持100%、或99%以上、或98%以上、或97%以上、或96%以上、或95%以上、或94%以上、或93%以上、或92%以上、或91%以上、或90%以上、或85%以上、或80%以上、或75%以上。

38、在一些实施方案中，本发明的药物组合物在冻融多次例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或40次后保持稳定，例如基因组滴度降低不超过1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%或30%，和/或aav活性保持100%、或99%以上、或98%以上、或97%以上、或96%以上、或95%以上、或94%以上、或93%以上、或92%以上、或91%以上、或90%以上、或85%以上、或80%以上、或75%以上。

39、另一方面，本发明提供了制备上述药物组合物的方法，其包括以下步骤：

40、(i) 提供aav样品；

41、(ii) 通过超滤用缓冲液对aav样品进行换液，所述缓冲液包含上述药物组合物除aav之外的组分；和

42、(iii) 通过离心浓缩步骤(ii)得到的产品，提供所述药物组合物。

43、另一方面，本发明提供本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗眼科疾病、中枢神经疾病以及血液疾病等的药物中的用途。

44、在一些实施方案中，所述眼科疾病是基因突变相关的视网膜变性。

45、另一方面，本发明提供一种在有需要的受试者中预防或治疗眼科疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的药物组合物。

46、在一些实施方案中，所述眼科疾病是基因突变相关的视网膜变性。

47、在一些实施方案中，所述施用是视网膜下施用。

48、在一些实施方案中，以有效量例如治疗有效量或预防有效量施用本发明的药物组合物。

49、另一方面，本发明提供了如下实施方案:

50、1. 一种药物组合物，其包含

51、(i) aav；

52、(ii) 约1 mm至约50 mm的缓冲剂；

53、(iii) 约0.1 mm至约10 mm的第一种药学上可接受的盐，该药学上可接受的盐为mgcl2；

54、(iv) 约50 mm至约250 mm的另外的药学上可接受的盐；

55、(v) 约0.0002% (w/v)至约0.01% (w/v)的非离子表面活性剂；和

56、(vi) 约0.2% (w/v)至约10% (w/v)的糖。

57、2. 实施方案1所述的药物组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷，优选组氨酸，更优选l-组氨酸。

58、3. 实施方案1或2所述的药物组合物，其中所述另外的药学上可接受的盐选自药学上可接受的钠盐、铵盐或钾盐，优选氯化钠。

59、4 . 实施方案1-3中任何一项所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆，优选泊洛沙姆-188。

60、5 . 实施方案1-4中任何一项所述的药物组合物，其中所述糖选自蔗糖、海藻糖或其组合；优选蔗糖。

61、6 . 实施方案1-5中任何一项所述的药物组合物，其中所述aav选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10，优选aav2。

62、7 . 实施方案1-6中任何一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约5mm至约25mm、或约8mm至约15mm。

63、8 . 实施方案1-7中任何一项所述的药物组合物，其中所述第一种药学上可接受的盐的浓度为约0.2 mm至约5 mm或约0.5 mm至约2 mm。

64、9 . 实施方案1-8中任何一项所述的药物组合物，其中所述另外的药学上可接受的盐的浓度为约100 mm至约200 mm、或约120 mm至约180mm。

65、10 . 实施方案1-9中任何一项所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂的浓度为约0.0005% (w/v)至约0.005% (w/v)或约0.001% (w/v)至约0.003% (w/v)。

66、11 . 实施方案1-10中任何一项所述的药物组合物，其中所述糖的浓度为约0.5%(w/v)至约8% (w/v)或约1% (w/v)至约5% (w/v)。

67、12 . 实施方案1-11中任何一项所述的药物组合物，其具有约6.0-8.0的ph，例如约6.5-7.8的ph。

68、13 . 实施方案1-12中任何一项所述的药物组合物，其包含介于1.0e+10(vg/ml)至1.0e+15(vg/ml)的aav粒子，例如1.0e+12(vg/ml)至1.0e+14(vg/ml)的aav粒子。

69、14 . 实施方案1-13中任何一项所述的药物组合物，其中所述aav粒子的含量是通过ddpcr或qpcr滴度确定的。

70、15 . 实施方案1-14中任何一项所述的药物组合物，其是还包含溶媒优选注射用水的液体制剂。

71、16 . 实施方案1-15中任何一项所述的药物组合物，其是注射剂。

72、17. 实施方案1-16中任何一项所述的药物组合物，其包含以下组分或由其组成：

73、(i) aav；

74、(ii) 约10 mm的组氨酸；

75、(iii) 约1 mm的mgcl2；

76、(iv) 约150 mm的nacl；

77、(v) 约0.002% (w/v)的泊洛沙姆188；

78、(vi) 约2% (w/v)的蔗糖；和

79、(vii) 水。

80、18. 实施方案1-17中任何一项所述的药物组合物，其具有为约200至约400 mosm/kg、或约290至约350 mosm/kg的渗透压。

81、19. 通过冻干实施方案1-18中任何一项所述的药物组合物而获得的固体制剂。

82、20.制备实施方案1-18中任何一项所述的药物组合物的方法，其包括以下步骤：

83、(i) 提供aav样品；

84、(ii) 通过超滤用缓冲液对aav样品进行换液，所述缓冲液包含实施方案1-18之一所述药物组合物的除aav之外的组分；和

85、(iii) 通过离心浓缩步骤(ii)得到的产品，提供药物组合物。

86、21. 实施方案1-18中任何一项所述药物组合物在制备用于预防或治疗眼科疾病、中枢神经疾病以及血液疾病等的药物中的用途。

87、22. 权利要求21所述的用途，其中所述眼科疾病是基因突变相关的视网膜变性。

88、定义：

89、本发明中所使用的术语具有如下所列定义。如果在文中没有给出定义，则本发明中所使用的术语具有本领域所通常理解的含义。

90、为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

91、如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或更多项。

92、如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，药物组合物“包含”成分a、b和c，也旨在涵盖由该成分a、b和c组成的药物组合物。

93、“aav”是指腺相关病毒，其可用于指病毒本身或其变体、衍生物，并可以是天然存在的或重组形式的。术语“aav”包括1型aav(aav-1)、2型aav(aav-2)、3型aav(aav-3)、4型aav(aav-4)、5型aav(aav-5)、6型aav(aav-6)、7型aav(aav-7)、8型aav(aav-8)、9型aav(aav-9)、犬aav、绵羊aav、牛aav、马aav和灵长类aav，及其变体、衍生物。腺相关病毒是现有技术已知的，还可例如参见 g .gao等人，proc natl acad sci usa, 100(10):6081-6086(2003年5月13日)；us-2003-0138772-a1 (2003年7月24日)，国际专利公开号wo 2005/033321，优选的中国专利申请201910736573.3等，通过参引将其以全部内容引入本技术中。优选地，aav是aav-2。典型地，本发明药物组合物包含介于1.0e+10(vg/ml)至1.0e+15(vg/ml)的aav粒子，例如1.0e+11(vg/ml)至1.0e+13(vg/ml)、1.0e+12(vg/ml)至1.0e+14(vg/ml)，例如1.0e+10(vg/ml)、1.0e+11(vg/ml)、1.0e+12(vg/ml)、1.0e+13(vg/ml)、1.0e+14(vg/ml)、1.0e+15(vg/ml)的aav粒子。

94、术语“药学上可接受的盐”是指可以用于医药用途的盐，其在施用于受试者时是生理上耐受的并且通常不产生不良反应。术语“药学上可接受的”包括但不限于金属盐，如钠盐、钾盐和铯盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；有机胺盐如三乙胺盐、三甲胺盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、胍盐、二异丙基乙胺盐和n,n'-二苄基乙二胺盐。药学上可接受的盐的选择和使用是本领域熟知的。

95、药学上可接受的盐的非限制性实例包括但不限于：钠盐、铵盐、钾盐(例如氯化钠、氯化铵和氯化钾；乙酸钠、乙酸铵和乙酸钾；柠檬酸钠、柠檬酸铵和柠檬酸钾；磷酸钠、磷酸铵和磷酸钾；氟化钠、氟化铵和氟化钾；溴化钠、溴化铵和溴化钾；以及碘化钠、碘化铵和碘化钾)。

96、术语“另外的药学上可接受的盐”是指除氯化镁之外的药学上可接受的盐。所述药物组合物中的另外的药学上可接受的盐的浓度为约50 mm至约250 mm、约100 mm至约200mm、约120 mm至约180mm；例如约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或210 mm。

97、术语“治疗"指改善疾病或病症(即阻止或减缓疾病或其至少一种临床症状的发展)。此外，“治疗”还可指改善至少一种身体参数，其可能不为患者所察觉。另外，“治疗”还可指身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。

98、术语“预防”是指对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。

99、术语“有效量”指本发明的药物组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体活性成分；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

100、术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。本发明的药物组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和具体的活性成分而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中药物组合物的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用。

101、术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量通常将小于治疗有效量。

102、术语“受试者”是指患有或易患疾病或病症的哺乳动物，包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。优选地，受试者是人。

103、术语“缓冲剂”是指适用于施用至受试者的能使ph值保持稳定的物质。优选地，缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷。缓冲剂在本发明药物组合物中的浓度为约1 mm至约50 mm、约5mm至约25mm、约6mm至约20mm、或约8mm至约150mm，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm。

104、如文中所述，“非离子表面活性剂”是指加入少量后，能使溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，并且其为非离子型的。优选地，非离子表面活性剂是泊洛沙姆，优选泊洛沙姆-188等。非离子表面活性剂在药物组合物中的浓度为例如约0.0002% (w/v)至约0.01% (w/v)、约0.0005% (w/v)至约0.005% (w/v)、约0.001% (w/v)至约0.003% (w/v)；例如约0.0002%、0.0003%、0.0004%、0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%或0.01% (w/v)。

105、如文中所用，术语“溶媒”是指用于溶解或悬浮活性成分(例如aav)和非活性成分以形成液体制剂的液体。术语“可注射溶媒”是指适用于注射或输注受试者体内的溶媒。可用于本发明的溶媒包括但不限于水例如注射用水、注射用有机溶剂包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。

106、如文中所用，术语“糖”包括但不限于蔗糖、海藻糖或其组合。本发明药物组合物中的糖的浓度为约0.2% (w/v)至约10% (w/v)、约0.5% (w/v)至约8% (w/v)、约1% (w/v)至约5% (w/v)；例如约0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% (w/v)。

107、术语“基因组滴度”是例如ddpcr或qpcr滴度。

108、术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10%的下限和比指定数字数值大10%的上限的范围内的数字数值。

109、如文中所用，“w/v”是指“重量/体积”，例如“1%w/v”即为1 g/100 ml = 0.01g/ml= 10 mg/ml。

110、本发明的益处：

111、本发明的药物组合物相对于现有包含aav的药物组合物具有显著改善的性质，例如提高的稳定性、溶解度、滴度、生物利用度和/或效价等。