基于LiP-MS筛选汉黄芩苷作用靶点的方法及应用

本发明属于医药，涉及汉黄芩苷的新适应症用途及作用靶点筛选，尤其涉及一种基于lip-ms筛选汉黄芩苷作用靶点的方法及应用。

背景技术：

1、对乙酰氨基酚（apap）诱导的肝损伤是全球范围内药物性肝损伤（dili）和急性肝衰竭（alf）的主要病因。尽管apap在治疗剂量下是一种广泛使用且总体安全的镇痛镇痛药和解热剂，但过量使用会引发严重肝毒性。其潜在机制涉及细胞色素p450介导的代谢过程，主要通过cyp2e1将apap转化为高反应性代谢物n-乙酰对苯醌亚胺（napqi）。正常情况下，napqi通过与谷胱甘肽（gsh）结合实现解毒，但apap过量会耗竭肝脏gsh储备，导致napqi蓄积。这会导致与线粒体蛋白共价结合、电子传递链破坏、活性氧（ros）过度生成、核dna损伤，最终引发中央小叶肝细胞大范围坏死。随后由库普弗细胞活化及外周免疫细胞浸润所引发的无菌性炎症反应，会根据微环境背景促进组织修复或加重损伤。目前，n-乙酰半胱氨酸（nac）仍是唯一获批的解毒剂，其作用机制为谷胱甘肽（gsh）前体物质；然而其疗效具有显著时间依赖性，仅在过量用药后8小时内给药时才能获得最佳效果。鉴于nac的局限性及对乙酰氨基酚相关急性肝衰竭（alf）发病率的上升趋势，亟需发现新的治疗靶点和药物。

2、近年来，天然产物因其多靶点作用特性、低毒性及优异生物相容性，已成为肝保护药物研发的重要来源。黄芩（

scutellaria baicalensis georgi）作为传统中药中具有清热解毒功效的药材，其治疗黄疸等病症的记载可追溯至《本草纲目》。现代药理学研究证实，黄芩提取物具有显著的抗炎、抗氧化及肝保护作用。其中汉黄芩苷（

scutellaria

baicalensis中黄芩苷的糖苷形式，wgs）被报道具有抗炎、抗肿瘤及神经保护等多种药理活性。然而，关于汉黄芩苷肝保护潜力的研究仍较为有限，其作用机制尚未完全阐明，其在药物性肝损伤（dili）和急性肝衰竭（alf）中是否其作用也未可知。鉴于该成分在黄芩中的高含量，我们推测汉黄芩苷可能通过不同的分子机制发挥肝保护作用。为此，本发明旨在提供一种基于lip-ms方法筛选的汉黄芩苷作用靶点及应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种基于lip-ms技术筛选的汉黄芩苷作用靶点及应用。

2、本发明采用基于肽段的非标记药物靶标分析方法，提取汉黄芩苷干预下的hepg2细胞总蛋白，用proteinase k进行限制性酶解，比较对照组和药物处理组肽段图谱的变化，筛选出汉黄芩苷处理组中专属性的“构象保持肽段”，通过数据库匹配鉴定汉黄芩苷抑制hepg2细胞的靶标蛋白。进一步，通过动物模型实验和靶点敲低实验对于汉黄岑苷的肝损伤修复作用以及作用靶点进行验证。

3、基于上述研究，本发明所采用的技术方案如下：

4、本发明第一方面，提供了汉黄芩苷在制备药物诱导的急性肝损伤缓解药物中的应用。

5、优选的，所述药物诱导的急性肝损伤为对乙酰氨基酚（apap）诱导的急性肝损伤。

6、优选的，所述急性肝损伤包括药物性肝损伤（dili）和急性肝衰竭（alf）。

7、本发明通过实验证实了汉黄芩苷具有改善药物诱导的急性肝损伤的作用，如下：在向实验小鼠内注射对乙酰氨基酚前先预防性给予不同剂量的汉黄芩苷，然后进行组织学检测和血清生化指标检测，结果显示汉黄芩苷能有效改善肝组织胶原沉积和纤维化程度，同时显著降低对乙酰氨基酚诱导的ast和alt水平。

8、进一步，所述药物可以为以汉黄芩苷为唯一活性组分的药物，也可以为富含汉黄芩苷的药物。汉黄芩苷主要来源于中药黄芩，因此富含它的药物也主要集中在含黄芩的中成药里。

9、本发明第二方面，提供了一种基于lip-ms筛选汉黄芩苷作用靶点的方法，包括如下步骤：

10、s1.天然构象蛋白提取：将目标细胞进行培养，待细胞密度达80%后，使用pbs洗涤细胞，并加入pbs刮取细胞，以1000g离心10~15分钟收集细胞；将细胞沉淀重悬于新鲜配制的含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中，在冰上裂解30分钟后，12,000g离心10~20分钟，并测定上清液中蛋白质浓度；

11、s2.限制性蛋白酶解：将汉黄芩苷储备液用dmso稀释，制备成单剂量组和多剂量组；将等量蛋白质分装至ep管中，并加入汉黄芩苷溶液或dmso，混合后于25℃孵育，然后加入蛋白酶k于25℃孵育，98℃加热2~4分钟使酶反应终止；加入等体积10%脱氧胆酸钠，98℃加热8~12分钟，加入tcep和碘乙酰胺完成蛋白还原烷基化；随后进行胰蛋白酶消化，甲酸沉淀脱氧胆酸钠，18,000g离心，收集上清液进行脱盐浓缩；

12、s3.质谱分析：复溶肽段，基于数据非依赖性采集方法进行数据采集，并进行肽段定性和定量分析；

13、s4.潜在靶标筛选：设置阈值，差异倍数foldchange > 4， p < 0.01，进行肽段差异分析并基于kegg富集，对差异蛋白的富集通路进行确定；

14、s5.药物响应的剂量依赖性分析：对三羧酸循环通路的肽段进行剂量依赖性分析，发现pdha1具有显著的剂量依赖性，筛选得到汉黄芩苷潜在结合靶点。

15、优选的，s1中，所述目标细胞选自hepg2细胞；

16、s3中，使用analyst® 1.7 进行数据采集，使用spectronaut (v.15.3)进行肽段定性和定量分析。

17、s5中，通过药物响应的剂量依赖性分析发现pdha1具有显著的剂量依赖性，是汉黄芩苷潜在结合靶点。进一步基于生物膜干涉技术，发现汉黄芩苷与pdha1的亲和力kd值为16.4µm，具有较强的亲和力。

18、基于上述分析，本发明第三方面，提供了pdha1作为汉黄芩苷作用靶点的衍生应用。其他以pdha1作为靶点且对于缓解急性肝损伤有效的物质，可用于作为汉黄芩苷的辅助剂。

19、本发明第四方面，提供了一种药物诱导的急性肝损伤缓解治疗剂，选自如下任一情形：（1）以汉黄芩苷或富含汉黄芩苷的药物组合物作为活性组分；（2）富含汉黄芩苷的药物组合物和其他以pdha1作为靶点且对于缓解急性肝损伤有效的物质联合作为活性组分。

20、发明的作用与效果

21、本发明首次采用lip-ms方法，筛选出汉黄芩苷的结合靶标pdha1，并在体内外水平评估汉黄芩苷对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤的保护效应，进而对靶标进行敲低后，体外评估汉黄芩苷依赖靶标pdha1改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤效应。为汉黄芩苷缓解药物诱导急性肝损伤提供了新的参考。

1.汉黄芩苷或富含汉黄芩苷的药物组合物在制备药物诱导的急性肝损伤缓解药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物诱导的急性肝损伤为对乙酰氨基酚（apap）诱导的急性肝损伤。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述急性肝损伤包括药物性肝损伤（dili）和急性肝衰竭（alf）。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述缓解药物为以汉黄芩苷为唯一活性组分的药物，或者为富含汉黄芩苷的药物。

5.一种基于lip-ms筛选汉黄芩苷作用靶点的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的基于lip-ms筛选汉黄芩苷作用靶点的方法，其特征在于，s1中，所述目标细胞选自hepg2细胞；

7.根据权利要求5所述的基于lip-ms筛选汉黄芩苷作用靶点的方法，其特征在于，筛选得到的汉黄芩苷结合靶点为pdha1。

8.一种药物诱导的急性肝损伤缓解治疗剂，其特征在于，（1）以汉黄芩苷或富含汉黄芩苷的药物组合物作为活性组分；（2）富含汉黄芩苷的药物组合物和其他以pdha1作为靶点且对于缓解急性肝损伤有效的物质联合作为活性组分。