一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料及其制备方法和应用

本发明涉及纳米医药，尤其涉及一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、动静脉瘘（avf）是维持性血液透析患者最常用的血管通路之一，其成熟和长期通畅依赖于血管内皮完整性、局部炎症反应控制以及血管重构过程的协调。avf建立后，吻合口及近端静脉长期暴露于高流量、高剪切力和反复穿刺刺激环境中，易发生内皮细胞损伤、补体激活、氧化应激增强、炎症细胞浸润以及新生内膜增生，最终导致血管狭窄、成熟失败或通路失功。在avf局部病理微环境中，活性氧（ros）过度产生可导致内皮细胞线粒体损伤、脂质过氧化、一氧化氮生物利用度下降和细胞凋亡增加；与此同时，补体系统激活所产生的c5a可通过c5ar1等受体促进中性粒细胞和单核/巨噬细胞募集，放大炎症反应并进一步加重内皮损伤。因此，针对avf内皮修复，单纯抗氧化或单纯抗炎策略往往难以满足病灶局部复杂微环境的治疗需求。

2、普鲁士蓝纳米颗粒（pb nps）具有良好的生物相容性和类酶抗氧化能力，可通过模拟过氧化氢酶、过氧化物酶或超氧化物歧化酶样活性清除多种ros。4-oi（4-辛基衣康酸酯）作为衣康酸衍生物，可调控nrf2等抗氧化/抗炎相关通路，抑制炎症因子释放并缓解氧化应激损伤。ac5a核酸适配体可特异性结合c5a分子，通过竞争性阻断c5a与其受体结合而抑制补体炎症级联反应，利用c5a在炎症区域富集的特点实现病灶锚定。

3、然而，现有技术仍存在靶向性不足、治疗机制单一、纳米载体表面稳定性和生物相容性欠佳，以及缺乏面向c5a炎症微环境的精准锚定策略等缺陷。具体而言，现有抗氧化或抗炎药物多为全身分布，难以在avf吻合口及损伤内皮区域有效富集，导致病灶局部有效浓度不足；传统药物多仅针对炎症或氧化应激的某一环节，无法同时覆盖ros爆发、补体激活和内皮功能障碍等关键病理事件；未修饰或弱修饰的无机纳米颗粒在血液中易聚集、蛋白吸附和被网状内皮系统清除，限制其在avf局部的持续作用；现有材料多以内皮细胞或损伤组织非特异性摄取为主，缺乏对补体激活区域的主动识别和炎症信号阻断功能。

4、因此，亟需开发一种能够同时实现炎症区域靶向、ros清除和补体炎症抑制的多功能纳米复合材料，以促进avf内皮细胞修复。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料及其制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

3、一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料，包括普鲁士蓝纳米颗粒、peg修饰层、ac5a核酸适配体和4-oi；所述peg修饰层包覆于所述普鲁士蓝纳米颗粒表面，所述ac5a核酸适配体接枝于所述peg修饰层，所述4-oi负载于经peg修饰和ac5a核酸适配体接枝后的普鲁士蓝纳米颗粒载体中。

4、具体的，所述peg修饰层包覆于所述普鲁士蓝纳米颗粒表面，所述ac5a核酸适配体通过共价偶联方式接枝于所述peg修饰层，所述4-oi通过物理吸附和/或疏水相互作用负载于经peg修饰和ac5a核酸适配体偶联后的普鲁士蓝纳米颗粒载体中。

5、所述ac5a核酸适配体为末端氨基修饰的ac5a核酸适配体，所述末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的核苷酸序列如seq id no:1所示，具体为tttttttttttttttttttttcttaccagccagttacaaaataaatgaaata。

6、在以上技术方案的基础上，优选的，所述普鲁士蓝纳米颗粒复合材料中，所述末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的负载量为2.45~4.96mg/g。

7、所述末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的负载量采用cy5荧光标记法测定，具体为：采用cy5荧光染料标记ac5a核酸适配体，将其与pb-peg进行偶联反应，反应结束后收集上清液及洗涤液，根据cy5荧光强度-浓度标准曲线测定上清液及洗涤液中未偶联的末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的含量；以反应前末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的总投料量与反应后未偶联末端氨基修饰的ac5a核酸适配体量之差作为实际接枝量，负载量按照实际接枝的末端氨基修饰的ac5a核酸适配体质量与所得普鲁士蓝纳米颗粒复合材料总质量之比计算。

8、在以上技术方案的基础上，优选的，所述普鲁士蓝纳米颗粒的粒径为30-100 nm。

9、本发明还提供一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、将fecl3与k4[fe(cn)6]分别溶解于稀盐酸中，然后在稳定剂存在下缓慢混合，搅拌反应后得到pb nps；

11、s2、将pb nps分散于缓冲液或水相体系中，加入cooh-peg-cooh，经搅拌反应后得到pb-peg；

12、s3、将pb-peg与末端氨基修饰的ac5a核酸适配体进行共价偶联反应，得到ac5a-pb-peg；

13、s4、将ac5a-pb-peg分散于水相体系、有机溶剂-水混合体系或缓冲液中，加入4-oi，避光搅拌孵育，得到ac5a-4-oi@pb-peg。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1中，所述fecl3浓度为0.3-1.0 g/l，所述k4[fe(cn)6]浓度为0.5-2.0 g/l，所述稀盐酸的摩尔浓度为0.01-0.1 mol/l，所述稳定剂浓度为3-20 g/l。

15、具体地，fecl3浓度可选择0.3g/l、0.5g/l、0.8g/l、1.0 g/l，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用；k4[fe(cn)6]浓度可选择0.5g/l、1.0g/l、1.5g/l、2.0 g/l，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用；稀盐酸摩尔浓度可选择0.01mol/l、0.04mol/l、0.07mol/l、0.1 mol/l，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用；稳定剂浓度可选择3g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20 g/l，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用。

16、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1中，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮或柠檬酸盐。

17、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s2中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、mes缓冲液、tris-hcl缓冲液或hepes缓冲液；所述水相体系为去离子水或超纯水；所述cooh-peg-cooh的数均分子量为2000 da；所述pb nps与cooh-peg-cooh的质量比为1:1-3。

18、本发明中，所述ac5a核酸适配体是指能够特异性识别并结合补体片段c5a的核酸适配体。所述ac5a核酸适配体可通过与c5a结合，减少c5a与其受体的相互作用，从而抑制c5a介导的补体炎症级联反应；同时，可利用炎症区域c5a水平升高的特点发挥病灶识别和靶向作用。

19、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3中，所述pb-peg与末端氨基修饰的ac5a核酸适配体的质量比为300-150:1。

20、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s4中，所述水相体系为去离子水或超纯水；所述有机溶剂-水混合体系中的有机溶剂为二甲基亚砜、乙醇、甲醇或丙酮；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、mes缓冲液、tris-hcl缓冲液或hepes缓冲液。

21、本发明还提供了一种普鲁士蓝纳米颗粒复合材料在制备治疗动静脉瘘的药物中的应用。

22、在以上技术方案的基础上，优选的，所述普鲁士蓝纳米颗粒复合材料可通过局部给药或静脉给药方式用于avf内皮损伤修复。局部给药时，可在c57bl/6j小鼠avf手术完成后，将普鲁士蓝纳米颗粒复合材料悬液或普鲁士蓝纳米颗粒复合材料-生物相容性凝胶药物包覆于吻合口及近端静脉周围；静脉给药时，可经尾静脉注射普鲁士蓝纳米颗粒复合材料悬液，使其通过血液循环到达avf炎症损伤区域。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、（1）本发明通过ac5a核酸适配体实现靶向富集与通路阻断，适配体特异性识别病灶高表达c5a引导载体精准富集在avf炎症损伤部位，克服传统药物全身弥散、患处药量不足的缺陷，还能竞争性阻滞c5a/c5ar结合，从源头遏制补体介导的炎症级联放大。

25、（2）本发明能够实现三重功能协同增效，普鲁士蓝纳米酶原位清除过量ros，负载4-oi经由nrf2通路调控机体抗炎抗氧化水平，搭配ac5a核酸适配体的补体抑制作用，多靶点同步干预氧化应激、过度炎症两大病理问题，相较单一药效组分可更高效保护受损内皮，抑制血管内膜异常增生。

26、（3）本发明通过peg改性优化载体理化与应用性能，peg修饰可减少颗粒聚集和非特异性蛋白吸附，延长体内作用时间，提升作为血管内皮修复材料的安全性，修饰后的普鲁士蓝颗粒血液稳定性、生物相容性大幅提升，不易团聚与被机体清除，且材料给药方式灵活，既能术中局部凝胶包覆瘘口，也可静脉全身给药，体内肝肾、凝血安全性良好，临床转化适用范围更广。