一种内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及医学检验，尤其涉及一种内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、继发性高血压及相关内分泌紊乱的筛查是临床诊断的难点。其中，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（ppgl）、原发性醛固酮增多症（pa）以及库欣综合征（cs）是三类最常见的内分泌性高血压病因。准确测定相关的生物标志物，如儿茶酚胺及其代谢物、盐皮质激素和糖皮质激素，对于上述疾病的早期发现与鉴别诊断具有至关重要的临床意义。

2、目前，临床上针对这三种疾病的检测主要依赖于放射免疫法（ria）或化学发光免疫分析法（clia）。然而，现有技术在实际应用中存在以下显著缺陷：（1）检测特异性不足且易受干扰：传统的免疫分析法极易受到结构类似物的交叉反应干扰。例如，在检测醛固酮时，抗体往往无法有效区分醛固酮及其代谢物；在筛查ppgl时，由于3-甲氧基酪胺（3-mt）、变肾上腺素（mn）与去甲变肾上腺素（nmn）等物质结构高度相似，免疫法难以实现精准区分，从而导致较高的假阳性率。（2）检测流程碎片化，临床效率低下：现有的检测方案通常是“一病一检”，即针对不同的疾病需分别采集血液或尿液样本，并在不同的检测试剂盒或技术平台上完成检测。例如，儿茶酚胺及其代谢物（多巴胺、肾上腺素、香草扁桃酸vma、高香草酸hva等）与类固醇激素（皮质醇、18-羟皮质醇等）往往分为数个批次处理，操作流程冗长，且显著增加了患者的采样负担和医疗成本。（3）样本前处理复杂且误差大：针对质谱检测的现有前处理技术多采用固相萃取（spe）或衍生化操作，步骤繁琐，耗时较长。在处理包含肌酐、皮质醇及多种儿茶酚胺代谢物的复杂尿样或血样时，传统方法难以保证所有目标物都能获得高回收率，且容易引入人工操作误差。（4）缺乏集成化的高通量检测方案：目前临床上缺乏一种能够在一个技术平台上，通过单次样本处理即可覆盖上述三种疾病关键标志物（涵盖从儿茶酚胺类、甾体类到有机酸代谢产物）的集成化试剂盒。这限制了临床对于继发性高血压多病因同步筛查的能力，无法满足精准医疗对于高通量、高特异性联检的需求。

3、因此，如何获得一种能够获得一种能够覆盖上述三种疾病关键标志物的检测试剂盒以及方法成为亟待解决的结束问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明一种内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒及其应用，本发明的试剂盒目的在于克服现有技术中针对继发性高血压相关内分泌疾病检测时存在的特异性不足、极易产生交叉反应干扰、样本处理过程繁琐、以及无法在同一平台上实现多指标同步联检等缺陷。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括样本处理模块和检测模块；所述样本处理模块包括表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠和血管紧张素转换酶抑制剂；所述检测模块包括标准品；所述标准品包括18-羟皮质醇、皮质醇、醛固酮、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺、香草扁桃酸、高香草酸或肌酐中的任意一种或至少两种的组合。

4、本发明的试剂盒中采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠，通过磁珠固相萃取技术，专门用于吸附待测样本中的目标分析物，显著提高该试剂盒的检测准确率。本试剂盒中血管紧张素转换酶抑制剂，于抑制样本中肾素活性的干扰，保证检测结果的准确性。淋洗液1和淋洗液2可以消除待测样本基质中的蛋白质与脂质干扰。

5、本试剂盒中共检测12种生物标志物，包括18-羟皮质醇、皮质醇、醛固酮、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺、香草扁桃酸、高香草酸和肌酐。其中甾体激素类包括18-羟皮质醇、皮质醇和醛固酮；儿茶酚胺及其代谢物类包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-甲氧基酪胺；有机酸代谢产物及校正指标：香草扁桃酸、高香草酸及肌酐。

6、优选地，所述表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠的粒径为30-50 μm。所述30-50μm，例如可以是30 μm、35 μm、40 μm、45 μm或50 μm等。

7、优选地，所述亲水亲脂平衡聚合物包括聚（二乙烯苯-n-乙烯基吡咯烷酮）（nvp-dvb）、聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物或表面改性硅胶中的任意一种或至少两种的组合。

8、优选地，所述血管紧张素转换酶抑制剂包括pmsf、依那普利、卡托普利、赖诺普利、贝那普利、培哚普利、福辛普利、雷米普利、edta（乙二胺四乙酸）、或egta（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）中的任意一种或至少两种的组合。

9、优选地，所述样本处理模块还包括淋洗液1、淋洗液2和洗脱液。

10、优选地，所述洗脱液包括40%-60%甲醇水溶液。所述40%-60%，例如可以是40%、45%、50%、55%或60%等。

11、优选地，所述淋洗液1包括5%-20%甲醇水溶液。所述5%-20%，例如可以是5%、10%、15%或20%等。

12、优选地，所述淋洗液2包括异辛烷。

13、优选地，所述检测模块还包括液相色谱和内标。

14、优选地，所述液相色谱的色谱柱包括c18反相色谱柱。

15、优选地，所述液相色谱的流动相a包括0.5-3 mm氟化铵-磷酸盐缓冲液，流动相b包括含1%-10%异丙醇的甲醇溶液。所述0.5-3 mm，例如可以是0.5 mm、1 mm、1.5 mm、2 mm、2.5mm或3 mm等。所述1%-10%，例如可以是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%等。

16、优选地，所述内标包括同位素标记的标准品。

17、优选地，所述内标包括d4-醛固酮、d4-皮质醇、d4-18-羟皮质醇、d3-变肾上腺素、d3-去甲变肾上腺素、d4-3-甲氧基酪胺、d4-多巴胺、d6-肾上腺素、d6-去甲肾上腺素、d3-香草扁桃酸、d5-高香草酸或d3-肌酐中的任意一种或至少两种的组合。

18、本发明中内标的作用是校正全流程的误差（包括磁珠吸附效率、洗脱损失、复溶体积基质效应等）。如果内标在磁珠吸附前就与原始样本充分混合，那么在后续的磁珠捕获、淋洗、洗脱和质谱检测中，内标与目标分析物将经历完全相同的物理化学过程。这是质谱前处理保证高回收率和高精密性的关键。

19、第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒在检测生物标志物中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括18-羟皮质醇、皮质醇、醛固酮、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺、香草扁桃酸、高香草酸或肌酐中的任意一种或至少两种的组合。

20、第三方面，本发明提供了一种检测样本中内分泌性高血压生物标志物的方法，所述方法包括将待测样本采用第一方面所述的内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒进行检测。

21、优选地，所述方法包括：

22、（1）将待测样本中加入血管紧张素转换酶抑制剂和内标混合，加入表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠进行吸附，依次采用淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，加入洗脱液进行洗脱后，复溶得到检测样本；

23、（2）将检测样本和标准品采用液相色谱联合质谱进行检测；

24、（3）数据处理。

25、本发明的方法采用特异性吸附材料，表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠（粒径30-50μm），实现了对血液/尿液中极性差异较大的多种目标物（如强极性的儿茶酚胺与弱极性的甾体激素）的同步高效捕获。磁珠法前处理取代了传统繁琐的液液萃取或衍生化步骤，目标物回收率提升至90%以上，且将全流程耗时压缩至2小时以内。通过双淋洗体系（10%甲醇水溶液与异辛烷）的阶梯式清洗，有效消除了尿液/血液基质中的蛋白质与脂质干扰。

26、本发明采用特定的亲水亲脂平衡聚合物磁珠，取代了繁琐的传统液液萃取或衍生化步骤，操作更简便且易于自动化。目标物的回收率可稳定在90%以上，全流程耗时缩短至2小时以内，极大地提高了临床实验室的高通量检测能力。由于实现了多指标联检，显著减少了采样次数、检测耗材的使用以及实验室的人力成本，具有良好的社会经济效益。

27、优选地，步骤（1）中，所述待测样本包括血液和/或尿液。

28、优选地，步骤（1）中，所述待测样本与血管紧张素转换酶抑制剂的体积比为1:(0.01-0.1)–；进一步优选为1:(0.02-0.05)。所述(0.01-0.1)，例如可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1等。所述(0.02-0.05)，例如可以是0.02、0.03、0.04或0.05等。

29、优选地，步骤（1）中，所述待测样本与表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠混悬液的体积比为1: (0.1-2)；进一步优选为1:(0.2-1)。所述(0.1-2)，例如可以是0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8或2等。所述(0.2-1)，例如可以是0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1等。

30、优选地，步骤（1）中，所述待测样本与淋洗液1的体积比为1:(2-10)； 进一步优选为1:(3-6)。所述(2-10)，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10等。所述(3-6)，例如可以是3、4、5或6等。

31、优选地，步骤（1）中，所述待测样本与淋洗液2的体积比为1 :(2-10)； 进一步优选为1:(4-8)。所述(2-10)，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10等。所述(4-8)，例如可以是4、5、6、7或8等。

32、优选地，步骤（1）中，所述待测样本与洗脱液的体积比为1: (2-8)； 进一步优选为1: (3-5)。所述(2-8)，例如可以是2、3、4、5、6、7或8等。所述(3-5)，例如可以是3、3.5、4、4.5或5等。

33、优选地，步骤（1）中，所述混合后所述血管紧张素转换酶抑制剂的终浓度为0.5-5mm。所述0.5-5 mm，例如可以是0.5 mm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm或5 mm等。

34、优选地，步骤（1）中，所述复溶的溶剂包括甲醇-水溶液、乙腈-水溶液或所述液相色谱的初始流动相。

35、优选地，步骤（1）中，所述复溶的溶剂包括体积比为(5-20):(80-95)的甲醇-水溶液、含有0.05-0.3%甲酸或1-5 mm氟化铵的水溶液中的任意一种或至少两种的组合。所述(5-20)，例如可以是5、6、8、10、12、14、16、18或20等。所述(80-95)，例如可以是80、82、84、86、88、90、92、94或95等。所述0.05-0.3%，例如可以是0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%或0.3%等。

36、优选地，步骤（2）中，所述液相色谱的洗脱程序为：0-10 min，流动相b由5%-15%匀速变化至90%-99%。所述5-15%，例如可以是5%、6%、8%、10%、12%、14%或15%等。所述90%-99%，例如可以是90%、92%、94%、96%、98%或99%等。

37、优选地，步骤（2）中，所述质谱的电离源包括电喷雾电离源（esi），扫描模式包括多反应监测（mrm）模式，正负离子切换扫描；其中，雾化气压力为40-65 psi，辅助气压力为40-65 psi，气帘气压力为25-45 psi，源温度为450-650℃，正离子模式电喷雾电压为4500-5500 v，负离子模式电喷雾电压为-4500~-3500 v。所述40-65 psi，例如可以是40 psi、45psi、50 psi、55 psi、60 psi或65 psi等。所述25-45 psi，例如可以是25 psi、30 psi、35psi、40 psi或45 psi等。所述450-650℃，例如可以是450℃、460℃、480℃、500℃、520℃、540℃、560℃、580℃、600℃、620℃、640℃或650℃等。所述4500-5500 v，例如可以是4500v、4600 v、4800 v、5000 v、5200 v、5400 v或5500 v等。所述-4500~-3500 v，例如可以是-4500 v、-4200 v、-4000 v、-3800 v、-3600 v或-3500 v等。

38、本发明利用同位素内标测定结果校正待测样本的基质效应，计算各生物标志物的原始浓度；对于尿液样本，同步引入所测得的肌酐浓度，对待测样本中其余生物标志物的原始浓度进行尿稀释度校正，获得校正后的临床定量结果。

39、同位素内标定量与基质效应校正（解决“测得准”的问题），由于血液和尿液样本基质极其复杂，即使经过磁珠洗脱，仍会存在质谱离子抑制。

40、数据处理软件采用内标法单点或多点校正曲线进行定量。利用同步加入的同位素标记标准品（如 d4-醛固酮、d4-皮质醇、d3-变肾上腺素等）的响应信号（峰面积），校正对应目标分析物在电喷雾电离（esi）过程中的基质抑制或增强效应。

41、计算原理：以atarget/ais（目标物峰面积与内标峰面积比值）对标准品浓度绘制校正曲线，定量计算检测样本中12种物质的原始质量浓度（c测定）。

42、临床尿稀释度校正（解决“消除个体差异”的问题），由于不同患者饮水量及代谢状态不同，尿液浓稀程度差异可达数倍。

43、当待测样本为尿液时，数据处理系统自动提取同批次测得的肌酐（creatinine）原始浓度（c肌酐），对儿茶酚胺及其代谢物、甾体激素等指标进行标准化校正。

44、校正公式：c校正=c肌酐/c测定。

45、校正后的最终报告单位转化为μg/g肌酐或mg/g肌酐，彻底消除因饮水量、尿液稀释或浓缩带来的漏诊与假阳性。

46、继发性高血压多病因分型判读，数据处理模块还包括临床辅助分型逻辑。系统根据单次质谱检测输出的12项全谱图指标，自动运行以下规则：

47、原发性醛固酮增多症（pa）筛查：自动计算醛固酮与同步测定的相关类固醇激素比值（或结合配套检测的肾素活性测定结果自动计算 arr 比值），并根据 18-羟皮质醇水平辅助鉴别糖皮质激素可治性醛固酮增多症（gra）。

48、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（ppgl）筛查：自动评价变肾上腺素（mn）、去甲变肾上腺素（nmn）及 3-甲氧基酪胺（3-mt）的校正浓度是否超过临床临界值。

49、库欣综合征（cs）筛查：评估皮质醇（cortisol）水平，并结合其浓度变化提供诊断线索。

50、本发明的方法基于质谱mrm模式的精准分型能力，能够精准区分同分异构体：利用lc-ms/ms的多反应监测（mrm）模式，成功解决了免疫分析法中难以规避的交叉反应问题，特别是在精准分离3-甲氧基酪胺（3-mt）与变肾上腺素（mn）等结构类似物方面具有显著优势。多维度校正，通过同步检测尿肌酐水平并引入pmsf抑制肾素活性干扰，确保了定量结果的临床可靠性。

51、第四方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的内分泌性高血压生物标志物的检测试剂盒在制备继发性高血压相关内分泌疾病检测产品中的应用。

52、优选地，所述内分泌性高血压疾病包括嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、原发性醛固酮增多症或库欣综合征中的任意一种或至少两种的组合。

53、嗜铬细胞瘤的生物标志物包括嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（ppgl）的生物标志物包括：变肾上腺素（mn）、去甲变肾上腺素（nmn）、3-甲氧基酪胺（3-mt）、多巴胺（da）、肾上腺素（e）、去甲肾上腺素（ne）；（其中mn、nmn、3-mt为核心诊断指标）。

54、原发性醛固酮增多症（pa）的生物标志物包括：醛固酮（aldo）、18-羟皮质醇（18-oh-f）；（临床筛查通常结合同步或单独测定的肾素活性/浓度进行arr比值计算）。

55、库欣综合征（cs）的生物标志物包括：皮质醇（cortisol）。 全谱通用校正及辅助指标包括：香草扁桃酸（vma）、高香草酸（hva）及肌酐（creatinine）。

56、本发明中，通过对12种生物标志物同时检测，实现了全谱图覆盖，并实现了嗜铬细胞瘤（ppgl）、原发性醛固酮增多症（pa）及库欣综合征（cs）三种内分泌疾病相关标志物的同步检测。

57、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

58、（1）本发明的试剂盒通过单次样本采集和处理，即可实现对待测样本中12种内分泌疾病相关生物标志物的同步定量分析。覆盖全面的生物标志物图谱，本发明的检测范围涵盖了全套关键指标，包括：甾体激素类：18-羟皮质醇、皮质醇、醛固酮；儿茶酚胺及其代谢物类：多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺；有机酸代谢产物及校正指标：香草扁桃酸（vma）、高香草酸（hva）及肌酐。

59、（2）本发明的方法提供高特异性与高精密度的检测方案，利用液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）技术及多反应监测（mrm）模式，有效消除传统免疫法中存在的抗体交叉反应干扰，特别是实现对结构高度相似的3-甲氧基酪胺（3-mt）、变肾上腺素（mn）与去甲变肾上腺素（nmn）的精准区分。

60、（3）本发明的方法简化并优化样本前处理流程，通过引入表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠固相萃取技术，替代传统复杂的液液萃取或手动固相萃取，旨在缩短前处理时间（全流程耗时控制在2小时以内），提高目标物的回收率（>90%），并降低人工操作带来的误差。

61、（4）本发明的试剂盒显著提升了检测效能与经济性。通过高通量的检测设计，在单次前处理和单次进样中实现了12种指标的同步精准定量，显著减少了采样频次和检测耗材的使用，降低了临床实验室的人力成本；同时，本发明通过对多种关键指标的全谱图覆盖，有效避免了传统免疫检测的交叉反应干扰，为继发性高血压的精准分型提供了科学可靠的量化依据。