基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法

本发明涉及生物医学工程与体外诊断，具体为基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法。

背景技术：

1、恶性肿瘤全球发病率持续攀升，临床实践表明，单一肿瘤标志物检测存在较高的误诊和漏诊风险，目前已普遍要求对多种肿瘤标志物进行联合同步检测，以提高癌症早期筛查的准确性。

2、现有的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法存在的缺陷是：

3、专利文件cn117538280a公开了一种基于微流控检测的肿瘤早期快速筛查设备，“本发明涉及一种基于微流控检测的肿瘤早期快速筛查设备，利用荧光编码微球实现了对癌症早期筛查蛋白质种类的区分；同时利用荧光标记的检测抗体实现了对癌症早期筛查蛋白质浓度的表示；当在图像中两个荧光图像重叠时，表明该区域既存在荧光编码微球，又存在荧光标记检测抗体，从而在免洗的情况下实现了对待测成分的准确定位；待定位之后使用红外光谱仪对蛋白质区域进行准确的微区红外光谱检测，将检测的红外光谱输入筛查模型进行筛查；可以更加精准地识别蛋白质的细微变化，从而对癌症早期筛查提供更准确的判断依据。利用神经网络模型，结合荧光编码微球的种类、荧光素标记抗体的强度和红外光谱的具体细节进行分析，更加准确、及时地实现对癌症的早期筛查”，但是上述文件中采用荧光编码微球和荧光标记检测抗体进行肿瘤标志物检测时，编码荧光与检测荧光均位于同一微球上，两种荧光信号在图像中重叠，相互干扰严重，导致检测信噪比低、定量准确性差，同时该设备依赖神经网络模型和红外光谱进行辅助分析，系统复杂、成本高昂，不利于临床大规模推广应用的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，包括以下步骤：

3、s1、在多通道微流控芯片中，将含有荧光编码材料的编码相单体溶液与含有活性羧基的检测相单体溶液，经所述多通道微流控芯片的平行分支通道注入公共主通道，形成稳定的多相平行层流；

4、s2、利用步进电机遮光快门模组控制紫外光源，对所述公共主通道内的多相层流流体进行间歇曝光，原位光固化成型，得到一侧为编码区、另一侧为检测区的双分区水凝胶微粒；

5、s3、收集s2所得微粒，利用edc/nhs活化液对所述检测区的羧基进行活化处理；

6、s4、将肿瘤标志物捕获抗体与s3活化后的微粒孵育，使捕获抗体共价固载于所述检测区，并封闭非特异性结合位点，得到编码微粒探针；

7、s5、将多种携带不同编码的所述编码微粒探针混合，加入待测血清样本进行恒温免疫孵育，再加入荧光标记二抗，形成夹心免疫复合物；

8、s6、采集微粒的编码荧光和二抗免疫荧光，根据所述编码荧光区分微粒种类，根据所述二抗免疫荧光的强度定量待测样本中肿瘤标志物的浓度。

9、优选的，所述s1中多相平行层流的流体流速为0.1-0.3μl/min

10、所述s2中间歇曝光的单次曝光时长为10-75 ms，步进电机遮光快门模组的往复遮光与曝光由控制程序驱动。

11、优选的，所述编码相单体溶液包含pegda光致水凝胶基质和peg修饰的cdse量子点，检测相单体溶液包含pegda光致水凝胶基质和丙烯酸，丙烯酸占检测相单体溶液总体积的15%。

12、优选的，所述荧光编码材料具有三重编码机制，具体包括：

13、空间位置编码：由多相层流的相数及不同相的排列顺序构成，不同微粒的编码区空间分布与相数一一对应；

14、颜色编码：由cdse量子点的荧光发射波长决定，发射波长包括525nm、565nm、625nm中的至少一种；

15、强度编码：由cdse量子点在编码相单体溶液中的浓度梯度决定。

16、优选的，所述多通道微流控芯片为pdms材质，设置有2-5路平行分支进样通道，分支通道宽度为75-100μm，公共主通道宽度为200-510μm，通道深度为60μm。

17、优选的，所述s3中活化处理具体为：在室温条件下利用edc/nhs缓冲液活化检测区的羧基3小时；

18、所述s4中共价固载具体为：将捕获抗体在4℃条件下与微粒孵育3小时，随后采用bsa封闭检测区未结合的活性位点。

19、优选的，所述步进电机遮光快门模组包括步进电机、70mm×16mm条形遮光片以及控制程序，条形遮光片在步进电机驱动下往复平移，遮挡或暴露紫外光源，控制曝光时长在10-10000ms范围内可调。

20、优选的，所述pegda光致水凝胶基质的数均分子量mn=575，编码相单体溶液和检测相单体溶液中均含有光引发剂，光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯丙酮，且与pegda的体积配比为1:2。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、1.本发明通过采用多相层流微流控芯片耦合步进电机遮光快门模组，以程序控制电机往复运动替代进口精密快门实现间歇紫外曝光，在保证微粒尺寸高度均一的前提下，将核心曝光设备的成本降低80%，并实现了微粒制备、免疫反应与荧光检测的一体化集成，解决了现有微流控流动光刻设备依赖进口高精度快门、设备成本高昂以及制备与检测分步操作繁琐的难题；

23、2.本发明通过利用多相层流的相数及排列顺序形成空间位置编码，搭配不同荧光发射波长实现颜色编码，以及利用不同量子点浓度实现强度编码，构建了“空间+颜色+强度”三重编码机制，克服了传统有机荧光染料光谱严重重叠导致编码种类受限的缺陷，极大提升了同步检测肿瘤标志物的通量；

24、3.本发明通过将微粒设计为独立的编码区与检测区双分区结构，并在检测区精准调控丙烯酸体积占比为15%，利用edc/nhs活化获得足量羧基以共价结合抗体，彻底分离了编码荧光与检测荧光，大幅提升了免疫检测信噪比，并使抗体负载能力提升一倍以上，克服了常规单一组分水凝胶缺乏活性位点、抗体物理吸附易脱落以及检测区与编码区互相干扰导致检测背景高的问题，显著提高了检测灵敏度；

25、4.本发明通过以生物相容性优异的pegda水凝胶为基底，结合微流控技术微升级流体控制，有效降低了样本与试剂消耗，单次检测仅需微量血清样本，同时解决了传统悬浮微球制备粒径不均一、物理吸附抗体易脱落的技术瓶颈，为低血量临床样本的多重肿瘤标志物精准筛查提供了稳定、可靠的技术手段。

1.基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述s1中多相平行层流的流体流速为0.1-0.3μl/min；

3.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述编码相单体溶液包含pegda光致水凝胶基质和peg修饰的cdse量子点，检测相单体溶液包含pegda光致水凝胶基质和丙烯酸，丙烯酸占检测相单体溶液总体积的15%。

4.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述荧光编码材料具有三重编码机制，具体包括：

5.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述多通道微流控芯片为pdms材质，设置有2-5路平行分支进样通道，分支通道宽度为75-100μm，公共主通道宽度为200-510μm，通道深度为60μm。

6.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述s3中活化处理具体为：在室温条件下利用edc/nhs缓冲液活化检测区的羧基3小时；

7.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述步进电机遮光快门模组包括步进电机、70mm×16mm条形遮光片以及控制程序，条形遮光片在步进电机驱动下往复平移，遮挡或暴露紫外光源，控制曝光时长在10-10000ms范围内可调。

8.根据权利要求1所述的基于微流控流动光刻制备编码微粒的肿瘤标志物检测方法，其特征在于：所述pegda光致水凝胶基质的数均分子量mn=575，编码相单体溶液和检测相单体溶液中均含有光引发剂，光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯丙酮，且与pegda的体积配比为1:2。