阿尔茨海默病蛋白标志物的检测方法、试剂盒和应用与流程

本发明涉及蛋白质谱检测，具体涉及一种蛋白质的检测方法、试剂盒和应用，尤其涉及一种阿尔茨海默病蛋白标志物的检测方法、试剂盒和应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer's disease, ad）是一种起病隐匿、病理复杂的神经退行性疾病，其临床特征包括不可逆的脑损伤、认知障碍及日常生活自理能力丧失，最终可发展为痴呆甚至死亡。随着全球人口老龄化加剧，ad已成为公共卫生领域的重大挑战。尽管目前尚无根治手段，但早期诊断与干预对于延缓病情进展、提高患者生活质量至关重要。

2、ad的核心病理特征为β-淀粉样蛋白（aβ）在脑内形成老年斑，以及tau蛋白过度磷酸化导致神经纤维缠结。在疾病极早期，脑脊液（csf）中aβ40、aβ42、总tau（t-tau）和磷酸化tau（p-tau）等标志物水平即发生改变。然而，csf检测依赖腰椎穿刺，属有创操作，患者接受度低，限制了其在早期筛查中的应用。研究发现，ad患者血脑屏障受损，使部分csf标志物可进入外周血，因此，外周血蛋白标志物的无创检测成为极具潜力的早期筛查手段，尤其是血浆aβ42/aβ40比值，已被证实能有效反映脑内aβ病理状态。

3、目前，临床常用酶联免疫吸附试验（elisa）检测aβ，但其易受血浆基质干扰，特异性与灵敏度不足，难以区分结构相似的aβ40与aβ42，且重复性差，不利于推广。质谱技术虽提升了检测性能，但仍面临前处理复杂、需酶解、抗体偶联条件不统一、回收率不稳定、质控体系缺失等问题，导致信噪比低、结果波动大。现有专利申请如cn118294648a、cn119086929a等虽开发了基于免疫荧光或单分子阵列的检测试剂盒，但制备流程繁琐、耗时长，且无法实现aβ40与aβ42的同时检测。cn117741154a虽提出多标志物组合，仍需分步处理，批间误差影响诊断准确性。此外，如oztug等人提出的orbitrap质谱法依赖固相萃取，步骤繁杂，灵敏度仅达100 pg/ml，难以满足血浆中低丰度aβ的检测需求。

4、综上，当前外周血aβ检测技术在特异性、灵敏度、操作便捷性与标准化方面仍存在显著瓶颈，亟需开发高效、稳定检测的新技术，以推动ad的早期精准诊断。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种阿尔茨海默病蛋白标志物的检测方法、试剂盒和应用，以期至少部分地解决上述技术问题。

2、为了实现上述目的，作为本发明的第一个方面，提供了一种蛋白的检测方法，所述方法至少包括以下步骤：

3、在待测样本中加入样本稀释液和内标工作液，得到溶液a；

4、将抗体-微球复合物加入溶液a中孵育，通过磁力架，得到纯化的免疫富集后的复合物；

5、将免疫富集后的复合物进行清洗，得到清洗后的复合物；

6、将清洗后的复合物进行洗脱，然后用质谱进行检测，输出结果；

7、其中，所述样本稀释液包括牛血清蛋白（bsa）、盐酸胍、蛋白酶抑制剂、二硫苏糖醇和非离子表面活性剂。

8、优选地，所述非离子表面活性剂为聚醚硫酸酯非离子表面活性剂，即吐温-20。

9、优选地，所述样本稀释液包括w/v为1%-1.5%的血清蛋白（bsa）、0.1-0.5m的盐酸胍、w/v为0.1%-0.5%的二硫苏糖醇、w/v为0.1%-1%的吐温20以及w/v为1%-20%的蛋白酶抑制剂；

10、优选地，牛血清蛋白的质量浓度可以是0.5g/100ml溶液、1g/100ml溶液、1.5g/100ml溶液、2.5g/100ml溶液或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再一一列举；

11、优选地，盐酸胍的浓度可以是0.1m、0.2m、0.4m、0.5m、1m或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再一一列举；

12、优选地，二硫苏糖醇的浓度可以是0.1g/100ml溶液、0.2g/100ml溶液、0.5g/100ml溶液或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再一一列举。

13、优选地，样本稀释液的作用包括但不限于：降低样本的黏稠度，使抗体微球均匀分布于样本中，增加目标蛋白的捕获概率；制造一个缓冲体系以及非离子型表面活性剂的存在，有助于抗原抗体的结合，降低微球对非目标蛋白的非特异性吸附；由于血液中含有一系列生物活性的酶，能在体外对蛋白进行酶解，添加蛋白酶抑制剂，可以抑制生物活性酶对目标蛋白的酶解。

14、优选地，所述内标工作液包括：0.5-12.5ng/ml的15n-aβ40和1~5ng/ml的15n-aβ42溶液；

15、优选地，所述待测样本为csf、血液或血浆样本。

16、优选地，步骤2）包括：将抗体微球复合物加入溶液a中，室温旋转孵育30min~1.5h，过磁力架，得到纯化的免疫富集后的复合物（即目的蛋白-抗体-纳米磁性微珠复合物）；

17、优选地，所述微球为纳米磁性微球。

18、优选地，所述抗体为抗β淀粉样蛋白单克隆抗体；

19、优选地，所述抗体能与阿尔茨海默病蛋白标志物特异性结合；

20、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42特异性结合。

21、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42的共有氨基酸序列特异性结合。

22、优选地，所述共有氨基酸序列为：daefrhdsgyevhh。

23、微球-抗体复合物具有用于同时识别aβ40、aβ42等抗体，其目的在于捕获血浆中的目标蛋白（aβ40、aβ42），得到免疫富集后的复合物（即目的蛋白-抗体-纳米磁性微珠复合物）。纳米磁性微珠超顺磁微球由于其容易消磁，有助于后续分离和高效洗涤，即使多次磁化，超顺磁性纳米微球性能仍保持不变，重复性良好，由于磁力架内置磁铁，可将具有磁性的免疫富集后的复合物（即目的蛋白-抗体-纳米磁性微珠复合物）固定在容器壁上，实现对免疫富集后的复合物的分离，有利于自动化的转化，利用其与特异性抗体结合，无需离心实现溶液和纳米磁性微珠-抗体微球复合物的分离，简化了提取流程。

24、优选地，步骤3）包括：将免疫富集后的复合物用体积分数0.1%-0.5%的tritonx-100的pbs溶液清洗；

25、优选地，步骤3）包括：将免疫富集后的复合物用体积分数0.1%-0.5%的triton x-100的pbs溶液清洗2遍，再用纯化水清洗1遍。

26、优选地，非离子性表面活性剂（tritonx-100的pbs溶液）的作用在于除去纳米磁性微珠-抗体微球复合物表面的非特异性吸附。triton x-100的pbs溶液的体积分数可以是0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.4%、0.5%或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再一一列举。

27、优选地，步骤4）包括：将清洗后的复合物加入酸性缓冲液洗脱；

28、优选地，所述酸性缓冲液为甘氨酸缓冲液；

29、优选地，所述甘氨酸缓冲液的ph为2.5-4.5；

30、优选地，所述甘氨酸缓冲液的ph值为2.5、3、4、4.5或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再一一列举。

31、优选地，步骤4）包括：将清洗后的复合物加入甘氨酸缓冲液洗脱，振荡离心后取上清经c18tip头除盐后，进行质谱检测；

32、优选地，所述质谱为液相色谱串联三重四极杆质谱（liquid chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry, lc-ms/ms）。

33、优选地，所述方法包括以下步骤：

34、1）样本预处理：在样本中加入样本稀释液和内标工作液，得到溶液a；所述样本稀释液包括：v/v为0.1%-1%的吐温20，w/v为1%-1.5%牛血清蛋白、0.1-0.5m 盐酸胍、w/v为0.1%-0.5%二硫苏糖醇，以及w/v为1%-20%蛋白酶抑制剂；所述样本为csf、血液或血浆样本；所述内标工作液包括：0.5-12.5ng/ml的15n-aβ40和1~5ng/ml的15n-aβ42溶液；

35、2）免疫富集：将抗体-微球复合物加入溶液a中，室温旋转孵育30min~1.5h，过磁力架，得到纯化的免疫富集后的复合物；

36、3）清洗：将免疫富集后的复合物分别用v/v为0.05-0.5%的tritonx-100的pbs溶液清洗至少3遍，得到清洗后的复合物；

37、4）向清洗后的复合物中加入ph在2.5~4.5之间的0.1m甘氨酸缓冲液，振荡混匀；

38、5）经c18 tip头除盐后，用质谱进行检测，输出结果。

39、本发明的原理如下：本发明通过免疫富集的方式，将样本中的目的蛋白（即aβ40、aβ42蛋白或其中能被抗体特异性识别的aβ40、aβ42蛋白片段）特异性地吸附在纳米磁性抗体微球复合物上；由于纳米磁性微珠具有超顺磁性，因此将免疫富集后的复合物置于有磁场的磁力架上，可以将吸附有目的蛋白的纳米磁性抗体微球复合物吸附，其他无法被免疫微球吸住的各种杂质均无法留在磁场中，因此可以清洗去除；彻底清洗后，用酸性洗脱液将抗原-抗体分开（抗体与纳米磁性微珠结合而继续留在磁场中，而目的蛋白被释放）；随后，直接进入质谱系统检测。

40、另外，由于本发明没有使用酶解，不会出现因为比aβ40、aβ42长的氨基酸序列β淀粉样蛋白通过酶解被剪切断开，而产生了与aβ40、aβ42一样的氨基酸序列的蛋白或肽段的情形，因此本发明能避免出现样本检测过程的假阴性结果。

41、质谱检测及内标定量原理：目的蛋白/肽段和稳定同位素标记的蛋白/肽段具有相同的物理或化学性质，除了质量稍有不同之外，其在质谱中经碰撞碎裂的方式相同。因此可以有效监控和校正质谱检测过程中受基质影响导致的信号波动。另外，由于质谱信号同检测物的含量成正比，可通过准确含量的稳定同位素标记的肽段在质谱中的信号计算样本中目标肽段的含量，进一步计算样本中目的蛋白的含量。

42、根据本发明的第二方面，提供了一种阿尔茨海默病蛋白标志物的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括：

43、1）预处理模块：至少包括样本稀释液和内标工作液；其中，样本稀释液的配方如下：牛血清蛋白（bsa）、盐酸胍、蛋白酶抑制剂、二硫苏糖醇和非离子表面活性剂；

44、2）免疫富集模块：至少包括抗体-微球复合物；

45、3）清洗复溶模块：至少包括体积分数0.1-0.5%的tritonx-100的pbs溶液；

46、4）洗脱模块：至少包括酸性缓冲液。

47、优选地，所述样本稀释液包括：v/v为0.1%-1%的吐温20，w/v为1-1.5%牛血清蛋白、0.1-0.5m 盐酸胍、w/v为0.1%-0.5%二硫苏糖醇，以及w/v为1%-20%蛋白酶抑制剂；

48、优选地，所述内标工作液包括：0.5-12.5ng/ml的15n-aβ40和1~5ng/ml的15n-aβ42溶液；

49、优选地，所述微球为纳米磁性微球；

50、优选地，所述抗体为抗β淀粉样蛋白单克隆抗体；

51、优选地，所述抗体能与阿尔茨海默病蛋白标志物特异性结合；

52、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42特异性结合；

53、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42的共有氨基酸序列特异性结合。

54、优选地，所述共有氨基酸序列为：daefrhdsgyevhh。

55、优选地，所述酸性缓冲液为甘氨酸缓冲液；

56、优选地，所述甘氨酸缓冲液的ph为2.5-4.5。

57、根据本发明的第三方面，提供了一种使用第一方面所述的方法或第二方面所述的试剂盒进行非诊断目的的阿尔茨海默病蛋白标志物检测的方法。

58、优选地，所述方法包括以下步骤：

59、1）样本预处理：在待测样本中加入样本稀释液和内标工作液，得到溶液a；

60、2）免疫富集：将抗体-微球复合物加入溶液a中孵育，过磁力架，得到纯化的免疫富集后的复合物；

61、3）清洗：将免疫富集后的复合物进行清洗，得到清洗后的复合物；

62、4）将清洗后的复合物进行洗脱，然后用质谱进行检测，输出结果；

63、优选地，所述待测样本为csf、血液或血浆样本；

64、优选地，所述微球为纳米磁性微球；

65、优选地，所述抗体为抗β淀粉样蛋白单克隆抗体；

66、优选地，所述抗体能与阿尔茨海默病蛋白标志物特异性结合；

67、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42特异性结合；

68、优选地，所述抗体能与aβ40和/或aβ42的共有氨基酸序列特异性结合；

69、优选地，所述共有氨基酸序列为：daefrhdsgyevhh；

70、优选地，所述质谱为液相色谱串联三重四极杆质谱。

71、根据本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述的方法或第二方面所述的试剂盒在反映阿尔茨海默症早期筛查中的应用。

72、基于上述技术方案可知，本发明的阿尔茨海默病蛋白标志物的检测方法、试剂盒和应用，相对于现有技术，至少具备如下有益效果之一：

73、本发明将aβ40、aβ42蛋白的特异性抗体-微球复合物替代多抗体联合使用等技术方案，同时捕获aβ40、aβ42，提升了aβ40、aβ42的富集和检出效率，并在此基础上设计了新的实验方案，减少酶解这一耗时步骤降低了操作过程中的损失。更进一步地，与质谱检测技术相结合，保障检测准确性。本发明提供的aβ40、aβ42的检测方法步骤简单，检测时间短，灵敏度高，精密度好，检测结果可信度高，只需要3个步骤就可完成质谱检测前处理，解决了现存的反映阿尔茨海默症的病理特征的相关蛋白标志物的检测试剂盒操作复杂、耗费昂贵、缺少对阿尔茨海默症的准确筛查能力等问题，对于阿尔茨海默症的大范围早期筛查有着重要的应用价值和意义。

74、本发明可用于反映阿尔茨海默症的病理特征的标志物的分析检测，有效提升aβ40、aβ42的捕获效率，提高阿尔茨海默症早期诊断和筛查的特异性及灵敏度。再通过试剂、试验步骤的优化，采用独特的缓冲体系提高试剂的稳定性和检测的重复性，实现了包括样本预处理、免疫沉淀、洗脱等3大主要步骤，简化了检测的流程和时间。简言之，本发明的分析检测方法更高的检测敏感度、特异性、稳定性，对于阿尔茨海默症的大范围早期筛查有着重要的应用价值和意义。