儿童移植物抗宿主病的膜蛋白标志物检测模型及其应用的制作方法

本发明属于生物检测领域，具体涉及儿童移植物抗宿主病的膜蛋白标志物检测模型及其应用。

背景技术：

1、异基因造血干细胞移植是治疗儿童血液系统疾病、先天性免疫缺陷病等重症疾病的核心手段，而急性移植物抗宿主病（agvhd）是该移植术术后最为高发且凶险的免疫相关并发症，也是导致移植后患儿死亡的重要原因之一。临床数据显示，移植术后100天内为急性移植物抗宿主病主要发病周期，少数患儿会出现迟发性发病；血液和骨髓移植临床试验网相关研究表明，急性移植物抗宿主病100天累计发病率可达62%，经专业审核验证后实际发病率仍高达49%，病情分级直接影响患儿预后，ii级急性移植物抗宿主病患儿1年总生存率为70%，而病情更重的iii-iv级患儿1年总生存率仅为40%，致死风险极高。目前临床虽已常规开展急性移植物抗宿主病预防性治疗，但仍有部分患儿会进展为重度病症，因此实现疾病的早期预警、精准风险评估，是提升患儿生存率、优化临床诊疗方案的关键。

2、急性移植物抗宿主病由供体免疫效应细胞攻击受体组织器官引发，主要损伤皮肤、胃肠道、肝脏三大靶器官，疾病发生分为起始、活化、效应三个阶段，依赖多种免疫细胞、细胞因子及细胞间信号通讯共同介导。现阶段临床对于儿童急性移植物抗宿主病的诊断主要依靠临床症状观察、器官损伤体征判断以及传统细胞因子检测模型，这类方式存在明显短板：一方面，临床症状出现时患儿往往已出现明显器官损伤，错失最佳干预窗口；另一方面，传统检测技术通量低、特异性差，难以实现精准的病情分级与风险预判，无法区分不同免疫细胞亚群在发病过程中的作用，也不能解析疾病背后的分子通讯机制。

3、细胞外囊泡（ev）可介导细胞间信号传导，其表面膜蛋白是疾病潜在生物标志物，还可用于溯源囊泡来源细胞、构建靶向递送系统，在肿瘤、免疫类疾病早期诊断中展现出巨大潜力。传统单囊泡检测技术仅能实现低通量膜蛋白检测，无法满足大规模临床样本筛查需求；现有针对移植物抗宿主病的研究多集中于成人群体，专门针对儿童患者、基于细胞外囊泡膜蛋白组学的特异性检测模型仍处于空白状态。同时，目前行业内缺乏一套完整、可落地的标志物筛选、检测、模型构建及临床应用体系，无法精准区分急性移植物抗宿主病高危患儿与低危患儿，也难以量化评估多器官损伤程度。综上，研发一种基于特征膜蛋白标志物的儿童移植物抗宿主病检测模型，解决现有技术检测滞后、准确度低、针对性不足的问题，成为本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组用于检测儿童急性移植物抗宿主病的细胞外囊泡膜蛋白标志物与基于该组标志物构建的检测模型，填补现有临床检测技术的缺陷，实现疾病早期预警、风险分级与病情评估。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种儿童急性移植物抗宿主病膜蛋白标志物检测方法，检测方法的特征检测标志物为vegfa、apoe、cxadr、itgb4、emcn与dsc3六种细胞外囊泡膜蛋白，检测方法的检测样本为儿童异基因造血干细胞移植受者的外周体液样本。

4、优选地，cxadr、itgb4、emcn、dsc3表达量低于对应阈值，且vegfa、apoe表达量高于对应阈值，判定为急性移植物抗宿主病阳性表达模式；cxadr阈值为300~310、itgb4阈值为1970~2000、emcn阈值为2600~2620、dsc3阈值为640~660。

5、优选地，检测方法包括外泌体制备、外泌体特征蛋白鉴定、外泌体膜蛋白制备、膜蛋白差异检测单元与结果判定。

6、优选地，外泌体制备采用差速离心联合超滤法制备外泌体原液，差速离心包括250~350×g离心8~12min、1800~2200×g离心18~22min、9000~11000×g离心28~32min。

7、优选地，外泌体制备中，在外周体液样本中加入添加剂溶液，添加剂溶液包括月桂基麦芽糖新戊二醇、(二乙酰化)槐糖内脂与1,2-己二醇。

8、优选地，月桂基麦芽糖新戊二醇与1,2-己二醇的质量体积比为4~12mg:1ml，月桂基麦芽糖新戊二醇与(二乙酰化)槐糖内脂的质量比为5~20:1；添加剂溶液的质量以其中的月桂基麦芽糖新戊二醇的质量为计量，月桂基麦芽糖新戊二醇与外周体液样本的质量体积比为5~15mg:100ml。

9、月桂基麦芽糖新戊二醇与二乙酰化槐糖内酯复配可保护细胞外囊泡结构与膜蛋白活性，提升外泌体纯度、完整度及cd9、cd63检出丰度，保障后续膜蛋白提取与定量检测稳定；其中月桂基麦芽糖新戊二醇作为温和非离子表面活性剂，可结合囊泡磷脂层改善分散性，防止外泌体聚集破裂，同时包裹膜蛋白维持其天然构象、避免变性，二乙酰化槐糖内酯嵌入脂质双层加固囊泡骨架，增强囊泡耐受离心、浓缩的能力，减少破损与杂质混入，搭配1,2-己二醇作为温和助溶剂，可规避乙醇易致蛋白变性、囊泡损伤的弊端。

10、优选地，外泌体特征蛋白鉴定单元以cd9、cd63为外泌体阳性标记蛋白，calnexin为污染阴性标记蛋白；样本中cd9、cd63高表达且calnexin无表达时，判定为合格外泌体样本。

11、优选地，检测方法采用计分加权法计算综合风险分值：单指标呈异常表达计1分，正常表达计0分；cxadr、emcn、dsc3权重为0.17~0.19，itgb4权重为0.15~0.17，vegfa、apoe、ly6c权重为0.09~0.10；综合风险分值＜0.2为低风险，综合风险分值≥0.2为高风险。

12、优选地，检测方法包括肠道专项风险评估机制，选取cxadr、dsc3、ly6c三项指标，单项权重均为0.3~0.4；肠道专项风险分值＜0.2判定为肠道低受累风险，分值≥0.2判定为肠道高受累风险；结合标志物表达特征可评估皮肤、肝脏损伤情况，区分单一器官或多器官联合受累类型。

13、优选地，检测方法应用于制备儿童异基因造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病的早期筛查试剂、风险分级试剂与多器官受累检测试剂中的一种或多种。

14、更优选地，外泌体特征蛋白鉴定中，蛋白裂解液中加入5-羟基-2-吡咯烷酮，5-羟基-2-吡咯烷酮与蛋白裂解液的质量体积比为0.5~10mg:4ml。

15、5-羟基-2-吡咯烷酮能够最大程度保留vegfa、apoe、cxadr等标志物的表达特征，保证pba高通量检测所得蛋白表达丰度数据真实、可靠，降低实验误差，在本检测体系中，添加该物质后可明显提升外泌体膜蛋白完整度。推测因为其带有环状内酰胺结构与活性羟基，能够与样本内源性蛋白酶的活性位点结合，有效抑制蛋白酶水解活性，阻断膜蛋白被降解的通路，减少提取过程中蛋白片段化损耗；其分子中的羟基可与膜蛋白表面极性基团形成多重氢键，在蛋白分子外侧构建稳定水化层，限制蛋白分子之间的无序结合，阻止膜蛋白发生变性、聚集与沉淀，精准维持七种目标膜蛋白的天然空间构象。

16、本发明还提供了儿童移植物抗宿主病膜蛋白标志物检测模型的制备方法，包括外泌体原液的制备、外泌体特征蛋白鉴定、制备外泌体膜蛋白溶液、差异蛋白初筛、膜蛋白表达阈值确定、疾病风险分级标准制定与多器官受累评估标准制定。

17、步骤一、制备外泌体原液：采用无菌采血管采集患儿外周体液样本1~20ml，采用差速离心联合超滤法分离外泌体；先以250~350×g离心8~12min，去除样本中完整细胞及细胞碎片；再以1800~2200×g离心18~22min，去除凋亡小体；随后以9000~11000×g离心28~32min，去除大型囊泡及杂质；最后取上清液，使用截留分子量100kda的超滤膜进行浓缩，得到外泌体原液。

18、优选地，在外周体液样本中加入添加剂溶液，添加剂溶液包括月桂基麦芽糖新戊二醇、(二乙酰化)槐糖内脂与1,2-己二醇。

19、优选地，添加剂溶液中，月桂基麦芽糖新戊二醇与1,2-己二醇的质量体积比为4~12mg:1ml，月桂基麦芽糖新戊二醇与(二乙酰化)槐糖内脂的质量比为5~20:1。

20、优选地，添加剂溶液的质量以其中的月桂基麦芽糖新戊二醇的质量为计量，月桂基麦芽糖新戊二醇与外周体液样本的质量体积比为5~15mg:100ml。

21、步骤二、外泌体特征蛋白鉴定：在外泌体原液加入蛋白裂解液，冰上裂解25~35min，11000~13000×g离心13~17min，取上清，得到蛋白样品；配置浓度为11%~13%的sds-page凝胶，上样量设置为13~17μl/孔，电压75~85v电泳28~32min，调整电压至110~130v继续电泳至溴酚蓝抵达凝胶底部；采用湿转法转膜，转膜电流280~320ma，转膜时长85~95min，将蛋白转移至pvdf膜；转膜完成后，使用4%~6%脱脂牛奶室温封闭1.5~2.5h，随后分别加入cd9、cd63、calnexin一抗，4℃孵育过夜；次日用tbst缓冲液洗涤2~4次，每次4~6min，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育0.8~1.2h；再次使用tbst洗涤后，滴加ecl化学发光显影液，使用凝胶成像系统采集图像。

22、优选地，外泌体原液与蛋白裂解液的体积比为1:0.8~1.2。

23、优选地，一抗稀释比例为1:800~1200。

24、优选地，二抗稀释比例为1:4000~6000。

25、优选地，检测结果判定标准为外泌体特征蛋白cd9、cd63高表达，内质网标记蛋白calnexin无表达，则判定样本为合格外泌体。

26、更优选地，蛋白裂解液中加入5-羟基-2-吡咯烷酮，5-羟基-2-吡咯烷酮与蛋白裂解液的质量体积比为0.5~10mg:4ml。

27、步骤三、制备外泌体膜蛋白溶液：将合格外泌体原液加入专用膜蛋白提取试剂，涡旋混匀0.8~1.2min，冰上静置18~22min，期间每4~6min涡旋一次；4℃条件下11000~13000×g离心18~22min，吸取上层液相，即为富集后的外泌体膜蛋白溶液，采用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将所有样本蛋白浓度统一调整至0.8~1.2μg/μl，得到外泌体膜蛋白溶液。

28、优选地，外泌体原液与膜蛋白提取试剂的体积比为1:3.5~4.5。

29、步骤四、差异蛋白初筛：采用单细胞囊泡膜蛋白组学pba检测平台，设置检测体系总体积为190~210μl，每孔加入膜蛋白样品8~12μl、检测缓冲液170~190μl、特异性抗体混合液8~12μl；检测程序：35~39℃恒温孵育1.8~2.2h，随后进行单颗粒信号采集，同步检测样本中数百种膜蛋白的表达丰度；根据膜蛋白表达数据，以表达倍数变化及p值作为筛选标准，初步筛选组间表达存在显著差异的膜蛋白。

30、步骤五、膜蛋白表达阈值确定：结合pba检测的定量数据、点状图分析及显著性检验结果，统计高危组、低危组各蛋白表达量区间，结合roc曲线分析结果确定最优临界阈值。

31、优选地，cxadr阈值为300~310。

32、优选地，itgb4阈值为1970~2000。

33、优选地，emcn阈值为2600~2620。

34、优选地，dsc3阈值为640~660。

35、优选地，当样本中cxadr、itgb4、emcn、dsc3、ly6c表达量低于对应阈值，vegfa、apoe表达量高于对应阈值时，判定为agvhd阳性表达模式。

36、步骤六、疾病风险分级标准制定：vegfa、apoe实测表达量高于对应阈值、cxadr、itgb4、emcn、dsc3实测表达量低于对应阈值则判定为单指标呈急性移植物抗宿主病异常表达模式并计1分，反之计0分，再依据各蛋白roc曲线诊断效能分配权重，其中cxadr、emcn、dsc3权重各为0.17~0.19，itgb4权重为0.15~0.17，vegfa、apoe权重各为0.09~0.10，将各指标得分与对应权重相乘后求和得到综合风险分值；选取与肠道损伤高度相关的cxadr、dsc3指标，每项权重均设置为0.3~0.4，按照相同计分规则计算得出肠道专项风险分值。

37、优选地，综合风险分值＜0.2判定为急性移植物抗宿主病低风险，≥0.2判定为急性移植物抗宿主病高风险。

38、优选地，其中肠道专项风险分值＜0.2为肠道低受累风险，≥0.2为肠道高受累风险。

39、步骤七、多器官受累评估标准制定：根据膜蛋白表达特征结合临床受累部位，区分靶器官损伤；以肠道相关膜蛋白表达异常判定肠道受累，皮肤特征蛋白联合标志物判定皮肤受累，肝脏关联蛋白判定肝脏受累，可精准区分单一器官受累、多器官联合受累类型。

40、本发明采用单细胞囊泡膜蛋白组学pba技术，筛选出vegfa、apoe、cxadr、itgb4、emcn、dsc3、ly6c七种细胞外囊泡膜蛋白作为特征标志物，结合标准化外泌体分离、膜蛋白提取流程与量化评分体系构建检测模型，因而具有如下有益效果：首先，本发明依托pba高通量检测优势，可同步完成多种膜蛋白定量分析，相比传统单囊泡检测、细胞因子检测技术，大幅提升检测效率，单样本检测时长显著缩短，适配临床大批量样本筛查需求；其次，筛选得到的7种差异膜蛋白诊断效能优异，cxadr、emcn、dsc3的auc值可达0.96，整体检测准确率超90%，灵敏度与特异度表现突出，能够实现儿童急性移植物抗宿主病的早期预警；同时，本发明可依据膜蛋白表达特征制定综合风险评分与肠道专项风险评分标准，精准完成疾病风险分级，还能结合标志物对应关系评估皮肤、肠道、肝脏等多器官受累情况，弥补了现有技术无法量化评估器官损伤的缺陷；此外，整套实验工艺经过多组实施例与对比例优化，外泌体纯度、膜蛋白完整度高，检测体系稳定性强，结果重复性好。因此，本发明是一种检测精度高、通量高、实用性强，可用于儿童急性移植物抗宿主病早期筛查、风险分级与多器官受累评估的膜蛋白标志物检测模型，具备极高的临床应用与推广价值。