应用动态仪器缩放因子的制作方法

本发明涉及一种生成归一化的细胞术数据的方法、流式细胞仪、以及包括存储在其上的用于生成归一化的细胞术数据的指令的非暂时性计算机可读存储介质。

背景技术：

1、生物流体中分析物的表征已成为生物学研究、医学诊断和患者整体健康和保健评估的重要部分。检测生物流体（例如人类血液或血液衍生品）中的分析物能够提供可以在确定对患有多种疾病的患者的治疗方案中发挥作用的结果。

2、流式细胞术是一种用于表征生物材料（例如血液样本的细胞或另一种类型的生物或化学样本中感兴趣颗粒）并经常对该生物材料进行分选的技术。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本（例如血液样本）的样本储存器和包含鞘液的鞘液储存器。流式细胞仪将流体样本中的颗粒（包括细胞）作为细胞流输送到流动池，同时也将鞘液引导到流动池。为了表征流动流的成分，用光来照射流动流。流动流中材料的变化（例如形态或荧光标记的存在）可能导致观测到的光发生变化，并且这些变化允许表征和分离。为了表征流动流中的成分，光必须作用到流动流上并被收集。流式细胞仪中的光源能够变化，并且可以包括一个或更多个广谱灯、发光二极管以及单波长激光器。光源与流动流对准，并且来自被照射颗粒的光学响应被收集并量化。

3、通过向流式细胞仪添加分选或收集能力，实现了生物颗粒的分离。通过机械移除或电移除，将分离流中被检测为具有一个或更多个所需特性的颗粒从样本流中单独分离出来。常见的流分选技术使用液滴分选，其中包含线性分离的颗粒的流动流被破裂成液滴。包含感兴趣的颗粒的液滴带有电荷，并且通过穿过电场而被偏转进入收集管中。通常，流中线性分离的颗粒在通过位于喷嘴尖端正下方的观察点时进行表征。一旦颗粒被识别为符合一个或更多个所需标准，则能够预测到该颗粒将达到液滴断裂点并以液滴从流中断裂的时间。理想情况下，就在包含所选颗粒的液滴即将从流中断裂之前，对流体流施加短暂的电荷，然后在液滴断裂后该电荷立即接地。待分选的液滴在从流体流中断裂时保持带电荷，而其它所有液滴不带电。

4、流式细胞仪每天为同一输入样本产生一致的输出信号的能力取决于各种因素，这些因素包括温度和光机对准，这两者都会随时间推移而波动。为了保持性能，制造商传统上依靠日常质量控制（qc）程序来建立检测器增益设置。这些程序通常涉及调整检测器增益，以使参考珠粒的输出信号在任意单位尺度上偏移，从而确保其平均荧光强度（mfi）随时间保持一致。通常，用于qc程序的参考珠粒是硬染料珠粒。硬染料珠粒包埋了荧光聚合物，该聚合物在用宽波长阵列激发时，会在广谱范围内发射荧光。此外，为了便于跨实验进行比较，这些珠粒通常用于将仪器设置为相同的条件。

技术实现思路

1、本发明的发明人们已经认识到，可以对校准流式细胞仪和归一化流式细胞术数据的过程进行改进。特别是，已经认识到，与响应于仪器硬件（例如，激光波长、激光功率等）的细微差别而表现出相当大的可变性的荧光团相比，硬染料珠粒对这种微小的仪器变化的响应相对均匀。因此，通过硬染料珠粒进行的校准通常无法考虑在给定流式细胞仪实验和设置期间表征颗粒如何被照射的照射参数特定于仪器或特定于实验的变化。这通常会导致不同流式细胞仪平台之间或甚至在同一平台内发生显著的信号变化，特别是当多种分析模式（例如，高速集成与低速集成）可用于相同的荧光团组合时。因此，发明人认识到，需要能够有效考虑荧光团与硬件特性之间的相互作用的方法和技术。特别是，需要创建和应用能够考虑特定于仪器的照射效应的数据缩放因子。本公开的实施例满足了这些需求和期望。

2、本公开的方面包括生成归一化的细胞术数据的方法。感兴趣的方法包括：用光源照射流动流中包括荧光团的样本的颗粒；接收荧光团的一个或更多个光学特性，所述光学特性包括荧光团接收的光量与荧光团发射的光量之间的关系；用包括光电检测器的光检测系统检测来自被照射颗粒的光；响应于检测到的光生成数据信号；以及基于缩放因子和荧光团的光学特性调整所生成的数据信号。

3、在某些实施例中，该关系（即，针对荧光团接收的关系）是光源提供的激发光的量与荧光团以荧光形式发射的光量之间的关系。在这些实例中，该关系可以包括激发光的强度与荧光团以荧光形式发射的光的强度之间的关系，和/或激发光的总辐射通量与荧光团以荧光形式发射的光的累积荧光发射量之间的关系。在一些实施例中，荧光团的光学特性包括荧光团的吸收截面、量子产率、荧光寿命、饱和效应和光稳定性特性中的一个或更多个。在一些实施例中，荧光团是荧光共振能量转移（fluorescence resonance energytransfer，fret）荧光团对的一部分。

4、在某些实施例中，基于荧光团的一个或更多个光学特性来应用缩放因子。在一些实施例中，基于与光源对流动流中颗粒的照射相关联的一个或更多个照射参数来应用缩放因子。在一些实施例中，该关系包括光源提供的激发光的强度与荧光团以荧光形式发射的光的强度之间的关系，并且照射参数包括针对激发光光源的最大照射功率。在一些实施例中，该关系包括光源提供的激发光的总辐射通量与荧光团以荧光形式发射的光的累积荧光发射量之间的关系，并且照射参数包括与荧光团在穿越流动流时接收到的激发光的总辐射通量相对应的度量。在一些实施例中，照射参数可以包括照射持续时间、强度分布、光谱组成、光束几何形状、偏振态或脉冲持续时间中的一个或更多个。在一些实施例中，照射参数对应于从颗粒最初暴露于光源直到完成积分窗口（integration window）（在该积分窗口期间响应于从颗粒检测到的光生成数据信号）期间对颗粒的照射。

5、在某些实施例中，该方法还包括确定照射参数。在这些实例中，照射参数可以通过以下方式确定：用光源照射流动流中的参考颗粒；响应于从被照射的参考颗粒检测到的光生成数据信号；以及使用所生成的数据信号和参考颗粒的一个或更多个已知光学特性来确定照射参数。在一些实施例中，参考颗粒包括用已知数量的参考荧光团染色的珠粒，参考荧光团包括一个或更多个已知光学特性。

6、在某些实施例中，所接收的样本颗粒荧光团的关系包括基于样本荧光团接收的光量来确定样本荧光团发射的光量的定量函数。在一些实施例中，该方法还包括确定将样本颗粒的荧光团接收的光量与荧光团发射的光量相关联的定量函数。在这些实例中，定量函数可以通过以下方式确定：用多种不同的光量照射样本颗粒的荧光团；用包括光电检测器的光检测系统检测来自被照射的样本荧光团的光；响应于检测到的光生成数据信号；以及基于数据信号和样本荧光团接收的相应光量来确定定量函数。

7、在某些实施例中，该方法还包括计算缩放因子。在这些实例中，缩放因子可以通过以下方式计算：用光源照射流动流中的参考颗粒；响应于从被照射的参考颗粒检测到的光生成数据信号；确定与光源对流动流中颗粒的照射相关联的一个或更多个照射参数；确定与照射参数和样本颗粒的荧光团的光学特性相对应的预定平均荧光强度（meanfluorescence intensity，mfi）；以及计算将针对参考颗粒生成的数据信号调整为预定mfi的缩放因子。在一些实施例中，所述关系包括基于样本颗粒的荧光团接收的光量来确定样本颗粒的荧光团发射的光量的定量函数；照射参数包括与样本荧光团接收的光量相对应的度量；并且预定mfi是基于定量函数和该度量来确定的。

8、在某些实施例中，缩放因子通过以下方式计算：用光源照射流动流中的参考颗粒；响应于从被照射的参考颗粒检测到的光生成数据信号；确定与光源对流动流中颗粒的照射相关联的一个或更多个照射参数；确定与参考颗粒和一个或更多个照射参数相对应的预定平均荧光强度（mfi）；以及计算将针对参考颗粒生成的数据信号调整为预定mfi的缩放因子。在一些实施例中，预定mfi通过以下方式确定：用光源照射流动流中的参考颗粒，其中光源对流动流中颗粒的照射具有已知的照射参数；以及检测来自参考颗粒的荧光。在一些实施例中，参考颗粒包括用已知数量的参考荧光团染色的珠粒，参考荧光团包括一个或更多个已知的光学特性。

9、在某些实施例中，用于计算缩放因子和/或确定预定mfi的参考荧光团与样本颗粒的荧光团具有一个或更多个相同的光学特性。在一些实施例中，参考荧光团与样本颗粒的荧光团是相同的。在一些实施例中，该方法还包括通过以下方式根据mfi确定参考荧光团数量：用光源照射流动流中的多个参考颗粒，其中用不同已知数量的参考荧光团对每个参考颗粒染色，光源对流动流中颗粒的照射具有已知的照射参数；检测来自参考颗粒的荧光；以及基于mfi测量值确定用于量化参考荧光团的定量函数。在一些实施例中，该方法还包括使用所生成的样本颗粒的数据信号和定量函数来计算固定到样本颗粒的荧光团数量的定量度量。

10、在某些实施例中，该方法还包括：对样本颗粒的所生成的数据信号进行光谱解混；以及用缩放因子调整光谱解混后的数据信号，以生成归一化的解混后数据信号。在一些实施例中，该方法还包括：在对所生成的数据信号进行光谱解混之前，基于缩放因子和荧光团的一个或更多个光学特性调整样本颗粒的所生成的数据信号。

11、在某些实施例中，光源包括发光二极管，例如激光器。在一些实施例中，光源包括多个激光器。在一些实施例中，光检测系统包括多个光电检测器。在这些实例中，每个光电检测器可以包括一个或更多个光电倍增管。在一些实施例中，光检测系统包括光电检测器阵列。在这些实例中，光电检测器阵列可以包括光电二极管。在一些实施例中，光电检测器阵列包括电荷耦合器件。

12、本公开的方面还包括用于实践本主题方法（例如，通过生成归一化的数据信号来分析分析物数据）的流式细胞仪。感兴趣的流式细胞仪包括：光源，其被配置为用光源照射流动流中包括荧光团的样本的颗粒；光检测系统，其包括用于检测来自被照射的颗粒的光的光电检测器；以及处理器，其包括可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时，使处理器：接收荧光团的一个或更多个光学特性，光学特性包括荧光团接收的光量与荧光团发射的光量之间的关系；响应于检测到的光生成数据信号；以及基于缩放因子和荧光团的光学特性调整所生成的数据信号。

13、在另一个方面，提供了用于执行生成归一化的细胞术数据的方法（例如，如上文和本文所述）的系统。此外，还提供了包括系统的存储器的指令的非暂时性计算机可读存储介质，以及包括系统组件中的一个或更多个和/或非暂时性计算机可读存储介质的套件。