一种流式细胞术高通量分析EGFP弓形虫活性用于药筛方法

本发明主要涉及生物医药的，具体为一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法。

背景技术：

1、弓形虫（toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，寄生于人和哺乳动物、鸟类等温血动物的有核细胞中。弓形虫于1908年被发现，因其形状呈弓形月牙状而得名。弓形虫具有地域分布广、宿主种类多、生活史复杂、危害大等特点，是一种重要的人兽共患病病原体。

2、目前，弓形虫的药物筛选主要依赖于体外的细胞实验。现有的技术方案通常是在极端条件下用药物处理弓形虫速殖子，然后通过显微镜观察速殖子的形态变化和活力状态。然而，现有技术存在以下缺陷：

3、（1）难以直观观察：在普通光学显微镜下，难以直观地观察弓形虫速殖子的活力状态，传统的形态学观察主观性强，准确性和重复性较差；

4、（2）难以定性和定量评估：现有方法难以对弓形虫速殖子的活力进行准确的定性和定量评估，缺乏客观的量化指标；

5、（3）通量低：传统的显微镜观察方法每次只能观察有限数量的虫体，无法实现大规模、高通量的活性检测；

6、（4）难以瞬时检测：传统方法难以实现弓形虫活性瞬时、快速的检测和分析；

7、（5）药物筛选效率低：由于上述限制，抗弓形虫药物的筛选效率较低，难以满足新药研发对高通量筛选的需求。

8、因此，本领域亟需一种能够高通量、快速、客观地检测弓形虫速殖子活性，并用于抗弓形虫药物筛选的方法。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提供一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，包括以下步骤：

4、步骤一、egfp标记弓形虫速殖子的准备，提供稳定表达egfp绿色荧光蛋白的弓形虫速殖子，所述弓形虫速殖子经egfp基因标记，能够稳定表达绿色荧光蛋白；

5、步骤二、药物梯度处理，将待测药物配制为不同浓度梯度，分别与弓形虫速殖子共孵育不同时长，获得多组药物处理后的虫体样品；

6、步骤三、单细胞悬液纯化制备，对各组虫体样品洗涤、过滤去除细胞碎片，制备无杂质弓形虫单细胞悬液；

7、步骤四、流式单细胞荧光检测，采用流式细胞仪对单细胞悬液中单个虫体采集egfp荧光信号，单次累计采集不少于104个弓形虫速殖子的荧光信号数据；

8、步骤五、活性定量判定分析，根据单细胞荧光强度数据，分析表达绿色荧光的弓形虫速殖子所占百分比，以绿色荧光强度高低反映弓形虫速殖子的活性高低，绿色荧光强度高表明弓形虫速殖子活性高，绿色荧光强度低表明弓形虫速殖子活性低；

9、步骤六、药物效果评价，对比不同药物浓度处理弓形虫速殖子后的绿色荧光阳性率，阳性率下降幅度越大，判定待测药物抗弓形虫抑制效果越强。

10、本技术方案具体的，步骤一中，所述弓形虫速殖子为rh-gfp虫株，所述rh-gfp虫株由野生型rh弓形虫经质粒转染、电转基因组改造获得，可稳定遗传表达egfp绿色荧光蛋白。

11、本技术方案具体的，步骤二中，所述待测药物的浓度梯度为至少三个不同浓度，药物与弓形虫速殖子的共孵育时长为1～10h。

12、本技术方案具体的，步骤三中，所述单细胞悬液的制备方法为：采用无菌pbs缓冲液反复重悬洗涤虫体，经4～5μm滤器过滤除去宿主细胞碎片，离心纯化得到弓形虫单细胞悬液。

13、本技术方案具体的，步骤四中，所述流式细胞术的检测参数为：采用fitc通道检测绿色荧光，fsc-a为x轴、ssc-a为y轴绘制散点图，以fitc-a为x轴绘制直方图，以fitc-a为x轴、fsc-width为y轴绘制密度图并添加四象限用于分群分析，样本流速为中速，设置为30μl/min。

14、本技术方案具体的，步骤四中，所述单次流式检测累计采集弓形虫速殖子数量为1×104～2×105个。

15、本技术方案具体的，步骤五中，所述绿色荧光阳性率的判断标准为：在流式细胞术密度图的四象限中，位于右上象限和右下象限区域的弓形虫速殖子为表达绿色荧光、活性高的速殖子，位于左上象限和左下象限区域的弓形虫速殖子为绿色荧光弱、活性低的速殖子；以右上象限和右下象限区域速殖子数占总速殖子数的百分比作为绿色荧光阳性率。

16、本技术方案具体的，在步骤一之前还包括弓形虫速殖子的培养和纯化步骤：将弓形虫速殖子接种至长满hff细胞的培养瓶中，于37℃、5%co2条件下培养，待75%以上虫体从纳虫泡溢出时，收集虫体，经针头破碎、离心洗涤、滤器过滤，获得纯化的弓形虫速殖子。

17、本技术方案具体的，还包括验证步骤：将经药物处理后的弓形虫速殖子接种至铺满hff单层细胞的培养板中，培养5～7天后进行噬斑染色，统计噬斑数量与噬斑面积，以噬斑形成能力反映弓形虫速殖子的增殖活性和生物学功能，验证流式细胞术检测结果的准确性。

18、综上所述，本发明主要具有以下有益效果：

19、1.通过构建稳定表达egfp绿色荧光蛋白的弓形虫rh-gfp虫株，以绿色荧光强度作为虫体活性的直接指示信号，绿色荧光强弱与虫体代谢活性直接偶联。借助流式细胞术对单个虫体的荧光信号进行采集分析，以绿色荧光阳性率作为核心量化指标，实现了弓形虫速殖子活性从传统显微镜观察依赖人工主观判断向仪器客观定量分析的转变，消除了操作者经验差异带来的判读误差，检测结果的准确性、重复性和可比性均得到显著提高。

20、2.采用流式细胞术对悬液中成千上万个虫体逐一进行检测分析，在单位时间内的数据采集量提升数百倍，从群体水平客观反映弓形虫的活性分布状态，检测结果具有更高的统计学意义和代表性；

21、3.利用egfp荧光信号的实时响应特性，结合流式细胞仪快速检测的优势，单个样品从进样到数据采集完成仅需数分钟。配合不同药物浓度梯度和不同共孵育时长的多时间点检测设计，可在短时间内构建活性随时间变化的动态监测曲线，能够快速捕获药物处理后虫体活性的瞬时变化，极大缩短了检测周期；

22、4.从单细胞悬液纯化制备、多浓度梯度和多时间点并行处理、流式细胞术高通量数据采集到绿色荧光阳性率自动计算和比较，形成了完整的标准化筛选流程，可以同时处理多个药物、多个浓度、多个时间点的批量样品，显著缩短了抗弓形虫药物筛选周期，降低了筛选成本，适合大规模药物筛选应用；

23、5.通过噬斑实验对流式细胞术检测结果进行验证，通过直接观测弓形虫的噬斑形成能力，可直观反映药物处理后虫体的实际增殖感染能力，进一步确认流式细胞术检测结果的可靠性，为方法的准确性提供生物学功能层面的支撑。

1.一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤一中，所述弓形虫速殖子为rh-gfp虫株，所述rh-gfp虫株由野生型rh弓形虫经质粒转染、电转基因组改造获得，可稳定遗传表达egfp绿色荧光蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤二中，所述待测药物的浓度梯度为至少三个不同浓度，药物与弓形虫速殖子的共孵育时长为1～10h。

4.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤三中，所述单细胞悬液的制备方法为：采用无菌pbs缓冲液反复重悬洗涤虫体，经4～5μm滤器过滤除去宿主细胞碎片，离心纯化得到弓形虫单细胞悬液。

5.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤四中，所述流式细胞术的检测参数为：采用fitc通道检测绿色荧光，fsc-a为x轴、ssc-a为y轴绘制散点图，以fitc-a为x轴绘制直方图，以fitc-a为x轴、fsc-width为y轴绘制密度图并添加四象限用于分群分析，样本流速为中速，设置为30μl/min。

6.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤四中，所述单次流式检测累计采集弓形虫速殖子数量为1×104～2×105个。

7.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，步骤五中，所述绿色荧光阳性率的判断标准为：在流式细胞术密度图的四象限中，位于右上象限和右下象限区域的弓形虫速殖子为表达绿色荧光、活性高的速殖子，位于左上象限和左下象限区域的弓形虫速殖子为绿色荧光弱、活性低的速殖子；以右上象限和右下象限区域速殖子数占总速殖子数的百分比作为绿色荧光阳性率。

8.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，在步骤一之前还包括弓形虫速殖子的培养和纯化步骤：将弓形虫速殖子接种至长满hff细胞的培养瓶中，于37℃、5%co2条件下培养，待75%以上虫体从纳虫泡溢出时，收集虫体，经针头破碎、离心洗涤、滤器过滤，获得纯化的弓形虫速殖子。

9.根据权利要求1所述的一种流式细胞术高通量分析egfp弓形虫活性用于药筛方法，其特征在于，还包括验证步骤：将经药物处理后的弓形虫速殖子接种至铺满hff单层细胞的培养板中，培养5～7天后进行噬斑染色，统计噬斑数量与噬斑面积，以噬斑形成能力反映弓形虫速殖子的增殖活性和生物学功能，验证流式细胞术检测结果的准确性。