Papilin在诊断狼疮肾炎中的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及papilin在诊断狼疮肾炎中的应用。

背景技术：

1、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，sle）是一种复杂的自身免疫性疾病，以自身抗体产生和免疫复合物形成为主要特征，可导致多器官系统损伤。狼疮肾炎（lupus nephritis，ln）是sle最常见且最严重的并发症之一，约40%-60%的sle患者会在病程中发展为狼疮肾炎。狼疮肾炎的病理本质是免疫复合物在肾小球沉积，激活补体系统和炎症细胞，导致肾小球损伤和肾功能进行性下降，严重者可进展为终末期肾病，是sle患者死亡的主要原因之一。

2、目前，狼疮肾炎的诊断和活动性监测面临诸多挑战。肾活检穿刺病理检查虽被公认为诊断狼疮肾炎的金标准，但其作为一种有创性检查，存在出血、感染等操作相关并发症风险，且患者接受度低，难以实现频繁重复检查以动态监测病情变化。临床上常用的血清学指标如抗ds-dna抗体、补体c3/c4等虽与狼疮疾病活动有一定相关性，但缺乏肾脏特异性，难以准确反映肾脏局部的病理改变。尿常规检查如蛋白尿、镜下血尿等虽然无创，但敏感性和特异性均不理想，往往在肾脏已经发生明显损伤后才出现异常，无法实现早期预警。

3、因此，本领域迫切需要开发新型的、无创的、能够准确反映狼疮肾炎病理状态的诊断标志物，以满足临床早期诊断、活动性判断和疗效监测的需求。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的诊断狼疮肾炎且能够区分无肾脏受累的系统性红斑狼疮患者和狼疮肾炎患者的生物标志物——papilin蛋白。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂在制备诊断狼疮肾炎的产品中的应用。

4、在本发明中，papilin蛋白包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的papilin，以及源自细胞中加工的任何形式的papilin。该术语涵盖papilin的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。papilin包含人的papilin以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的papilin，在本发明中，papilin为人的蛋白，其基因id为89932。

5、在本发明的上下文中，所使用的术语“诊断”是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即，不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即，存在疾病或疾患或特性的评估)。术语“诊断”包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。

6、在本发明中，经在本发明收集的真实中国人群临床样本中进行验证发现，所述生物标志物蛋白对狼疮肾炎患者的诊断具有较好的诊断效能，其中，所述诊断效能是通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，roc）进行验证的，曲线下面积（area under the curve，auc）是指本领域技术人员所熟知的roc曲线下的面积，曲线下面积（auc）的测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。

7、具有更大的曲线下面积（auc）的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组（例如，狼疮肾炎患者样本及正常或对照样本）之间准确分类未知物。在于区别两个群体方面上，受试者工作特征曲线（roc）有用于以图表形式来表现特定的特征（例如，本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目）的性能。通常，基于单一特征值，经由整个群体（例如，患者组及对照组）的上述特征数据被升序排列。然后，针对上述特征的每个值，计算对于数据的真阳性率及假阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况（在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数）。

8、受试者工作特征曲线（roc）可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值（single sum value），例如，可数学性地组合两个以上的特性（例如，加、减、乘等），该单一和值可由受试者工作特征曲线（roc）来表示。附加地，能够以受试者工作特征曲线（roc）来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线（roc）为表示相对于测试的假阳性率（1特异性）的测试的真阳性率（灵敏度）的图表。

9、进一步，所述试剂包括采用蛋白质质谱检测、酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、放射免疫分析、放射免疫扩散法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选或蛋白质微阵列方法检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂。

10、进一步，所述试剂包括特异性结合papilin蛋白全长或其片段的抗体、抗体片段、高亲和性多聚体、肽、肽模拟物、核酸适配体。

11、在本发明中，术语“特异性结合”是指两个分子之间的结合(例如配体与受体之间)，其特征在于一个分子(配体)即便在存在多种其他不同分子的情况下能够与另一个具体分子(受体)结合，也就是在异质分子混合物中一个分子对另一个分子表现出优先的结合能力。通过在存在过量未标记配体情况下可检测的标记配体与受体结合的减弱也可以说明配体与受体的特异性结合(亦即竞争结合检测)。

12、在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。术语“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2、和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。本发明的“抗体功能片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

13、进一步，所述样本包括血液、血浆、血清、组织的活检或上皮细胞。

14、进一步，所述样本为血清。

15、在本发明的上下文中，所使用的术语“样本”，是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、细胞提取物及其组合。在本发明具体的实施方案中，所述样本来源于受试者的血清。

16、在本发明的上下文中，所使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。

17、进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、芯片。

18、在一些实施方案中，产品可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本生物标志物papilin蛋白的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中papilin蛋白的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有狼疮肾炎的受试者的样本中发现所述papilin蛋白的水平增加。芯片可被配置成使得仅当papilin蛋白的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色的变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的papilin蛋白的浓度和/或量和/或表达水平与指示患有或易患狼疮肾炎的患者的papilin蛋白的浓度和/或量和/或表达水平。因此，可检测到的输出(例如颜色的变化)的存在立即表明样本中包含显著升高水平的papilin蛋白，表明受试者患有或易患狼疮肾炎。

19、在一些实施方案中，所述试剂盒包括检测papilin蛋白的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

20、本发明所述的试剂盒包括但不限于elisa试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒。

21、术语“免疫印迹法”也称为“蛋白质印迹”或“western blot”指对固定化到载体上的蛋白质(或多肽)的分析。

22、本发明第二方面提供检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂在制备区分狼疮肾炎和无肾脏受累的系统性红斑狼疮的产品中的应用。

23、进一步，所述试剂包括采用蛋白质质谱检测、酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、放射免疫分析、放射免疫扩散法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选或蛋白质微阵列方法检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂。

24、进一步，所述试剂包括特异性结合papilin蛋白全长或其片段的抗体、抗体片段、高亲和性多聚体、肽、肽模拟物、核酸适配体。

25、进一步，所述样本包括血液、血浆、血清、组织的活检或上皮细胞。

26、进一步，所述样本为血清。

27、进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、芯片。

28、本发明第三方面提供一种狼疮肾炎早期辅助诊断系统。

29、进一步，所述诊断系统包括评估单元，所述评估单元根据papilin蛋白的表达量预测受试者患有狼疮肾炎的风险。

30、进一步，所述评估单元的判断方法如下：当受试者样本中所述papilin蛋白的表达量显著高于正常人样本中所述papilin蛋白的表达量时，判断受试者患狼疮肾炎的风险高。

31、进一步，所述诊断系统还包括检测单元，所述检测单元用于检测papilin蛋白的表达量。

32、进一步，所述诊断系统还包括显示单元，所述显示单元用于显示所述评估单元得出的结论。

33、在本发明中，术语“诊断系统”是指在其中需要监控一个或多个终点设备的运行的系统。诊断系统包含彼此传输和/或接收数据的至少两个设备。诊断系统可以是任何尺寸的系统，包括但不限于少则两个装置、多则如产生lan、wan、san、互联网、局域网等等所需的多个装置。

34、本发明第四方面提供一种诊断狼疮肾炎或区分狼疮肾炎和无肾脏受累的系统性红斑狼疮的产品。

35、进一步，所述产品包括检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂。

36、本发明第五方面提供一种体外筛选治疗狼疮肾炎的候选药物的方法。

37、进一步，所述方法包括如下步骤：用待筛选物质处理表达或含有papilin蛋白的体外培养体系；检测所述体外培养体系中papilin蛋白的表达水平；其中，当所述待筛选物质抑制papilin蛋白的表达水平时，该待筛选物质是治疗狼疮肾炎的候选药物。

38、进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

39、进一步，所述待测物质包括(但不限于)：干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。

40、本发明第六方面提供检测样本中papilin蛋白表达水平的试剂在制备狼疮肾炎早期辅助诊断系统或装置中的应用。

41、本发明第七方面提供papilin蛋白在筛选治疗狼疮肾炎的候选药物中的应用。

42、在本发明中，当采用标志物在个体中指示异常进程、疾病或其他病症或作为异常进程、疾病或其他病症的标志时，该标志物与在个体中指示正常进程、无疾病或其他病症或作为正常进程、无疾病或其他病症的标志物的表达水平或值相比较，通常被描述为过表达的或低表达的。该术语还可指大于在特定疾病的不同阶段可检测到的标志物的值或水平(或值或水平的范围)的生物样品中的标志物的值或水平。

43、此外，与在个体中指示正常进程或无疾病或其他病症或作为正常进程或无疾病或其他病症的标记的标志物的“正常”表达水平或值相比较，过表达的或低表达的标志物还可称作“差异表达的”或称作具有“差异水平”或“差异值”。因此，标志物的“差异表达”还可称作标志物的“正常”表达水平的变化形式。

44、术语“差异标志物表达”和“差异表达”互换地用来指相对于其在正常对象中的表达，或相对于其在对特定治疗不同地应答的或具有不同的预后的患者中的表达，其表达在患有特定疾病的对象中被激活为较高或较低水平的标志物。该术语还包括其表达在相同的疾病的不同的阶段被激活为较高或较低水平的标志物。还要理解的是差异表达标志物可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可经受选择性剪接以产生不同的多肽产物。这种差异可通过包括mrna水平、微小rna水平、反义转录物水平或蛋白表面表达、分泌或多肽的其他划分的多种改变来证实。差异标志物表达可包括两个或更多个基因之间或其基因产物之间的表达的比较；或两个或更多个基因之间或其基因产物之间的表达的比率的比较；或甚至相同基因的两个不同加工的产物的比较，其在正常对象和患病对象之间是不同的；或在相同疾病的不同阶段是不同的。差异表达包括例如在正常细胞和病态细胞之间或在经历不同的疾病事件或疾病阶段的细胞之间，在标志物中瞬时表达模式或细胞表达模式中的定量和定性的差异。

45、“表达差异增加”或“上调”表示相对于对照而言，基因表达(以rna表达或蛋白质表达测定)显示增加10%或更多，例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

46、本发明的优点和有益效果：

47、经在本发明收集的中国人群真实临床样本中进行验证发现，papilin蛋白不仅能够用于狼疮肾炎的有效诊断，同时能够有效区分狼疮肾炎患者和无肾脏受累的系统性红斑狼疮患者。本发明为狼疮肾炎的诊断和系统性红斑狼疮的分型诊断提供了全新的思路和策略，在狼疮肾炎诊断这一技术领域具有广泛的应用前景和重要的转化意义。