一种基于多维荧光信号校准的细胞内温度测量方法

本发明涉及荧光成像与生物测量，具体涉及一种基于多维荧光信号校准的细胞内温度测量方法。

背景技术：

1、细胞内温度作为反映细胞代谢状态与生理功能的重要参数，在生物学研究和疾病诊断中具有重要意义。近年来，基于荧光探针的细胞内温度测量方法因其空间分辨率高、可实现亚细胞尺度成像等优势，得到了广泛应用。现有荧光测温方法通常基于荧光强度、比值或荧光寿命与温度之间的单一响应关系，通过在溶液环境中建立校准曲线，并将其应用于细胞内温度测量。

2、然而，细胞内部环境复杂，除温度外，还存在粘度、极性及离子强度等多种因素，这些因素同样会影响荧光探针的发光行为，尤其对于分子转子类荧光探针，其荧光信号对粘度变化高度敏感。在实际测量过程中，上述环境因素的耦合作用容易导致荧光信号变化被误判为温度变化，从而引入较大测量误差。因此，传统基于单一校准曲线的测温方法难以准确反映细胞内真实温度分布。

3、针对上述问题，亟需发展一种能够有效解耦温度与环境因素影响、提高测量准确性的细胞内温度测量方法。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有基于荧光信号的细胞内温度测量方法普遍依赖单一校准曲线，难以区分温度与细胞内微环境参数（包括但不限于粘度）对荧光信号的耦合影响，从而导致测量精度不足的问题，提出一种基于多维荧光响应输入矩阵的细胞内温度测量方法。

2、本发明通过构建包含荧光强度比值与荧光寿命的多参数响应输入矩阵，并建立所述输入矩阵与温度及环境参数之间的矩阵关系模型，结合分级校准策略对所述矩阵关系模型进行逐级修正，实现温度与粘度等环境参数的解耦反演，从而显著提高细胞内温度测量的准确性与稳定性。

3、技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种基于多维荧光信号校准的细胞内温度测量方法，其特征在于，包括以下步骤：

5、步骤 1：构建荧光探针，所述荧光探针包括温度响应单元、参考荧光单元和柔性连接基团，其中，所述温度响应单元包括罗丹明结构，所述参考荧光单元包括半花菁结构，所述温度响应单元和所述参考荧光单元通过柔性链接基团链接；

6、步骤 2：建立荧光探针的光谱读出通道，对荧光探针进行激发和发射光谱表征，采集温度响应单元和参考荧光单元的两个荧光通道的荧光强度；对温度响应单元的罗丹明结构发射通道进行荧光寿命成像，获得每个像素的荧光寿命τ；

7、步骤 3：构建温度-粘度多维校准体系，配制具有不同粘度的标准溶液，在每一粘度下，将标准溶液温度调节至多个温度点，测量温度、粘度、荧光强度和荧光寿命，建立初始二维校准模型，进行温度粘度同步定量；

8、步骤 4：制备待测单细胞样品，将待测细胞接种于玻璃底培养皿中培养后，用pbs清洗细胞，加入含步骤1制备得到的荧光探针的培养液孵育，孵育结束后用pbs清洗，去除游离的荧光探针；

9、步骤5：获取待测单细胞荧光比率图和寿命图，将经步骤4处理后的单细胞样品置于配备flim模块的共聚焦激光扫描显微镜上，使细胞外环境稳定在设置温度，使用脉冲激光激发荧光探针，采集荧光寿命图像，同时采集温度响应单元和参考荧光单元的两个荧光通道的荧光强度图像，获得每个像素的 i590 和 i720，计算得到荧光比率图 r(x,y)；再对每个像素的荧光衰减曲线进行双指数拟合，获得荧光寿命图 τ(x,y)；

10、步骤6：采用细胞模拟体系修正校准矩阵，所述细胞模拟体系修正校准包括巨质膜囊泡一次校正和固定细胞二次校正，所述巨质膜囊泡一次校正为，制备含有荧光探针的巨质膜囊泡，将含有荧光探针的巨质膜囊泡置于带温控载物台的成像系统中，于多个温度下采集荧光强度通道图像和荧光寿命图像，计算荧光比率和寿命，代入步骤3所述的初始二维校准矩阵，得到囊泡测量温度t测，温控系统记录的实际环境温度t实，将测量温度与实际温度比较，用温度偏差进行一次校正，使巨质膜囊泡中的计算温度与实际设定温度一致；

11、所述固定细胞二次校正为，将经荧光探针孵育后的细胞进行固定，将固定后的细胞置于带温控载物台的成像系统中，于多个温度下采集荧光强度比值图r(x,y)和荧光寿命图τ(x,y)，代入一次校正后的校准矩阵，获得固定细胞逐像素温度图，计算固定细胞测量温度与实际设定温度之间的偏差，并对校准矩阵的温度偏置项进行二次校正，得到适用于细胞环境的经细胞模拟体系修正后的最终校准矩阵；

12、步骤7：逐像素计算单细胞温度分布，在获得单细胞的荧光强度图像和荧光寿命图像后，对每一个像素点进行独立计算，重建单细胞温度分布图，像素flim采集得到的荧光衰减曲线进行拟合，得到该像素的荧光寿命τ(x,y)，将每一个像素点的r(x,y)和τ(x,y)输入步骤s6所述的经细胞模拟体系修正后的最终校准矩阵，完成全部像素计算后，将每个像素的t(x,y)按照其原始空间坐标重新排列，得到单细胞温度分布图；同时将每个像素的η(x,y)重新排列，得到单细胞粘度分布图。

13、有益效果

14、本发明基于多维荧光信号校准的细胞内温度测量方法，使用荧光寿命显微镜和荧光共聚焦显微镜，结合矩阵运算方法，实现单细胞内温度的精确成像。与现有技术相比，本发明的优势在于：

15、（1）从原理上实现温度与微环境参数的有效解耦，提高测量准确性。

16、本发明通过构建包含荧光强度比值与荧光寿命的多维荧光响应输入矩阵，并建立所述输入矩阵与温度及环境参数之间的矩阵关系模型，将原本同时受温度与粘度等多因素耦合影响的荧光信号转化为多变量反演问题。相比传统基于单一荧光强度或单一荧光寿命建立的一维校准曲线方法，本发明利用多维响应信号之间的差异化响应特征，实现温度与粘度的数学解耦，从根本上克服了细胞内复杂微环境对测量结果的干扰，提高了温度测量的本征准确性。

17、（2）通过分级校准策略显著降低模型失配误差，提高在细胞环境中的适用性。

18、本发明采用由溶液体系、类细胞体系（如囊泡）以及固定细胞体系构成的分级校准策略，对矩阵关系模型进行逐级修正，使模型参数逐步逼近真实细胞环境。

19、实验结果表明：

20、在溶液体系中，温度测量误差可控制在约 ±0.08 ℃；

21、在类细胞体系中，经校正后测量误差降低至约 0.06 ℃；

22、在固定细胞中，经进一步校准后测量误差可达到 ±0.05 ℃。

23、通过分级环境校准有效降低了由于环境差异引起的系统误差，显著提高了模型在复杂生物体系中的适用性和稳定性。

24、（3）融合多参数信息，提高测量精度与抗干扰能力。

25、本发明同时利用荧光强度比值与荧光寿命两类物理量作为输入参数：

26、荧光强度比值能够消除探针浓度波动和部分光漂白效应；

27、荧光寿命对环境变化敏感且不依赖于激发强度；

28、通过多参数融合，使测量结果具有更高的冗余度与鲁棒性，有效降低单一信号波动带来的误差，从而提升温度测量的准确性与重复性。

29、（4）无需改变探针结构即可实现高精度测量，具有良好的通用性。

30、本发明通过算法建模与校准策略实现信号解耦，无需对现有荧光探针分子结构进行额外设计或改造。因此，该方法可直接适用于多种已有荧光探针体系，降低了实验复杂度与成本，具有良好的通用性与可推广性。

31、（5）实现亚细胞尺度温度成像，拓展生物学研究维度。

32、本发明结合荧光成像与逐像素矩阵运算方法，可获得细胞内温度的空间分布信息，实现亚细胞尺度的温度成像。基于该方法，可进一步获得不同细胞器（如线粒体、溶酶体、细胞质）的温度差异，并用于研究细胞内热传递过程，线粒体代谢与产热行为，细胞在刺激或病理状态下的热响应机制等问题，从而为细胞热力学及相关生命过程研究提供新的技术手段。

33、（6）通过对比实验验证，显著优于传统单参数测量方法。

34、对比采用单一荧光强度或单一荧光寿命建立的传统校准方法，本发明在复杂细胞环境中能够有效避免由粘度等环境因素引起的系统偏差。

35、传统方法在细胞环境中存在明显测量偏差，如传统测温方法测量得到线粒体温度甚至高达50 ℃，引起巨大争议。本发明方法能够将误差控制在亚摄氏度范围内，发现线粒体温度上限在42-43℃之间，过高的测温结果为粘度等误差引起的干扰。

36、说明本发明在复杂生物体系中的测量精度与可靠性显著优于现有技术。