一种PBC熊去氧胆酸治疗应答检测标志物、检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种pbc熊去氧胆酸治疗应答检测标志物、检测方法及其应用。

背景技术：

1、原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，pbc）是一类免疫介导的慢性胆汁淤积性肝脏疾病，核心病理特征为肝内中小胆管发生进行性、非化脓性损伤；疾病持续进展后，会逐步诱发肝纤维化、肝硬化，最终发展为终末期肝功能衰竭。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，udca）是国内外肝病诊疗指南统一推荐的pbc一线标准治疗药物，能够有效延缓病程进展、延长患者无肝移植生存时间。

2、但临床诊疗实践证实，不同pbc患者对udca的治疗应答存在显著个体异质性，临床统计显示约40%的患者接受标准udca治疗后应答不佳，甚至完全无应答，即udca难治型pbc。该类患者肝脏组织损伤持续进展，发生肝硬化失代偿、肝脏相关死亡的风险大幅升高，整体预后较差，udca难治人群的早期识别与规范化管理，是当前pbc临床诊疗亟待解决的核心痛点。

3、若能在pbc确诊初期、udca给药早期精准预判患者药物敏感性，临床医师可及时调整诊疗方案，尽早联用奥贝胆酸、贝特类二线药物，实现个体化精准治疗。但现阶段临床评估udca疗效的手段存在明显滞后缺陷：现行巴黎等评价标准，仅能在患者持续服药6～12个月后，依靠alp、总胆红素等肝功能生化指标完成事后疗效判定；同时行业内缺少可在治疗前/治疗早期使用、兼具高特异性与高灵敏度的分子生物标志物。

4、单细胞rna测序（scrna-seq）、转录组高通量测序等多组学技术，为挖掘疾病关键分子标志物、解析发病机制提供了全新研究手段。现有研究证实，肝脏局部免疫炎症微环境直接决定pbc病程进展与udca药物响应差异，单核细胞等免疫细胞在炎症刺激下发生功能重塑、异常过度激活，是造成患者udca治疗效果分化的核心分子诱因。因此从单细胞转录组层面解析udca应答差异的分子特征，是突破现有疗效预判技术瓶颈的关键研究方向。

5、现有评估udca治疗应答的技术体系存在三类不可忽视的缺陷：其一，评估模式滞后，仅能完成服药后的“事后验证”，无法提前筛选难治型患者，错失早期二线干预的最佳时机；其二，现有预测模型仅依托常规肝功能生化指标构建，未结合肝脏单核细胞免疫炎症微环境机制筛选标志物，难以反映免疫异质性对药物疗效的影响，预测灵敏度与特异性不足；其三，现有有效检测手段依赖肝穿刺活检，属于侵入性操作，不适用于大规模筛查与患者动态随访，目前行业缺少以外周血浆为检测样本、操作便捷无创的客观分层分子指标。

6、因此，如何提供一种可基于外周血浆检测、治疗前或早期即可精准预判pbc患者熊去氧胆酸治疗应答、无创便捷且预测特异性与灵敏度优异的标志物检测方案，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种lgals3和pycard的血浆标志物组合及其检测试剂盒、检测方法，用以解决现有技术udca疗效评估滞后、预测标志物特异性不足、评估手段侵入性强、无法早期筛选难治型pbc患者等问题之一。

2、本发明第一方面提供一种pbc熊去氧胆酸治疗应答检测标志物，其中，所述标志物包括lgals3蛋白与pycard蛋白。

3、所述的pbc熊去氧胆酸治疗应答检测标志物中，所述lgals3蛋白、pycard蛋白取自人体外周血浆。

4、本发明第二发明提供一种预测原发性胆汁性胆管炎患者熊去氧胆酸治疗应答的检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包括用于特异性定量检测上述标志物的试剂。

5、进一步地，所述的检测试剂盒中，所述试检测剂盒采用双抗体夹心elisa法进行蛋白定量，所述检测试剂盒包括：lgals3捕获抗体、lgals3生物素化检测抗体、pycard捕获抗体和pycard生物素化检测抗体。

6、进一步地，所述的检测试剂盒中，所述lgals3标准品线性检测范围为0.156ng/ml–10ng/ml，所述pycard标准品线性检测范围为78.125pg/ml–5000pg/ml。

7、本发明第三方面还提供一种体外预测原发性胆汁性胆管炎患者熊去氧胆酸治疗应答的检测方法，其包括以下步骤：

8、步骤一、测定样本中权利要求1所述的蛋白质标志物的浓度；

9、步骤二、将所述步骤一的浓度检测结果与udca应答人群参考阈值对比，进行治疗应答分层判定。

10、进一步地，所述的检测方法中，所述步骤二中若所述步骤一的浓度检测结果高于udca应答人群参考阈值，则判定该患者为熊去氧胆酸治疗应答不佳高风险人群。

11、进一步地，所述的检测方法中，若所述步骤一中的样本为患者启动熊去氧胆酸治疗前或服药1–3个月后的血浆样本，所述步骤二的判定结果用于提前指导二线药物干预。

12、本发明第四方面还提供一种上述蛋白标志物在制备用于预测原发性胆汁性胆管炎患者熊去氧胆酸治疗应答的体外检测试剂中的应用。

13、进一步地，所述的应用中，所述应用用于无创预判udca治疗效果、动态监测肝脏免疫炎症水平，筛选需早期联用奥贝胆酸或贝特类药物的高危患者。

14、与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

15、1、本发明所述的pbc熊去氧胆酸治疗应答检测标志物，采用lgals3、pycard双血浆蛋白标志物组合，可在患者确诊pbc、启动udca治疗前，或服药1～3个月早期完成疗效分层判定，解决现有巴黎、鹿特丹标准必须等待6～12个月服药周期才能事后评估的局限。临床可提前锁定udca应答不佳高危人群，第一时间规划奥贝胆酸、贝特类二线药物联合方案，解决难治性患者长期接受无效单药治疗的问题，降低肝硬化、肝衰竭、肝移植的发生风险，实现pbc个体化前置诊疗。

16、2、本发明仅采集患者外周静脉血浆完成蛋白定量检测，无需肝穿刺活检等侵入性操作，规避穿刺带来的出血、感染、组织损伤风险，适配初筛、长期动态随访、大范围人群普查等各类临床场景；配套elisa检测体系为检验科成熟常规技术，设备普及、操作简单，各级医院均可落地使用，大幅降低患者检测痛苦与临床操作门槛，相比依赖肝组织检测的传统方案具备极强推广价值。

17、3、本发明经多组公共转录数据集及60例临床真实血浆队列双重验证，udca非应答患者血浆lgals3、pycard蛋白浓度显著高于应答人群与健康对照，两项指标联合检测反映肝脏单核细胞过度活化的炎症病理特征，从疾病免疫机制层面区分药物应答差异，优于仅依靠alp、胆红素等常规生化指标的传统预测模型；同时试剂盒固定lgals3（0.156–10ng/ml）、pycard（78.125–5000pg/ml）标准品线性区间，量化数值客观统一，消除不同地区、不同医师采用临床评分带来的判定分歧，建立标准化udca应答预警体系。

18、4、本发明配套双抗体夹心elisa检测体系经过完整方法学验证，lgals3检测平均变异系数仅5.58%，pycard平均变异系数低至4.53%，批内、批间检测波动极小，数据重复性优异；完整设置捕获抗体、生物素检测抗体、sabc显色体系、标准品全套配套试剂，严格限定孵育、洗板、显色标准化操作流程，标准曲线换算浓度精准，不会出现蛋白饱和、信号失真造成的误判，为临床诊疗提供稳定、可信的分层依据。

19、5、本发明标志物组合兼具疗效预判与炎症动态监测双重作用，除初诊分层外，还可在患者长期服药期间定期抽血复查，实时追踪肝脏免疫炎症水平变化，动态评估udca持续应答状态。

20、本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。