TGME49_219828蛋白在制备弓形虫诊断试剂盒中的应用

本发明属于生物医药领域，涉及tgme49_219828蛋白在制备弓形虫诊断试剂盒中的应用，尤其是一种用于检测猫的弓形虫有性生殖感染阶段的试剂盒。

背景技术：

1、刚地弓形虫（toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的几乎所有温血动物，引起弓形虫病。该病在免疫缺陷个体和孕妇中尤为严重，可导致脑炎、视网膜炎及先天性畸形。在畜牧业中，弓形虫感染是引起孕畜流产的重要原因之一，造成重大经济损失。

2、猫科动物是弓形虫唯一的终末宿主。弓形虫仅在猫肠道内完成有性生殖，形成卵囊并随粪便排出体外。排出的卵囊在外界环境中孢子化后具有高度传染性，可经水源、食物等途径传播给中间宿主，是弓形虫传播扩散的关键环节。因此，准确识别猫体内弓形虫是否经历了有性生殖，对于评估环境污染风险、指导猫群科学管理以及阻断弓形虫传播链具有重要意义。

3、目前，检测弓形虫感染的方法主要包括传统病原学检测、分子生物学检测和血清学检测。病原学检测（如粪便镜检）可直接观察卵囊，但该方法敏感性较低，且仅能检测到正在排囊的猫，无法识别已结束排囊的个体。分子生物学检测（如pcr法）通过扩增弓形虫特异性dna序列，虽敏感性较高，但存在采样时机受限、操作复杂、设备要求高等问题，且同样只能反映瞬时排囊状态。血清学检测能判断猫是否感染弓形虫，但现有血清学方法无法区分猫体内弓形虫是否经历了有性生殖。已有研究表明，即使猫体内存在弓形虫抗体，也可能因免疫压力下降或合并其他感染（如球虫）而再次排囊。因此，仅凭感染状态或瞬时排囊检测，难以满足弓形虫精准防控的需求。

4、近年来，弓形虫有性生殖相关基因的研究逐渐受到关注。转录组学数据显示，部分基因在弓形虫裂殖子及猫肠上皮阶段特异性高表达，可能与有性生殖密切相关。其中，tgme49_219828蛋白（ncbi登录号xp_018634785.1）含有hmg（high mobility group）结构域。该类蛋白在哺乳动物性别决定（如sry因子）及疟原虫有性生殖中发挥重要作用，但其在弓形虫有性生殖中的功能尚未得到开发利用。

5、综上所述，开发一种能够特异性识别猫体内弓形虫是否经历有性生殖的血清学检测方法，具有重要的公共卫生和兽医临床意义。本发明正是基于tgme49_219828蛋白，首次建立了一种间接elisa检测方法（tg219828-ielisa），可用于评估猫群中弓形虫有性生殖的发生情况，为弓形虫环境污染风险评估和猫群科学管理提供了有效工具。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种tgme49_219828蛋白在制备弓形虫诊断试剂盒中的应用，以解决现有弓形虫检测方法无法区分猫体内是否经历有性生殖的问题，本发明还提供一种基于tgme49_219828蛋白的检测方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、tgme49_219828蛋白在制备弓形虫诊断试剂盒中的应用，所述tgme49_219828蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、进一步地，所述tgme49_219828蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、进一步地，所述试剂盒是用于检测猫的弓形虫有性生殖感染阶段的间接elisa试剂盒。

6、进一步地，所述间接elisa检测试剂盒包括：包被有tgme49_219828蛋白的固相载体；酶标二抗；封闭液；显色液；终止液；洗涤液。

7、一种非诊断目的的检测弓形虫有性生殖相关抗体的方法，包括以下步骤：

8、（1）以所述的tgme49_219828蛋白作为包被抗原，包被固相载体；

9、（2）加入封闭液进行封闭；

10、（3）加入稀释的待测猫血清样本进行孵育，使样本中的抗体与抗原特异性结合；

11、（4）加入稀释的酶标二抗进行孵育；

12、（5）加入显色液进行显色反应；

13、（6）加入终止液终止反应；

14、（7）读取630 nm吸光度值，判断样本中是否存在弓形虫有性生殖相关抗体。

15、进一步地，所述tgme49_219828蛋白的包被浓度为0.5 μg/ml，所述待测猫血清样本的稀释倍数为1:400。

16、进一步地，所述封闭液为5%脱脂奶粉，封闭条件为37℃封闭90 min。

17、进一步地，所述酶标二抗为hrp标记的兔抗猫igg，所述酶标二抗的稀释倍数为1:3000。

18、进一步地，所述孵育时间为30min。

19、进一步地，所述显色液为tmb显色液，显色条件为37℃避光显色5min。

20、进一步地，所述终止液为0.25%的氢氟酸溶液。

21、进一步地，所述判断标准为：计算样本s/n值=样本od630/阴性对照od630，若s/n≥3.035，则表明样本中存在弓形虫有性生殖相关抗体，若s/n<3.035，则表明样本中不存在弓形虫有性生殖相关抗体。

22、本发明的有益效果是：

23、首次发现tgme49_219828蛋白能够特异性识别弓形虫有性生殖阶段诱导产生的抗体，可用于区分猫体内弓形虫是否经历了有性生殖，建立的tg219828-ielisa检测方法敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性佳。本发明可用于弓形虫传播监测，如评估猫群中弓形虫有性生殖的发生情况、评估弓形虫环境污染风险、指导猫群科学管理等，为弓形虫防控提供了有效工具。

1.tgme49_219828蛋白在制备弓形虫诊断试剂盒中的应用，所述tgme49_219828蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述tgme49_219828蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒是用于检测猫的弓形虫有性生殖感染阶段的间接elisa试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述间接elisa检测试剂盒包括：包被有tgme49_219828蛋白的固相载体；酶标二抗；封闭液；显色液；终止液；洗涤液。

5.一种非诊断目的检测弓形虫有性生殖相关抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述tgme49_219828蛋白的包被浓度为0.5μg/ml，所述待测猫血清样本的稀释倍数为1:400。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述封闭液为5%脱脂奶粉，封闭条件为37℃封闭90 min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶标二抗为hrp标记的兔抗猫igg，所述酶标二抗的稀释倍数为1:3000。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述显色液为tmb显色液，显色条件为37℃避光显色5min。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述判断标准为：计算样本s/n值=样本od630/阴性对照od630，若s/n≥3.035，则表明样本中存在弓形虫有性生殖相关抗体，若s/n<3.035，则表明样本中不存在弓形虫有性生殖相关抗体。