一种基于免疫层析法ANGPTL3-FLD检测试剂盒及其应用

本发明涉及免疫检测，尤其涉及一种基于免疫层析法angptl3-fld检测试剂盒及其应用

背景技术：

1、血管生成素样蛋白3（angptl3）是一种分泌性糖蛋白。现有研究表明，在肾脏疾病中，angptl3主要由受损的足细胞合成和分泌，其羧基端的纤维蛋白原样结构域（fld）是导致足细胞骨架重排、引发足细胞损伤的核心功能结构域。因此，定量检测尿液中的angptl3-fld片段，对于肾小球疾病（如局灶节段性肾小球硬化、微小病变肾病等）的早期诊断、病情监测和预后评估具有重要临床价值。

2、目前，市面上已有的angptl3检测试剂盒主要存在以下技术缺陷：

3、检测靶点不精准：现有试剂盒多靶向angptl3蛋白的n端螺旋-螺旋结构域（ccd）或全长蛋白，而非直接导致足细胞损伤的c端fld结构域。这使得检测结果与足细胞损伤这一核心病理机制的关联性减弱，特异性不足。

4、操作繁琐，耗时长：现有技术多为酶联免疫吸附测定（elisa），操作步骤复杂（包括多次加样、孵育、洗涤），总耗时通常需要4-6小时，无法满足临床快速检测的需求。

5、灵敏度不足，样本需预处理，对尿液样本中的低丰度angptl3检测灵敏度有限，常需要对尿液样本进行浓缩预处理，进一步增加了操作复杂性和不可控因素，限制了其在临床，特别是基层医疗机构的推广应用。

6、缺乏即时检测（poct）能力：现有检测方法依赖大型专业设备（如酶标仪），无法实现床旁快速检测。

7、因此，开发一种能够特异性识别angptl3-fld片段、与肾小球疾病足细胞损伤等临床金标准诊断方法一致性好、操作简便、检测快速、灵敏度高且无需复杂预处理的体外诊断试剂盒，是当前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于免疫层析法angptl3-fld检测试剂及其应用，本发明筛选出第一抗体和第二抗体，相较人源化抗体其他的抗体对组合，检测效果准确性较高，更加适用血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域的检测，特别适用于足细胞损伤等肾小球疾病的临床诊断应用。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种基于免疫层析法angptl3-fld检测试剂盒，所述试剂盒包括背板和盖板；所述背板上顺次搭接样品垫、结合垫、nc膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光微球标记的第一抗体；所述nc膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被第二抗体，所述质控线包被有兔抗dnp抗体；所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示；所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3中的任一序列所示；所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3中的任一序列所示。

4、本发明中，通过筛选抗体对，获得第一抗体和第二抗体的组合，该组合能够显著提升血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域的检测效果，并对试剂盒中荧光微球，抗体浓度以及多项参数进行优化，最终获得具有高准确性的检测试剂盒，与足细胞损伤临床金标准诊断结果的观察符合率高，特别适用于足细胞损伤等肾小球疾病的无创、快速诊断或筛查。

5、现有技术中，对于血管生成素样蛋白3的生成机制，以及血管生成素样蛋白3与多种代谢调控的关系并不十分清晰，本试剂盒可以为血管生成素样蛋白3的研究提供坚实的物质基础，也可用于足细胞损伤等肾小球疾病的无创、快速诊断或筛查。

6、seq id no:1：

7、qlqlvesggglvqpggslrlscaasgftldyytigwfrqapgkeregiscinsrgsgtnyadsvagrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaadvadiggptcplysdfldywgqgtqvtvss。

8、seq id no:2：

9、evqvvesggglvqpggslrlscaasgftldnyyivwlrqapgkeregvscisrdggttkyadsatgrftisrdnakdtvylqmnslkpedtgvyycaavfstlqyicfitvrnadywgqgtqvivss。

10、seq id no:3：

11、qlqlvesggglvqpggslrlsctasgftldyyaiawfrqapgkeregiscissrggstnyadsvrgrftisrdnaknmvylqmnrlkpedtaiyycaadvgalsgcvfgpgyeydywgqgtqvtvss。

12、当所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，那所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示；

13、优选地，当所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，那所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示；

14、优选地，当所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示，那所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；

15、优选地，当所述第一抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示，那所述第二抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。

16、优选地，所述第一抗体和第二抗体的fc结构域的氨基酸序列各自独立如seq idno:4所示的序列。

17、seq id no:4：

18、epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

19、优选地，所述结合垫上所述第一抗体的浓度为1-5 mg/ml。所述1-5 mg/ml，例如可以是1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml或5 mg/ml等。

20、优选地，所述检测线上第二抗体的浓度为0.1-1 mg/ml。所述0.1-1 mg/ml，例如可以是0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8mg/ml、0.9 mg/ml或1 mg/ml等。

21、优选地，所述质控线上兔抗dnp抗体的浓度为0.1-1 mg/ml。所述0.1-1 mg/ml，例如可以是0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml或1 mg/ml等。

22、优选地，所述荧光微球与所述第一抗体的连接方式包括共价偶联。

23、优选地，所述第一抗体的质量与荧光微球的配比为（25-50）μg:1 mg。所述25-50 μg，例如可以是25 μg、30 μg、35 μg、40 μg、45 μg/或50 μg等。

24、优选地，所述结合垫上荧光微球的质量为0.5-3 mg。所述0.5-3 mg，例如可以是0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、2.5 mg或3 mg等。

25、优选地，所述荧光微球的粒径为200-400 nm。所述200-400 nm，例如可以是200nm、250 nm、300 nm、350 nm或400 nm等。

26、优选地，所述荧光微球的材质包括荧光聚苯乙烯微球。

27、优选地，所述样品垫的材质包括玻璃纤维8975、金标rb45或金标rb65中的任意一种或至少两种的组合。

28、优选地，所述样品垫的长度为15-25 mm，宽度为3.7-3.9 mm。所述15-25 mm，例如可以是15 mm、16 mm、18 mm、20 mm、22 mm、24 mm或25 mm等。所述3.7-3.9 mm，例如可以是3.7 mm、3.75 mm、3.8 mm或3.85 mm等。

29、优选地，所述结合垫的材质包括玻纤8975、金标rb45或金标rb65中的任意一种或至少两种的组合。

30、优选地，所述结合垫的长度为5-15 mm，宽度为3.7-3.9 mm。所述5-15 mm，例如可以是5 mm、6 mm、8 mm、10 mm、12 mm、14 mm或15 mm等。所述3.7-3.9 mm，例如可以是3.7mm、3.75 mm、3.8 mm或3.85 mm等。

31、优选地，所述nc膜的材质包括赛多利斯140硝酸纤维素膜、pall90膜、pall120膜或科百特125膜中的任一种或至少两种的组合；。

32、优选地，所述nc膜的长度为20-30 mm，宽度为3.7-3.9 mm。所述20-30 mm，例如可以是20 mm、22 mm、24 mm、26 mm、28 mm或30 mm等。

33、优选地，所述吸水纸的材质包括通晟abp j270、金标sx30或华创py-006中的任一种或至少两种的组合。所述3.7-3.9 mm，例如可以是3.7 mm、3.75 mm、3.8 mm或3.85 mm等。

34、优选地，所述吸水纸的长度为20-30 mm，宽度为3.7-3.9 mm。所述20-30 mm，例如可以是20 mm、22 mm、24 mm、26 mm、28 mm或30 mm等。所述3.7-3.9 mm，例如可以是3.7 mm、3.75 mm、3.8 mm或3.85 mm等。

35、优选地，所述盖板上方设置加样孔和视窗孔。

36、优选地，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置对应。

37、优选地，所述视窗孔的位置与所述nc膜的检测线和质控线的位置对应。

38、优选地，所述背板或盖板内侧设置内部标识区。

39、优选地，所述盖板表面设置索引二维码标签。

40、优选地，所述背板或盖板的表面设置档条，位于吸水纸顶端。

41、优选地，所述背板和盖板通过扣合连接。

42、第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的基于免疫层析法angptl3-fld检测试剂盒在检测血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域中的应用。

43、第三方面，本发明提供了一种检测血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域的方法，所述方法将待测样本采用第一方面所述的基于免疫层析法angptl3-fld检测试剂盒进行检测。

44、优选地，所述样品加入量为80-120 μl。所述80-120 μl，例如可以是80 μl、90 μl、100 μl、110 μl或120 μl等。

45、优选地，所述待测样本包括血液、组织液或尿液中的任意一种或至少两种的组合。

46、优选地，所述检测的时间为10-20 min。所述10-20 min，例如可以是10 min、12min、14 min、16 min、18 min或20 min等。

47、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

48、1.本发明通过构建第一抗体和第二抗体的组合，能够显著提升血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域的检测效果，并对试剂盒中荧光微球，抗体浓度以及多项参数进行优化，最终获得具有高准确性的检测试剂盒。

49、2.本发明的试剂盒用于科学研究中，可以检测待测样本中血管生成素样蛋白3的纤维蛋白原样结构域的浓度，从而探究血管生成素样蛋白3的生成机制，以及血管生成素样蛋白3与多种代谢调控的关系。

50、3.本发明的试剂盒作为临床方法相比于有创、存在出血和感染风险、无法动态监测且存在抽样误差的肾活检，它完全无创，可反复进行，适用于更广泛的患儿群体，并能识别尿蛋白正常状态下的亚临床足细胞损伤；相比于缺乏特异性、无法精准反映足细胞损伤程度、难以预测复发风险及治疗应答的常规尿蛋白指标，尿液angptl3/cre与足突融合程度呈正相关，可独立预测患儿1年内达到临床完全缓解的结局（auc达0.82，hr=0.62），并能有效区分复发风险高低。