包含E2泛素或泛素样缀合结构域和用于特异性蛋白质降解的靶向结构域的融合蛋白的制作方法

包含e2泛素或泛素样缀合结构域和用于特异性蛋白质降解的靶向结构域的融合蛋白


背景技术：

1.泛素化的特征在于泛素与蛋白质快速且可逆地进行翻译后共价结合。该机制在靶向蛋白质进行降解以及调节其亚细胞定位、细胞内信号传导和与其他蛋白质的相互作用方面起着重要作用(glickman和ciechanover,physiol rev[生理学综述]2002,82(2):373-428；mukhopadhyay和riezman,science[科学]2007,315(5809):201-5；以及schnell和hicke,j biol chem[生物化学杂志]2003,278(38):35857-60)。
[0002]
泛素(ub)是一种小的(76个氨基酸；8.6kda)调节蛋白。将泛素添加到蛋白质中称为泛素化。泛素化涉及泛素c末端的激活。为此，e1 ub激活酶在三磷酸腺苷依赖性反应中与ub形成硫酯键。随后与e2泛素缀合酶缀合(并且可能与hect型e3泛素连接酶缀合为e3～ub中间体)，并且与底物蛋白连接。泛素可以通过(i)赖氨酸残基经由异肽键、(ii)半胱氨酸残基经由硫酯键、(iii)丝氨酸和苏氨酸残基经由酯键或(iv)蛋白质的n末端的氨基基团经由肽键与靶底物结合。
[0003]
可以将单个泛素蛋白(单泛素化)或泛素链(多泛素化)添加到底物中。在多泛素链中，二级泛素分子与七个赖氨酸残基中的一个(例如，k48或k63)或前一个泛素分子的n末端甲硫氨酸连接。将泛素添加到蛋白质中允许通过标记蛋白质以经由蛋白酶体进行降解、改变它们的细胞位置、影响它们的活性以及促进或阻止蛋白质相互作用来调节蛋白质。
[0004]
若干类似于泛素的蛋白质(称为泛素样蛋白(ubl))可以用于类似的机制。人基因组编码至少八个泛素样蛋白家族(不包括泛素本身)，这些蛋白被认为是i型ubl。它们是小泛素样修饰蛋白(sumo)、神经前体细胞表达发育性下调蛋白8(nedd8)、自噬相关蛋白8(atg8)、自噬相关蛋白12(atg12)、泛素相关修饰蛋白1(urm1)、泛素折叠修饰蛋白1(ufm1)、泛素样蛋白fat10和干扰素刺激基因15(isg15)。i型ubl能够共价缀合。共价缀合通过c末端处的一至两个甘氨酸残基发生。人还编码fau泛素样蛋白(fubi)(一种2型ubl)，它不能共价缀合。带sumo或nedd8标签的蛋白质不被识别进行降解；然而，它们在基因转录激活、蛋白质定位和稳定中起作用。每个靶功能组合具有其自身独特的e1、e2和e3酶组合。
[0005]
e2酶起到将泛素转移到靶底物上的作用，并且都共有大约150个氨基酸的核心催化结构域，称为泛素核心催化结构域(ubc结构域)。一般来讲，该结构域呈α/β折叠，通常具有四个α-螺旋和一个4链β片层(stewart等人,cell res[细胞研究]2016,26:423)。重要的环区域形成e3结合位点和e2活性位点的一部分。该表面参与与ring-e3和hect-e3结构域两者结合，并且与由e1酶识别的区域重叠。ubc结构域为大约14-16kda，并且在不同家族成员中的保守度为约35％(dikic等人,nat rev mol cell biol[自然综述：分子细胞生物学]2009,10:659-671)。e2具有已经针对特定系统进行调整的共同折叠。尽管大多数e2仅包含单个结构ubc结构域，但许多具有短的n和/或c末端延伸部，这些延伸部可以赋予重要的e2特异性功能，诸如识别用于链构建e2的结合泛素。一些e2具有功能上重要的插入，包括ube2r1和ube2g2，并且一些e2具有与ubc结构域连接的另外的结构化结构域(例如，ube2k)，或者是大型多结构域蛋白(ube2o或birc6)的一部分。
biol[自然化学生物学]2018,14(2):163-70)、细胞周期蛋白依赖性激酶9(robb等人,chem commun[化学通讯]2017,53(54):7577-80；以及burslem等人,cell chem biol[细胞化学生物学]2018,25(1):67-77)和c-met，其中靶蛋白的降解在效力、选择性和耐药性方面提供了若干优于抑制的优势(pan等人,oncotarget[肿瘤靶标]2016,7(28):44299-44309)。
[0014]
还开发了一系列生物protac。例如，portnoff等人(j biol chem[生物化学杂志],289(11):7844-5)描述了所谓的泛素体(ubiquibody)，它们是工程化的蛋白质嵌合体，将e3泛素连接酶的活性与设计结合蛋白(诸如单链fv胞内抗体或纤连蛋白iii型结构域(fn3)单体(monobody))结合起来。pan等人(oncotarget[肿瘤靶标]7(28):44299-44309)已经开发了特异性诱导突变体kras降解并强效抑制胰腺肿瘤生长的重组嵌合蛋白。该嵌合蛋白包含raf1的ras结合结构域(rbd)和e3衔接蛋白。fulcher等人(open biol[开放生物学]7:170066)描述了一种亲和力导向的蛋白质导弹(adprom系统)，它包含von hippel-lindau(vhl)蛋白质(cullin2(cul2)e3连接酶复合物的底物受体)，该蛋白质拴系到多肽结合物，这些多肽结合物选择性地结合内源靶蛋白并将其募集到cul2-e3连接酶复合物进行泛素化和蛋白酶体降解。另一种基于生物的降解系统是由clift等人(cell[细胞]2017,171(7):1692-1706)开发的所谓的trim-away技术，该技术涉及trim21，一种以高亲和力与抗体的fc结构域结合的e3泛素连接酶。
[0015]
然而，在protac技术可成熟用于临床应用之前，仍然存在各种问题，诸如脱靶效应、体内代谢稳定性、细胞通透性和大分子量。合成和优化此类双功能分子也很困难，这是研究和制造的重大障碍。因此，仍然需要另外的此类双功能分子。


技术实现要素：

[0016]
尽管所有已知的生物protac都需要e3泛素连接酶，但令人惊讶和出乎意料的是，诸位发明人已经鉴定出一类新的含有e2酶的分子，但它们可以经由泛素或泛素样蛋白质途径提供蛋白质的靶向降解或调节。此类分子更容易生产、更小、更容易递送、更少依赖内源蛋白、更容易模块化并且可到达一组更广泛的靶标。
[0017]
本文提供了一种分子，该分子包含(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物。在某些实施例中，该分子不包含e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分。在一些实施例中，该分子是融合多肽。在一些实施例中，该调节结构域在靶向结构域的n末端。在其他实施例中，该调节结构域在靶向结构域的c末端。
[0018]
本文还提供了一种化合物，该化合物包含前述分子以及能够将该分子靶向细胞的靶向部分。本文还提供了包含(i)前述分子以及(ii)能够将该分子靶向细胞的靶向部分的化合物在制备用于在个体中递送该分子的药物中的用途。
[0019]
本披露还提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码前述分子或前述化合物。本文还提供了一种载体，诸如腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体，该载体包含前述多核苷酸。本文还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含该多核苷酸或该载体。本文还提供了一种组合物，该组合物包含前述分子或前述化合物以及另外的治疗剂。
[0020]
本文还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含前述分子、前述化合物、前述多
核苷酸、前述载体、前述宿主细胞或前述组合物以及一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
[0021]
本披露的另一个方面提供了一种将前述分子递送到个体中的细胞的方法，该方法包括：向该个体施用包含(i)该分子以及(ii)能够将该分子靶向该细胞的靶向部分的化合物；或者向该个体施用前述多核苷酸或前述载体，其中该多核苷酸或载体在该细胞中编码该分子。
[0022]
本披露的另一个方面提供了一种多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含：(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向该底物；任选地其中该试剂盒不包含e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分。
[0023]
本文还提供了一种多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含：(a)前述分子；以及(b)靶向部分，该靶向部分能够靶向含有待调节的底物的细胞，任选地其中该靶向部分是结合配偶体，诸如抗体。
[0024]
本文还提供了一种预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用前述分子、前述化合物、前述多核苷酸、前述载体、前述宿主细胞、前述药物组合物或前述组合物。本文还提供了前述分子、前述化合物、前述多核苷酸、前述载体、前述宿主细胞、前述药物组合物或前述组合物，其在预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症中使用。在一些实施例中，疾病或病症是癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、病毒性疾病、细菌性疾病、朊病毒性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病、关节炎、免疫缺陷或炎性疾病。
[0025]
本文还提供了一种调节底物的方法，该方法包括使该底物与前述分子在该分子有效调节该底物的条件下接触。在一些实施例中，调节涉及底物被降解，或阻止底物被降解，或底物的亚细胞定位被改变，或底物的一种或多种活性被调节(例如，增加或减少)，或底物的翻译后修饰的程度被调节。
[0026]
本文还提供了一种将底物鉴定为潜在药物靶标的方法，该方法包括：(a)提供包含该底物的细胞、组织或器官；(b)使该细胞、组织或器官与前述分子、前述化合物、前述多核苷酸或前述载体接触；以及(c)评估该分子、化合物、多核苷酸或载体对该细胞、组织或器官的一种或多种特性的影响，其中鉴定与特定疾病状态相关的影响指示该底物是该特定疾病的潜在药物靶标。
[0027]
本文还提供了一种评估底物的功能的方法，该方法包括：(a)提供包含该底物的细胞、组织或器官；(b)使该细胞、组织或器官与前述分子、前述化合物、前述多核苷酸或前述载体接触；以及(c)评估该分子、化合物、多核苷酸或载体对该细胞、组织或器官的一种或多种特性的影响。
[0028]
本文还提供了一种鉴定可用于预防或治疗由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的测试剂的方法，该方法包括：提供该底物；提供测试剂，该测试剂包含(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2泛素或泛素样结构域具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物，任选地其中该测试剂不包含e3泛素或泛素样连接酶或其部分；使该底物和测试剂在该测试剂有效促进该底物的调节的条件下接触；以及确定该测试剂是否调节该底
物。在一些实施例中，该方法进一步包括在疾病或病症的测定中测试测试剂的步骤。
附图说明
[0029]
图1.mda-mb-231细胞中shp2蛋白的降解，比较e3融合多肽和e2融合多肽。(图1a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了shp2和上样对照α微管蛋白。e2融合多肽ube2d1_acs3的两个重复样品，其中shp2蛋白水平降低。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。(图1b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为对照mda-mb-231细胞shp2水平的百分比。数据代表多个细胞系中的多个重复。
[0030]
图2.mda-mb-231细胞中shp2蛋白的降解，比较e3连接酶和e2生物融合多肽中的取向和接头长度。(图2a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了shp2蛋白和gapdh上样对照。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。(图2b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为gapdh上样对照条带密度，然后表示为对照mda-mb-231细胞shp2水平的百分比。ube2d1调节结构域构建体使用较短的名称e2d1。在样品名称中，“短”和“长”分别指9和19个氨基酸的不同接头长度。
[0031]
图3.比较e3连接酶和e2生物融合多肽中的取向和接头长度的u20s细胞中shp2蛋白的降解。(图3a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了shp2蛋白和gapdh上样对照。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。(图3b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为gapdh上样对照条带密度，然后表示为对照u20s细胞shp2水平的百分比。ube2d1调节结构域构建体使用较短的名称e2d1。在样品名称中，“短”和“长”分别指9和19个氨基酸的不同接头长度。(图3c)使用e2d1_linker_acs3(ube2d1_linker_acs3)构建体在用cytation 5()成像后基于荧光信号比较不同接头长度和shp2降解效率的图。使用对shp2和ha标签蛋白特异的抗体探测这些表位水平的荧光强度，并且基于在每个实验中未处理的细胞中发现的shp2水平将shp2水平归一化为范围0-100％。数据对应于n＝3或更多个生物重复。接头长度的残基数量是指接头序列中氨基酸的数量。
[0032]
图4.比较作为结合结构域的shp2结合单体的高和低亲和力变体的mda-mb-231细胞中shp2蛋白的降解。将对shp2具有高亲和力的标准acs3单体(shp2 c-sh2结构域kd＝4-9.1nm)与具有较低亲和力的v33r acs3突变体(shp2 c-sh2结构域kd＝1.2um；sha等人,proc.natl.acad.sci.u s a[美国国家科学院院刊],2013110(37):14924-9和补充信息)进行比较。注意：单体acs3在本文中也称为cs3。(图4a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体(具有acs3和acs3 v33r突变体结合结构域)后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了shp2蛋白和gapdh上样对照。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。在蛋白质印迹中存在e2d1_长_acs3的两个重复样品。(图4b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为gapdh上样对照条带密度，然后表示为对照mda-mb-231细胞shp2水平的百分比。ube2d1调
节结构域构建体使用较短的名称e2d1。在样品名称中，“长”是指调节结构域与结合结构域之间的19个氨基酸的接头。
[0033]
图5.比较作为结合结构域的shp2结合单体的高和低亲和力变体的u20s细胞中shp2蛋白的降解。将对shp2具有高亲和力的标准acs3单体(shp2 c-sh2结构域kd＝4-9.1nm)与具有较低亲和力的v33r acs3突变体(shp2 c-sh2结构域kd＝1.2um；sha等人,proc.natl.acad.sci.u s a[美国国家科学院院刊],2013 110(37):14924-9和补充信息)进行比较。注意：单体acs3在本文中也称为cs3。(图5a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体(具有acs3和acs3v33r突变体结合结构域)后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了shp2蛋白和gapdh上样对照。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。(图5b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为gapdh上样对照条带密度，然后表示为对照u20s细胞shp2水平的百分比。ube2d1调节结构域构建体使用较短的名称e2d1。在样品名称中，“长”是指调节结构域与结合结构域之间的19个氨基酸的接头。
[0034]
图6.使用k19 darpin_e2融合多肽和k19 darpin_e3融合多肽进行kras的降解的比较。darpin k19与gdp-和gtp-结合的kras结合(bery等人,nat commun[自然通讯]201910(1):2607)，而e3_5是阴性对照(非结合)darpin。在mda-mb-231和ad293细胞系中测试darpin融合多肽构建体。(图6a)慢病毒转导所编码的对照和融合多肽构建体后mda-mb-231和ad293细胞裂解物的蛋白质印迹。示出了kras蛋白和α微管蛋白上样对照蛋白。黑色框标识来自用e3连接酶融合多肽转导的细胞的裂解物，并且灰色框标识e2融合多肽构建体。(图6b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将kras蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后分别表示为对照mda-mb-231或ad293细胞kras水平的百分比。
[0035]
图7.e3和e2融合多肽的示意图。(图7a)包含经由接头与结合结构域融合的e3连接酶vhl的e3生物融合多肽的实例。如先前由fulcher等人(fulcher等人,2017,open biol[开放生物学]7:170066)所述。结合结构域(例如，单体、纳米抗体或抗体模拟物)可以将细胞中的靶蛋白(内源蛋白或者非内源或异位表达的蛋白，诸如病毒蛋白)募集到elob/c/cul2/rbx1 e3连接酶机器。该复合物然后结合e2缀合酶，从而允许泛素转移到靶蛋白。添加多个泛素分子形成链称为多泛素化，并且标记靶蛋白以供蛋白酶体降解。替代性e3连接酶融合多肽可能需要不同蛋白质的参与，以允许靶蛋白的泛素化。(图7b)包含经由接头与结合结构域直接融合的e2泛素缀合结构域的e2生物融合多肽的实例。结合结构域(例如，单体、纳米抗体或抗体模拟物)可以结合细胞中的靶蛋白(内源蛋白或者非内源或异位表达的蛋白，诸如病毒蛋白)，从而允许e2泛素缀合结构域将泛素转移到靶蛋白。靶蛋白的多泛素化将导致蛋白酶体降解靶蛋白。在这些实例中，如果e2泛素缀合结构域被泛素样缀合结构域替代，则泛素样分子(例如，sumo、nedd8、rub1、atg8、atg12、isg15、fau或urm1)将被转移到靶蛋白，而不是泛素被转移到靶蛋白。
[0036]
图8.在mda-mb-231细胞中研究与acs3结合结构域融合的一组e2泛素缀合酶和e2泛素样缀合酶核心结构域对shp2蛋白表达的影响。26种不同的e2泛素缀合酶和e2泛素样缀合酶核心结构域在慢病毒质粒上作为融合蛋白以下列形式编码：ha标签_e2_接头_acs3。然后产生慢病毒颗粒并用于转导mda-mb-231细胞。(图8a)慢病毒转导所编码的对照和e2融合构建体组后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对shp2、ha标签(指示融合蛋白的表
达水平)和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。在每个单独的凝胶上运行来自用编码ube2d1_acs3融合蛋白的慢病毒颗粒转导的mda-mb-231细胞的蛋白质裂解物以用于比较目的。(图8b)显示相对于用ube2d1_acs3融合多肽观察到的shp2降解的针对每种e2核心结构域融合蛋白观察到的shp2蛋白的量的图。使用蛋白质印迹信号的密度测定计算值。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对在用编码ube2d1_acs3融合多肽的慢病毒颗粒转导的细胞观察到的shp2水平的百分比。感兴趣的核心结构域是能够将shp2蛋白水平降低至与ube2d1_acs3相似或比其更大的程度的那些。
[0037]
图9.在u20s细胞中研究与acs3结合结构域融合的一组e2泛素缀合酶和e2泛素样缀合酶核心结构域对shp2蛋白表达的影响。26种不同的e2泛素缀合酶和e2泛素样缀合酶核心结构域在慢病毒质粒上作为融合蛋白以下列形式编码：ha标签_e2_接头_acs3。然后产生慢病毒颗粒并用于转导u20s细胞。(图9a)慢病毒转导所编码的对照和e2融合构建体组后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对shp2、ha标签(指示融合蛋白的表达水平)和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。在每个单独的凝胶上运行来自用编码ube2d1_acs3融合蛋白的慢病毒颗粒转导的u20s细胞的蛋白质裂解物以用于比较目的。(图9b)显示相对于用ube2d1_acs3融合多肽观察到的shp2降解的针对每种e2核心结构域融合蛋白观察到的shp2蛋白的量的图。使用蛋白质印迹信号的密度测定计算值。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对在用编码ube2d1_acs3融合多肽的慢病毒颗粒转导的细胞观察到的shp2水平的百分比。感兴趣的核心结构域是能够将shp2蛋白水平降低至与ube2d1_acs3相似或比其更大的程度的那些。
[0038]
图10.研究使acs3结合结构域内的赖氨酸残基突变对shp2降解和融合多肽表达水平的影响。acs3单体含有3个赖氨酸残基(k7、k55和k64)，这使其在表达为具有e2泛素缀合酶的融合蛋白时易于(自身)泛素化和降解。使三个acs3赖氨酸残基单独和组合突变，并在细胞中表达为ha标签e2d1接头_acs3形式的ube2d1融合多肽的结合结构域。内部进行的结构建模指示哪些氨基酸残基变化应保持单体稳定性。使赖氨酸残基k7突变为谷氨酰胺(k7q)。使赖氨酸残基k55突变为酪氨酸(k55y)，并且使赖氨酸残基k64突变为组氨酸(k64h)。表达含有这些acs3变体的融合多肽的细胞中对shp2降解和融合多肽表达的影响通过分别探测shp2蛋白和ha标签表达水平的蛋白质印迹来测量。(图10a)慢病毒转导所编码的对照和赖氨酸突变的acs3变体融合多肽构建体后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对shp2、ha标签(指示融合蛋白的表达水平)和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。(图10b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将shp2蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为对照u20s细胞shp2水平的百分比。(图10c)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将带ha标签的融合多肽水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为带ha标签的ube2d1_acs3(wt)水平的百分比。
[0039]
图10续.使融合多肽的ube2d1或ube2b调节结构域的催化位点突变或者降低结合结构域对靶蛋白的亲和力减少了靶蛋白降解。(图10d)用编码shp2靶向融合多肽变体的mrna转染u20s细胞(使用acs3结合结构域，其中所有赖氨酸(即k7q、k55y、k64h)被去除)，并且在孵育24小时后通过蛋白质印迹测定靶shp2蛋白水平。用编码egfp的mrna作为对照(非降解mrna)转染u20s细胞。变体包括(i)使调节结构域的催化性半胱氨酸残基突变，例如
ube2d1(c85a)和ube2b(c88a)，((ii)用acs3的v33r突变降低结合结构域对shp2的亲和力，以及(iii)使参与与e3连接酶相互作用的ube2d1残基突变(即f62a)以确定对活性的影响。根据在用egfp转染的u20s细胞中(图10e)ube2d1和(图10f)ube2b融合多蛋白相对于上样对照水平并归一化为shp2水平的蛋白质印迹条带强度的密度测定测量结果来量化shp2表达水平。
[0040]
图11.使用包含靶向hur的v
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纳米抗体(hur8和hur17)结合结构域的ube2d1融合体研究人抗原r(hur)在mda-mb-231细胞中的降解。hur主要是核蛋白。包括具有cas9 v
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纳米抗体结合结构域的对照ube2d1融合蛋白。cas9是细菌蛋白，因此不会在哺乳动物细胞中内源性表达。因此，cas9 v
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纳米抗体不应选择性地与哺乳动物细胞中的任何蛋白质结合。在两种取向上研究融合构建体对hur蛋白水平的影响。(图11a)慢病毒转导所编码的对照(ube2d1_cas9 v
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)以及hur结合变体融合多肽构建体ube2d1_hur17和ube2d1_hur8后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对hur和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。(图11b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将hur蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对表达ube2d1_cas9 v
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的细胞观察到的hur水平的百分比。(图11c)慢病毒转导所编码的对照(cas9 v
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_ube2d1)以及hur结合变体融合多肽构建体hur17_ube2d1和hur8_ube2d1后mda-mb-231细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对hur和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。(图11d)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将hur蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对表达cas9 v
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_ube2d1的细胞观察到的hur水平的百分比。
[0041]
图12.使用包含靶向hur的v
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纳米抗体(hur8和hur17)结合结构域的ube2d1融合体研究人抗原r(hur)在u20s细胞中的降解。hur主要是核蛋白。包括具有cas9 v
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纳米抗体结合结构域的对照ube2d1融合蛋白。cas9是细菌蛋白，因此不会在哺乳动物细胞中内源性表达。因此，cas9 v
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纳米抗体不应选择性地与哺乳动物细胞中的任何蛋白质结合。在两种取向上研究融合构建体对hur蛋白水平的影响。(图12a)慢病毒转导所编码的对照(ube2d1_cas9v
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)以及hur结合变体融合多肽构建体ube2d1_hur17和ube2d1_hur8后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对hur和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。(图12b)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将hur蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对表达ube2d1 cas9v
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的细胞观察到的hur水平的百分比。(图12c)慢病毒转导所编码的对照(cas9 v
hh
_ube2d1)以及hur结合变体融合多肽构建体hur17_ube2d1和hur8_ube2d1后u20s细胞裂解物的蛋白质印迹。用针对hur和α微管蛋白(作为上样对照)的抗体探测蛋白质印迹。(图12d)显示蛋白质印迹信号的密度测定的图。将hur蛋白水平的条带密度归一化为α微管蛋白上样对照条带密度，然后表示为针对表达cas9 v
hh
_ube2d1的细胞观察到的hur水平的百分比。
[0042]
图13.比较hpac细胞系中kras降解的不同降解结构域的图。用编码靶向kras的protac的慢病毒转导hpac胰腺癌细胞系(使用kras结合darpin k19)。研究了含有以下降解结构域的protac：ube2d1(e2d1)、ube2b(e2b)和vhl。在“结合结构域_调节结构域”和“调节结构域_结合结构域”两种取向上测试kras靶向的protac。阴性对照darpin e3_5以如下取向与各种降解结构域组合用作阴性对照结合结构域：e3_5_调节结构域。(图13a)用慢病毒protac构建体转导的细胞裂解物中kras和上样对照α微管蛋白表达的蛋白质印迹。(图13b)
使用kras和α微管蛋白表达的蛋白质印迹密度测定法量化kras表达的图。数据相对于单独未处理细胞的对照示出，并且被归一化为α微管蛋白上样对照水平。
具体实施方式
[0043]
本披露涉及使用包含靶向部分和调节结构域的分子的靶向蛋白调节以及这种调节用于研究蛋白质功能和抗击疾病的用途。具体地，本披露的第一方面提供了一种分子，该分子包含：(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％、85％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物。
[0044]
所谓术语“分子”，我们包括具有如本文定义的调节结构域和靶向结构域的任何实体的含义。在一个优选的实施例中，该分子是多肽。在一些实施例中，调节和靶向结构域经由多肽接头附接。优选地，该分子是多肽，并且调节结构域和靶向结构域经由多肽接头附接，如本文进一步所述。
[0045]
应当理解，提及调节结构域和靶向结构域仅指具有如本文所解释的调节和靶向的相应功能的分子的离散部分。这样，本披露的分子可以被认为是双功能分子，它通常包含由适当长度的接头连接的两个蛋白质结合结构域。考虑到结构域各自不同的功能，应当理解，该分子一般是异双功能的。
[0046]
所谓调节结构域，我们包括本披露的分子中能够促进靶底物的调节(诸如调节靶底物的一种或多种活性和/或调节靶底物的细胞定位和/或调节靶底物的稳定性和/或调节靶底物的翻译后修饰的程度)的部分的含义。调节结构域可通过任何方式而导致对靶标的调节；然而，由于调节结构域包含e2泛素或泛素样缀合结构域，应当理解，调节通常通过将泛素或泛素样蛋白质缀合到靶底物来介导。技术人员将意识到缀合到靶底物的不同泛素或泛素样蛋白将对靶底物的一种或多种活性和/或对靶底物的细胞定位和/或对靶底物的稳定性产生不同影响，这取决于哪种泛素或泛素样蛋白缀合到其上。在herrman等人(circ res[循环研究]2007,100(9):1276-1291)中综述了此类影响。而且，泛素或泛素样蛋白缀合到靶底物可通过空间效应(诸如例如通过空间位阻减缓化学反应的速率和/或阻止下游信号传导)来调节靶底物的活性。由于添加泛素/泛素样蛋白具有尺寸，将泛素或泛素样分子添加到底物可能直接阻碍底物与结合配偶体的相互作用(例如，ras:raf结合可能被阻断，从而停止信号传导)。为避免疑义，如本文所用的术语“调节”涵盖所有此类影响。
[0047]
在一个实施例中，调节包括靶底物被降解，或靶底物的稳定性增加，或靶底物的亚细胞位置被改变，或靶底物的一种或多种活性被调节(例如，增加或减少)，或靶底物的翻译后修饰的程度被调节。
[0048]
在一个具体的实施例中，调节结构域包含e2泛素缀合结构域，它能够将泛素缀合到靶底物，使得靶底物由此被降解。这样，当调节结构域起到降解靶底物的作用时，应当理解，它可被称为降解结构域。
[0049]
在另一个具体的实施例中，调节包括e2泛素样缀合结构域，它能够调节靶底物的亚细胞定位或调节靶底物的一种或多种活性。
[0050]
因此，取决于该结构域所施加的调节的特性，应当理解，调节结构域可以被认为是降解结构域、定位结构域、激活结构域或去激活结构域。在一个优选的实施例中，调节结构
域是降解结构域。
[0051]
在一个优选的实施例中，调节结构域由于其含有e2泛素缀合结构域而起到降解靶底物的作用，在这种情况下它可被称为降解结构域。
[0052]
所谓降解，我们包括靶底物的量由于靶底物在蛋白酶体中被降解而减少的含义。与不存在本披露的分子时的靶底物的量相比，当存在本披露的分子时，靶底物的量可减少。例如，在存在本披露的分子的情况下，与不存在本披露的分子的情况下靶底物的量相比，靶底物的量可减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。类似地，当细胞含有本披露的分子时，应当理解，与不存在本披露的分子的情况下细胞中靶底物的水平相比，该分子可使细胞中靶底物的量减少例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。优选地，靶底物的量减少到不可检测的水平。在一个实施例中，本披露的分子导致降解在不存在本披露的分子的情况下的靶底物的量的30-100％，诸如40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％或90-100％。应当理解，底物可在不存在本披露的分子的情况下以背景水平降解，例如作为正常蛋白质转换的一部分。在这种情况下，调节可起到降解靶底物的程度大于背景降解速率的作用。
[0053]
对于细胞内靶底物，降解程度可以通过测量含有本披露的分子的细胞中的靶底物的水平以及测量在其他方面基本上相同但不包含本披露的分子的细胞中的靶底物的水平来评估。所谓“基本上相同”，我们包括细胞是相同类型(例如，表达基本上相同的细胞表面标志物)和/或来自相同组织和/或处于细胞周期的相同阶段的含义。替代性地，可在不存在本披露的分子的情况下测量细胞中的靶底物的起始量，然后在将本披露的分子添加到细胞中之后测量靶底物的量。作为又一个替代方案，还可将其中存在本披露的分子的细胞中的靶底物的量与阴性对照进行比较。所谓“阴性对照”，我们包括其中存在本披露的分子的无活性型式(例如，缺乏靶向结构域和/或调节结构域或者包括非功能靶向和/或调节结构域的分子)的细胞的含义。例如，无活性型式可缺乏底物的结合结构域或可具有不相关的结合结构域。类似地，无活性型式可包含无活性调节结构域，例如不能与介导调节所需的一个或多个结合配偶体相互作用的调节结构域。例如，如下文(包括在实例6中)进一步所述，含有突变f62a的e2酶的变体ube2d1完全废除调节活性。不希望受任何理论的束缚，诸位发明人认为这是由于f62残基参与ube2d1与环型e3连接酶诸如rnf4之间的相互作用。因此，应当理解，阴性对照可以是其中e2蛋白不能与e3蛋白相互作用的阴性对照，诸如在对应于e2蛋白ube2d1中的f62的位置处包含突变(例如，f62a)的阴性对照。在另一个实例中，无活性调节结构域可在催化性半胱氨酸残基的位置处包含一个或多个突变，由此废除其催化活性。调节结构域的催化性半胱氨酸残基中的示例性突变包括针对ube2d1的c85a和针对ube2b的c88a，它们消除调节活性。本披露在下表12a中提供了此类阴性对照融合蛋白的实例。同样，优选的是，阴性对照的细胞在其他方面与含有本披露的分子的细胞基本上相同。因此，应当理解，提及与不存在本披露的分子的情况下的底物的量相比至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等的降解包括与在其他方面基本上相同但不包含本披露的分子的细胞中的底物的量相比、或者与在细胞中添加本披露的分子之前细胞中的底物的量相比、或者与含有本披露的分子的无活性型式的细胞中的底物的量相比的含义。
[0054]
在存在和不存在本披露的分子的情况下评估靶底物的水平可以使用本领域熟知的技术进行。例如，评估蛋白质的水平是本领域的标准实践，并且可使用任何合适的方法。
例如，可使用免疫测定(诸如elisa)或放射免疫测定、免疫荧光、hplc、凝胶电泳和毛细管电泳(随后例如通过uv或荧光检测)来检测和量化靶底物。通过质谱法测量靶底物的水平的方法是本领域熟知的，并且可使用任何合适形式的质谱法。也可使用蛋白质印迹、免疫沉淀、石蜡免疫组织化学、免疫荧光、荧光原位杂交和流式细胞术。如实例中进一步所述，蛋白质印迹和密度测定是检测和量化靶底物的便捷方式。
[0055]
如上所述，在一些实施例中，取决于哪种泛素或泛素样蛋白附接到靶底物，调节结构域可被认为是定位结构域、激活结构域或去激活结构域。
[0056]
所谓定位结构域，我们包括起到引导靶底物使得它优先驻留在特定细胞位置(例如，一个或多个特定亚细胞位置，诸如细胞器)中的作用的结构域的含义。例如，在存在本披露的分子的情况下，与不存在本披露的分子的情况下将残留在特定亚细胞位置中的靶底物的比例相比，该分子的定位结构域可导致细胞内更高比例的靶底物驻留在那些特定亚细胞位置中。评估靶底物的细胞定位的方法是本领域熟知的，并且可使用任何合适的方法，诸如免疫组织化学技术。此类定位结构域的实例以及泛素样蛋白与靶底物的缀合在定位背景下的作用包括embabe等人(“mdm2-mediated neddylation of hur controls the nuclear localization of hur and protects it from degradation[mdm2介导的hur的nedd化控制hur的核定位并保护其免于降解],”hepatology[肝脏病学]2012,55(4):1237-48)、wen等人(“sumoylation promotes nuclear import and stabilization of polo-like kinase 1to support its mitotic function[sumo化促进polo样激酶1的核输入和稳定以支持其有丝分裂功能],”cell rep[细胞报告]2017 21,2147
–
59)、matunis等人(“a novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the ran-gtpase-activating protein rangap1 between the cytosol and the nuclear pore complex[一种新型泛素样修饰调节ran-gtp酶激活蛋白rangap1在细胞溶胶与核孔复合物之间的分配],”j cell biol[细胞生物学杂志]1996,135(6pt 1):1457-70)和mahajan等人(“a small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting rangap1 to nuclear pore complex protein ranbp2[一种参与将rangap1靶向核孔复合蛋白ranbp2的小泛素相关多肽],”cell[细胞]1997 88(1):97-107)所证明的那些，这些文献全部通过援引并入本文。
[0057]
所谓激活结构域，我们包括与不存在本披露的分子的情况下的一种或多种活性的参考水平相比起到增加靶底物的一种或多种活性的作用的结构域的含义。一种或多种活性可包括与细胞实体诸如蛋白质和/或核酸的结合相互作用或者酶活性或信号传导活性。相对于不存在本披露的分子的情况下的一种或多种活性，一种或多种活性可增加到1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。此类活性可以使用本领域熟知的技术诸如elisa来测定，并且技术人员将能够通过查询科学文献来针对所讨论的靶底物定制这些测定。此类激活结构域的实例以及泛素样蛋白与靶底物的缀合在激活背景下的作用包括soucy等人(“cullin-ring ubiquitin e3 ligases require nedd8modification to be activated[cullin-ring泛素e3连接酶需要nedd8修饰才能激活],”clin cancer res[临床癌症研究]2009,15(12):3912-16)和noh等人(“neddylation increases rcan1 binding to calcineurin[nedd化增加rcan1与钙调磷酸酶结合],”plos one[公共科学图书馆
·
综合]2012,7(10):e48315)所证明的那些，这些文献全部通过援引并入本文。
[0058]
所谓去激活结构域，我们包括与不存在本披露的分子的情况下的一种或多种活性的参考水平相比起到降低靶底物的一种或多种活性的作用的结构域的含义。一种或多种活性可包括与细胞实体诸如蛋白质和/或核酸的结合相互作用或者酶活性或信号传导活性。相对于不存在本披露的分子的情况下的一种或多种活性，一种或多种活性可降低到1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10，并且优选降低至不可检测的水平。此类去激活结构域的实例和泛素样蛋白与靶底物的缀合在去激活背景下的作用包括kamynina和stover(“srebp sumoylation inhibits srebp transcriptional activity indirectly through the recruitment of a co-repressor complex that includes histone deacetylase 3(hdac3)[srebp sumo化通过募集包括组蛋白脱乙酰酶3(hdac3)的共阻遏复合物间接抑制srebp转录活性],”adv exp med biol[实验医学与生物学进展]2017,963:143-68)和yang等人(“sumoylation inhibits sf-1activity by reducing cdk7-mediated serine 203phosphorylation[sumo化通过减少cdk7介导的丝氨酸203磷酸化来抑制sf-1活性],”mol cell biol[分子细胞生物学]2009,29(3):613-25)所证明的那些，这些文献全部通过援引并入本文。
[0059]
所谓“e2泛素或泛素样缀合结构域”，我们包括能够将泛素或泛素样蛋白缀合到靶底物的结构域的含义。例如，调节结构域可含有能够与泛素结合并将泛素转移到靶底物的e2泛素缀合结构域。替代性地，调节结构域可含有能够与泛素样蛋白(诸如sumo、nedd8、atg8、atg12、isg15、ufm1、fat10、urm1和fubi中的任一种)结合并将泛素样蛋白转移到靶底物的e2泛素样缀合结构域。
[0060]
在一些实施例中，当e2泛素或泛素缀合结构域与选择性地靶向所讨论的靶底物的靶向结构域一起成为本披露的分子的一部分时，可评估e2泛素或泛素样缀合结构域缀合靶底物的能力。因此，在一个实施例中，本披露的分子内的e2泛素或泛素样缀合结构域能够将泛素或泛素样蛋白缀合到靶底物，使得至少10％的靶底物缀合到泛素或泛素样蛋白。优选地，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的靶底物缀合到泛素或泛素样蛋白。评估可在体内或体外进行。例如，评估可通过重组生物化学测定或在细胞中进行。
[0061]
应当理解，泛素或泛素样蛋白与靶底物的缀合可使用本领域常规方法直接或间接评估。例如，泛素或泛素样蛋白与靶底物的缀合可通过检测作为泛素或泛素样蛋白缀合的标志物的靶底物的分子量变化(例如，通过sds page分离)或者通过使用例如基于对泛素或泛素样蛋白特异的抗体的蛋白质印迹和免疫测定来直接测量。替代性地，泛素或泛素样蛋白与靶底物的缀合可例如通过评估缀合的下游效应(即靶底物的降解或如本文所述的另一种调节)来间接测量。同样，任何合适的技术可以用于如本领域熟知且如本文和实例中所述的此类间接测量。应当理解，此类测定可以是体内或体外的。测量泛素或泛素样缀合的方式的具体实例包括细胞测定诸如定量活细胞测定(参见例如richting等人“quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of protac mode of action[protac作用模式的定量活细胞动力学降解和机制分析],”acs chem biol[acs化学生物学]2018,13(9):2758-70)、生物素化测定诸如体内生物素化测定(参见例如pirone等人“a comprehensive platform for the analysis of ubiquitin-like protein modifications using in vivo biotinylation[使用体内生物素化分析泛素样蛋白修饰
的综合平台],”sci rep[科学报告]2017,7:40756)、质谱法和/或免疫染色。活性也可使用重组测定诸如重组测定(参见例如英国剑桥的艾博抗公司(abcam，cambridge，uk)提供的那些)来测量。
[0062]
人具有约41种e2酶，并且氨基酸序列(以及编码它们的cdna的核苷酸序列)可通过参考genbank或uniprot获得。编码各种人e2酶的氨基酸序列和核苷酸序列也包括在下表7-9中。应当理解，人e2将在人类细胞中与治疗用途相容，并且不太可能在人类中引起免疫原性反应。
[0063]
e2酶存在多种分类。例如，michelle等人(j mol evol[分子进化杂志]2009,68:616-628)已基于系统发生分析将这些酶分为17个家族，即家族1-17，并且所有此类家族都包括在本披露的范围内。因此，所谓本文所述的e2酶，我们包括选自家族1e2酶、家族2e2酶、家族3e2酶、家族4e2酶、家族5e2酶、家族6e2酶、家族7e2酶、家族8e2酶、家族9e2酶、家族10e2酶、家族11e2酶、家族12e2酶、家族13e2酶、家族14e2酶、家族15e2酶、家族16e2酶和家族17e2酶中的任一种的任何e2酶的含义。hormaechea-agulla等人(mol cell[分子细胞]2018,41(3):168-178)已将这些酶分为四类，即i-iv类。i类仅含有ubc结构域，ii类和iii类分别具有n或c末端延伸部，并且iv类e2具有n和c末端延伸部。同样，为避免疑义，所有这些类别的e2都包括在本披露的范围内，因此所谓本文所述的e2酶，我们包括i类e2、ii类e2、iii类e2和iv类e2的含义。
[0064]
所谓“具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列”，我们包括e2泛素或泛素样缀合结构域必须具有与任何人e2酶或其功能部分(诸如表3-9中列出的任何人e2酶)具有至少80％序列同一性(例如，与任何人e2酶或其功能部分(诸如表3-9中列出的任何人e2酶)具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的含义。
[0065]
所谓“功能部分”，我们包括人e2酶的具有泛素或泛素样缀合能力的部分的含义，例如如上所述。通常，功能部分的长度为至少20个氨基酸，诸如至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸。优选地，功能部分的长度为50-150或80-150个氨基酸，诸如100-150个氨基酸。例如，人e2酶的功能部分包括人e2酶的能够将泛素或泛素样蛋白缀合到靶底物的部分，例如当功能部分与选择性地靶向所讨论的靶底物的靶向结构域一起成为本披露的分子的一部分时。如下文将变得更清楚，功能部分优选是ubc结构域，但应当理解，它甚至可以是ubc结构域的一部分，条件是该部分仍然能够将泛素或泛素样蛋白缀合到靶底物。
[0066]
在一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域衍生自e2酶或其功能部分或是合成的。
[0067]
所有e2酶都具有称为ubc结构域的核心催化结构域。因此，在一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含人e2酶的泛素核心催化(ubc)结构域，或人e2酶的ubc结构域的仍然具有泛素或泛素样缀合能力的变体，例如如上所述。因此，在本披露中使用的ubc结构域可以是天然存在的，例如衍生自人e2酶，或者它可以是合成的。合成变体可根据ubc结构域内的共有序列来设计，如下文进一步详细所述。
[0068]
人e2酶的ubc结构域的氨基酸序列在下表8中提供。应当理解，技术人员也可以例如通过使用标准比对技术诸如macvector和clustal w搜索对应于表8中的ubc结构域中的
一种的序列来鉴定其他e2酶的ubc结构域的氨基酸序列。ubc结构域通常由四个α螺旋和一个四链β片层构成。
[0069]
人e2酶中ubc的长度在117个氨基酸至284个氨基酸的范围内，因此在一个实施例中，ubc结构域包含110-290个氨基酸，诸如117-284个氨基酸或140-192个氨基酸。
[0070]
对ubc结构域进行比较已经鉴定了其中的关键保守区域或共有序列，例如如michelle等人(“what was the set of ubiquitin and ubiquitin-like conjugating enzymes in the eukaryotic common ancestor？[在真核生物共同祖先中的一组泛素和泛素样缀合酶是什么]”j mol evol[分子进化杂志]2009,68:616-628；具体参见其图6)所述。例如，一般特征基序是hxn三肽(例如，hpn或组氨酸-脯氨酸-天冬酰胺)和通常位于该规范基序的c末端侧上第八个氨基酸处的活性半胱氨酸残基。pxxxp(seq id no:206)基序和距离pxxxp基序(seq id no:206)的c末端26-43个氨基酸的色氨酸残基也是保守的。
[0071]
因此，在一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有保守催化性半胱氨酸残基的ubc结构域。然而，应当理解，ubc结构域不一定需要催化性半胱氨酸残基。例如，ube2v1和ube2v2缺乏保守半胱氨酸残基，但它们仍然与ube2n相互作用以允许赖氨酸63(k63)多泛素链形成。换句话说，应当理解，ubc结构域可以是例如通过与其他e2蛋白相互作用而在细胞环境中变得有活性的结构域。然而，优选的是，e2泛素或泛素样缀合结构域是催化性的并且具有保守半胱氨酸残基的结构域。
[0072]
在另一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有hxn肽基序诸如hpn三肽的ubc结构域。因此，应当理解，ubc结构域可含有hxn肽基序(hpn三肽)和通常位于该规范基序的c末端侧上第八个氨基酸处的保守半胱氨酸残基。
[0073]
使用如michelle等人(j mol evol[分子进化杂志]2009,68:616-628)所述的将e2表征为17个家族，家族5(该家族中的人e2是ube2j1和ube2j2)丢失规范的三肽hxn，其被tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209)替代。因此，在另一个实施例中，ubc结构域可含有txngrf(seq id no:210)肽基序(例如，tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209))代替hxn基序。因此，ubc可包含txngrf(seq id no:210)肽基序(例如，tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209))和保守半胱氨酸残基。
[0074]
在另一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有pxxxp(seq id no:206)肽基序(诸如pxxpp(seq id no:207)基序)的ubc结构域。
[0075]
在另一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有保守色氨酸残基的ubc结构域。优选地，这在pxxxp基序(seq id no:206)(诸如pxxpp(seq id no:207)基序)的c末端的26-43个氨基酸之间。
[0076]
在又一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有以下项的ubc结构域：(i)保守半胱氨酸残基；和/或(ii)hxn肽基序，诸如hpn，或者txngrf(seq id no:210)肽基序，例如tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209)；和/或(iii)pxxxp(seq id no:206)肽基序，诸如pxxpp(seq id no:207)基序；和/或(iv)保守色氨酸残基。
[0077]
在另一个实施例中，e2泛素或泛素样缀合结构域包含含有以下项的ubc结构域：(i)保守半胱氨酸残基；(ii)hxn肽基序，诸如hpn，或者txngrf(seq id no:210)肽基序，例如tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209)；(iii)pxxxp(seq id no:206)肽基序，诸如pxxpp(seq id no:207)基序；以及(iv)保守色氨酸残基，其中保守色氨酸残基距离
pxxxp基序(seq id no:2206)的c末端26-34个氨基酸，并且保守半胱氨酸残基在hxn或txngrf基序的c末端的八个氨基酸内。
[0078]
在一个实施例中，泛素或泛素样缀合结构域包含是人e2酶的ubc的变体的ubc结构域，该变体与人e2酶的ubc共享至少80％序列同一性。例如，变体可具有与以下项中的任一种的ubc结构域具有至少80％序列同一性(诸如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列：ube2a(hhr6a)、ube2b(hhr6b)、ube2c(ubch10)、ube2d1(ubch5a)、ube2d2(ubch5b)、ube2d3(ubch5c)、ube2d4(hbuce1)、ube2e1(ubch6)、ube2e2、ube2e3(ubch9)、ube2f(nce2)、ube2g1(ube2g)、ube2g2(ubc7)、ube2h(ubch)、ube2i(ubc9)、ube2j1(ncube1)、ube2j2(ncube2)、ube2k(hip2)、ube2l3(ubch7)、ube2l6(ubch8)、ube2m(ubc12)、ube2n(ubc13)、ube2nl、ube2o(e2-230k)、ube2q1(nice-5)、ube2q2、ube2ql、ube2r1(cdc34)、ube2r2(cdc34b)、ube2s(e2-epf)、ube2t(hspc150)、ube2u、ube2v1(uev-1a)、ube2v2(mms2)、ube2w、ube2z(use1)、uveld(uev3)、birc6(apollon)、fts(aktip)、tsg101和ufc1(分别为seq id no:42-82)。
[0079]
两个多肽之间的序列同一性百分比可使用任何合适的计算机程序(例如，威斯康星大学遗传计算组(university of wisconsin genetic computing group)的gap程序)来确定，并且应当理解，同一性百分比是相对于其序列已被最佳比对的多肽来计算的。比对可替代性地使用clustal w程序(thompson等人,nucleic acids res[核酸研究]1994,22(22):4673-80)来进行。使用的参数可以如下：快速成对比对参数：k-元组(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分；3，顶部对角线数量；5.评分方法：x百分比。多个比对参数：空位开放罚分；10，空位延伸罚分；0.05.评分矩阵：blosum。
[0080]
通常，与人e2酶的ubc共享至少80％序列同一性的此类变体仍保留如上所述的ubc结构域的保守序列。因此，人e2酶的ubc的变体优选地包含(i)保守半胱氨酸残基；和/或(ii)hxn肽基序，诸如hpn，或者txngrf(seq id no:210)肽基序，例如tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209)；和/或(iii)pxxxp(seq id no:206)肽基序，诸如pxxpp(seq id no:207)基序；和/或(iv)保守色氨酸残基。最优选地，人e2酶的ubc的变体包含(i)保守半胱氨酸残基；(ii)hxn肽基序，诸如hpn，或者txngrf(seq id no:210)肽基序，例如tpngrf(seq id no:208)或tangrf(seq id no:209)；(iii)pxxxp(seq id no:206)肽基序，诸如pxxpp(seq id no:207)基序；以及(iv)保守色氨酸残基，其中保守色氨酸残基距离pxxxp基序(seq id no:206)的c末端26-34个氨基酸，并且保守半胱氨酸残基在hxn或txngrf基序(seq id no:210)的c末端的八个氨基酸内。
[0081]
所谓变体，我们包括其氨基酸序列与亲本人e2酶ubc的氨基酸序列相比包含以下项的ubc结构域的变体：一个或多个缺失；和/或一个或多个氨基酸取代；和/或一个或多个插入。
[0082]
变体可以任何合适的方式产生。可采用常规的定点诱变，或者可使用本领域熟知的基于聚合酶链式反应的程序。
[0083]
通常，优选的是，本文披露的变体的氨基酸取代是保守氨基酸取代，例如其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。保守氨基酸取代是本领域熟知的并且包括(原始残基取代)ala(a)val、gly或pro；arg(r)lys或his；asn(n)gln；asp(d)glu；
cys(c)ser；gln(q)asn；glu(g)asp；gly(g)ala；his(h)arg；ile(i)leu；leu(l)ile、val或met；lys(k)arg；met(m)leu；phe(f)tyr；pro(p)ala；ser(s)thr或cys；thr(t)ser；trp(w)tyr；tyr(y)phe或trp；以及val(v)leu或ala。
[0084]
在一个优选的实施例中，泛素或泛素样缀合结构域包含诸如以下项中的任一种的人e2酶的ubc结构域：ube2a(hhr6a)、ube2b(hhr6b)、ube2c(ubch10)、ube2d1(ubch5a)、ube2d2(ubch5b)、ube2d3(ubch5c)、ube2d4(hbuce1)、ube2e1(ubch6)、ube2e2、ube2e3(ubch9)、ube2f(nce2)、ube2g1(ube2g)、ube2g2(ubc7)、ube2h(ubch)、ube2i(ubc9)、ube2j1(ncube1)、ube2j2(ncube2)、ube2k(hip2)、ube2l3(ubch7)、ube2l6(ubch8)、ube2m(ubc12)、ube2n(ubc13)、ube2nl、ube2o(e2-230k)、ube2q1(nice-5)、ube2q2、ube2ql、ube2r1(cdc34)、ube2r2(cdc34b)、ube2s(e2-epf)、ube2t(hspc150)、ube2u、ube2v1(uev-1a)、ube2v2(mms2)、ube2w、ube2z(use1)、uveld(uev3)、birc6(apollon)、fts(aktip)、tsg101和ufc1，这些ubc结构域的氨基酸序列分别在seq id no:42-82中指定。
[0085]
应当理解，birc6和ube2o在本领域中被描述为e2/e3杂合酶，因为它们是e3非依赖性的e2泛素缀合酶(参见bartke等人,mol cell[分子细胞]2004和ullah等人,febs j[欧洲生物化学学会联合会杂志]2018)。为避免疑义，此类酶包括在本文e2酶的定义中。
[0086]
为避免疑义，本文所谓“人e2”，我们包括“衍生自”人e2使得表达酶的cdna或基因最初使用来自人的遗传物质获得，但蛋白质可随后在任何宿主细胞中表达的含义。因此，很明显的是，人e2可在原核宿主细胞诸如大肠杆菌(e.coli)中表达，但仍将被认为是人e2。
[0087]
在另一个实施例中，调节结构域包含e2酶，其又包含e2泛素或泛素样缀合结构域。因此，应当理解，调节结构域可含有全长e2酶，而不仅仅是其ubc结构域或其另一功能部分。
[0088]
当调节结构域包含e2酶时，e2酶是具有与任何人e2酶(诸如下表3-8中列出的酶)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列(例如，与人e2酶具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列)的酶。优选地，e2酶与选自由以下项组成的组的人e2酶具有至少80％的序列同一性：ube2a(hhr6a)、ube2b(hhr6b)、ube2c(ubch10)、ube2d1(ubch5a)、ube2d2(ubch5b)、ube2d3(ubch5c)、ube2d4(hbuce1)、ube2e1(ubch6)、ube2e2、ube2e3(ubch9)、ube2f(nce2)、ube2g1(ube2g)、ube2g2(ubc7)、ube2h(ubch)、ube2i(ubc9)、ube2j1(ncube1)、ube2j2(ncube2)、ube2k(hip2)、ube2l3(ubch7)、ube2l6(ubch8)、ube2m(ubc12)、ube2n(ubc13)、ube2nl、ube2o(e2-230k)、ube2q1(nice-5)、ube2q2、ube2ql、ube2r1(cdc34)、ube2r2(cdc34b)、ube2s(e2-epf)、ube2t(hspc150)、ube2u、ube2v1(uev-1a)、ube2v2(mms2)、ube2w、ube2z(use1)、uveld(uev3)、birc6(apollon)、fts(aktip)、tsg101和ufc1，这些酶的氨基酸序列分别在seq id no:1-41中提供(参见表7)。最优选地，e2酶是ube2d1(ubch5a)、ube2e2、ube2l3(ubch7)、ube2o(e2-230k)、ube2q2或ube2r2。
[0089]
因此，应当理解，e2酶可以是本文所述的任何人e2酶的变体形式(参见例如表3-9)，该变体形式与例如如seq id no:1-41中提供的人e2酶中的任一种具有至少80％的序列同一性。所谓变体，我们包括人e2酶的氨基酸序列含有以下项的含义：一个或多个缺失；和/或一个或多个氨基酸取代；和/或一个或多个插入。氨基酸取代是优选的，并且包括如上所述的保守氨基酸取代。因此，应当理解，调节结构域可包含人e2酶或人e2酶的ubc结构域(诸如本文所述的那些中的任一个，例如表3-9中)，其中至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20、
25或至多30个氨基酸被添加、缺失和/或被其他氨基酸取代(例如，保守取代)。一般来讲，变异将限于本文所述的保守区域之外，包括对催化活性重要的半胱氨酸残基、hxn基序、对催化活性重要的pxxxp基序(seq id no:206)，诸如半胱氨酸残基。类似地，变异通常不会干扰e2酶与一种或多种结合配偶体之间的相互作用，该相互作用涉及介导e2酶的调节功能。例如，如实例6所述，含有突变f62a的e2酶的变体ube2d1完全废除调节活性，这被认为是由于f62残基参与ube2d1与内源ring型e3连接酶诸如rnf4之间的相互作用。因此，通常，e2酶的变体形式将仍然能够与e3酶(例如，它天然结合以便执行期望的调节功能的e3蛋白)相互作用。所谓“仍然能够与e3酶相互作用”，我们包括e2酶的变体形式显示出与e3酶的结合的至少50％(诸如与e3酶的结合的60％、70％、80％或90％，更优选该结合的95％或99％)作为没有变异的e2酶与e3酶之间的结合水平的含义。用于评估蛋白质-蛋白质相互作用的方法是本领域(包括针对e2:e3结合对)的标准实践(参见例如gundogdu和walden,protein science[蛋白质科学].2019；28:1758-1770；ning zheng和nitzan shabek.annual rev biochemistry[生物化学年鉴],第86卷:129-157,2017；以及turek等人,jbc[生物化学杂志]293,16324-16336,2018)。
[0090]
而且，为了最小化本披露的分子的自动泛素化，可能期望例如通过修饰人e2酶或其功能部分(例如，ubc结构域)内的任何一个或多个赖氨酸残基来修饰人e2酶或其功能部分。所谓“修饰”，我们包括一个或多个氨基酸取代(例如，保守取代)和/或缺失和/或添加的含义。这可以使用标准重组技术诸如常规定点诱变或通过使用pcr来进行。此类修饰的人e2酶也可被认为是变体。此类修饰(例如，其中一个或多个赖氨酸残基被另一个氨基酸取代)也可增加所得蛋白质的稳定性，例如当该修饰是稳定修饰时，例如基于来自蛋白质晶体结构的建模预测。
[0091]
另外或替代性地，为了增加本披露的分子的稳定性，可能期望例如通过修饰人e2酶或其功能部分(例如，ubc结构域)内的任何一个或多个氨基酸残基来修饰人e2酶或其功能部分，已知这些修饰是稳定修饰，例如基于来自蛋白质晶体结构的建模预测。所谓“修饰”，我们同样包括一个或多个氨基酸取代(例如，保守取代)和/或缺失和/或添加的含义。此类修饰的人e2酶也可被认为是变体。
[0092]
因此，应当理解，调节结构域可以是包含seq id no:1-82中的任一个(即，表3-9中的人e2酶或其ubc结构域中的任一个)的氨基酸序列中的一个的变体的调节结构域，该变体含有至多30个氨基酸修饰，例如1或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或至多15、20、25或至多30个氨基酸修饰。修饰可以是例如使最小化自动泛素化和/或增加稳定性的修饰。
[0093]
在一个优选的实施例中，调节结构域包含选自由以下项组成的组的e2酶：ube2a(hhr6a)、ube2b(hhr6b)、ube2c(ubch10)、ube2d1(ubch5a)、ube2d2(ubch5b)、ube2d3(ubch5c)、ube2d4(hbuce1)、ube2e1(ubch6)、ube2e2、ube2e3(ubch9)、ube2f(nce2)、ube2g1(ube2g)、ube2g2(ubc7)、ube2h(ubch)、ube2i(ubc9)、ube2j1(ncube1)、ube2j2(ncube2)、ube2k(hip2)、ube2l3(ubch7)、ube2l6(ubch8)、ube2m(ubc12)、ube2n(ubc13)、ube2nl、ube2o(e2-230k)、ube2q1(nice-5)、ube2q2、ube2ql、ube2r1(cdc34)、ube2r2(cdc34b)、ube2s(e2-epf)、ube2t(hspc150)、ube2u、ube2v1(uev-1a)、ube2v2(mms2)、ube2w、ube2z(use1)、uveld(uev3)、birc6(apollon)、fts(aktip)、tsg101和ufc1，这些e2酶的氨基酸序列分别在seq id no:1-41中指定。
[0094]
应当理解，上述和seq id no:1-82中列出的可能的调节结构域的任何实例可在一个或两个末端处含有至多5个氨基酸(例如，至多2个氨基酸)，这可由用于表达它们的克隆策略产生。然而，应当理解，这些氨基酸不应改变调节结构域的功能。例如，seq id no:147中的调节结构域von hippel lindau(vhl)蛋白在n末端处含有来源于克隆策略的两个氨基酸丙氨酸和甲硫氨酸，而在seq id no:199中，vhl调节结构域不存在这两个氨基酸。然而，在这两种情况下，调节结构域都具有相关的功能。
[0095]
所谓靶向结构域，我们包括能够靶向靶底物的任何结构域或部分的含义。优选地，靶向结构域能够选择性地靶向底物。例如，优选的是，靶向结构域靶向底物的程度大于任何其他底物，并且优选地仅靶向该底物。
[0096]
在一个实施例中，靶向结构域与底物结合，并且优选地特异性地与底物结合。例如，优选的是，靶向结构域与底物的结合程度大于旨在使用本披露的分子的细胞(例如，含有待调节的底物的细胞)中的任何其他底物。例如，优选的是，靶向结构域的kd值(解离常数)是细胞内的至少一种其他底物的至多五分之一或十分之一(即，亲和力更高)，并且优选地是其1/100或1/500以下。更优选地，底物的靶向结构域的kd值是细胞内的至少一种其他底物的1/1000或1/5000以下。可以使用本领域熟知的方法来容易地确定kd值。
[0097]
靶向结构域通常是多肽(例如，选择性与底物结合的多肽)，诸如单体、纳米抗体、抗体、抗体片段、scfv、胞内抗体、微型抗体、支架蛋白诸如设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、肽结合物或配体结合结构域中的任一种，优选特异性结合的多肽(例如，可以以高(例如，纳摩尔kd或更好)亲和力与靶底物结合的配体结合结构域)。
[0098]
如本文所用，术语“抗体”包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、fab片段、由fab表达文库产生的片段以及双特异性抗体。此类片段包括完整抗体的保留其对靶物质的结合活性的片段、fv、f(ab')和f(ab')2片段，以及单链抗体(scfv)、融合蛋白和包含抗体的抗原结合位点的其他合成蛋白。仅包含抗体的一部分的靶向结构域由于优化从血液中清除的速率而可能是有利的并且由于fc部分而不太可能经历非特异性结合。还包括结构域抗体(dab)、双抗体、骆驼抗体和工程化骆驼抗体。此外，对于向人施用，抗体及其片段可以是人源化抗体，这些人源化抗体现在是本领域熟知的(janeway等人,2001,immunobiology[免疫生物学],第5版,garland publishing；an等人,2009,therapeutic monoclonal antibodies:from bench to clinic[治疗性单克隆抗体类：从实验室到临床],isbn:978-0-470-11791-0)。
[0099]
还包括单体、纳米抗体、胞内抗体、单抗体、不对称igg样抗体(例如，三功能抗体/四杂交瘤，特赖恩制药/费森尤斯生物技术公司(trion pharma/fresenius biotech)；杵-进入-臼(knobs-into-holes)，基因泰克公司(genentech)；cross mab，罗氏公司(roche)；静电匹配抗体，安进公司(amgen)；luz-y，基因泰克公司；单链交换工程化结构域(seed)体，默克雪兰诺公司(emd serono)；biolonic，梅鲁斯公司(merus)；以及fab交换抗体，根马布公司(genmab))、对称igg样抗体(例如，双重靶向(dt)-ig，gsk/多曼提斯公司(gsk/domantis)；二合一抗体，基因泰克公司；交联mab，卡尔马诺斯癌症中心(karmanos cancer center)；mab2，f-star公司；以及cov x-体，cov x/辉瑞公司(cov x/pfizer))、igg融合体(例如，双重可变结构域(dvd)-ig，雅培公司(abbott)；igg样双特异性抗体，礼来公司(eli lilly)；ts2ab，医学免疫公司/az(medimmune/az)；bsab，齐莫基因公司(zymogenetics)；
hercules，百健艾迪公司(biogen idec)；tvab，罗氏公司)、fc融合体(例如，scfv/fc融合体，学术机构(academic institution)；scorpion，emergent biosolutions/trubion、齐莫基因公司/bms；双重亲和力重靶向技术(fc-dart)，宏观基因公司(macrogenics)；双重(scfv)2-fab，国家抗体药物研究中心)、fab融合体(例如，f(ab)2，梅达瑞克斯/安进公司(medarex/amgen)；双重作用或bis-fab，基因泰克公司；对接和锁定(dnl)，免疫医学公司(immunomedics)；二价双特异性，生物技术公司(biotechnol)；以及fab-fv，ucb-希尔泰克公司(ucb-celltech))、基于scfv和双抗体的抗体(例如，双特异性t细胞接合体(bite)，麦克罗梅特公司(micromet)；串联双抗体(tandab)，阿非梅德(affimed)；dart，宏观基因公司；单链双抗体，阿卡德米公司(academic)；tcr样抗体，ait，受体逻辑公司(receptor logics)；人血清白蛋白scfv融合体，梅里马克公司(merrimack)；以及combodies，埃皮生物技术公司(epigen biotech))、igg/非igg融合体(例如，免疫细胞因子，默克雪兰诺公司、费洛根公司(philogen)、免疫基因公司(immungene)、免疫医学公司；超抗原融合蛋白，活性生物技术公司(active biotech)；以及抗癌症的免疫动员mtcr，immtac)和寡克隆抗体(例如，西福根公司(symphogen)和梅鲁斯公司)。
[0100]
抗体可具有carter(“potent antibody therapeutics by design[通过设计获得强效的抗体治疗剂]”,nat rev immunol[自然免疫学评论]2006,6(5):343-57)和carter(“introduction to current and future protein therapeutics:a protein engineering perspective[当前和未来蛋白治疗剂的简介：蛋白质工程角度]”,exp cell res[实验细胞研究]2011,317(9):1261-9)(这些文献通过援引并入本文)描述的抗体样支架中的任一种，以及本文所述的特异性决定区。因此，术语“抗体”还包括亲和体和非基于免疫球蛋白的框架。实例包括adnectin、anticalin、affilin、trans-body、darpin、tn3分子、trimerx、微型蛋白、fynomer、avimer、centgrin和kalbitor(艾卡拉肽)。
[0101]
用于给定靶底物的合适靶向结构域可以由技术人员使用本领域长期建立的技术来制备。例如，制备单克隆抗体和抗体片段的方法是本领域熟知的，并且包括杂交瘤技术(kohler和milstein,“continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[连续培养融合细胞分泌具有预定特异性的抗体]”nature[自然]1975,256:495
–
497)；抗体噬菌体展示(winter等人,“making antibodies by phage display technology[通过噬菌体展示技术制备抗体]”annu rev immunol[免疫学年鉴]1994,12:433
–
455)；核糖体展示(schaffitzel等人,“ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries[核糖体展示：一种从文库中选择和进化抗体的体外方法]”j immunol methods[免疫学方法杂志]1999,231:119
–
135)；以及重复菌落过滤筛选(giovannoni等人,“isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening[通过菌落过滤筛选从大量组合库中分离抗血管生成抗体]”nucleic acids res[核酸研究]2001,29:e27)。此外，适用于本披露的抗体和抗体片段例如在以下出版物中描述：“monoclonal hybridoma antibodies:techniques and application[单克隆杂交瘤抗体：技术与应用]”,hurrell(crc press[crc出版社],1982)；“monoclonal antibodies:a manual of techniques[单克隆抗体：技术手册]”,h.zola,crc press[crc出版社],1987,isbn:0-84936-476-0；“antibodies:a laboratory manual[抗体：实验室手
册]”第1版,harlow和lane编辑,cold spring harbor laboratory press,new york[纽约冷泉港实验室出版社],1988.isbn 0-87969-314-2；“using antibodies:alaboratory manual[使用抗体：实验室手册]”第2版,harlow和lane编辑,cold spring harbor laboratory press,new york[纽约冷泉港实验室出版社],1999.isbn 0-87969-543-9；以及“handbook of therapeutic antibodies[治疗性抗体手册]”stefan d
ü
bel编辑,第1版,-wiley-vch,weinheim[魏因海姆威利-vch出版社],2007.isbn:3-527-31453-9。
[0102]
本披露的靶向结构域可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性靶向结构域可以对底物的不同表位特异，或者可以对本披露的底物多肽以及对异源组合物(诸如异源多肽或固体支持材料)特异。应当理解，此类多特异性靶向结构域可具有靶向更复杂的多结构域底物的价值。
[0103]
为了最小化本披露的分子的靶向结构域的泛素化，可能期望最小化靶向结构域中赖氨酸残基的数量。因此，可通过用例如精氨酸残基替代赖氨酸来修饰靶向结构域。用于这样做的技术是本领域熟知的。
[0104]
合适的靶向结构域的具体实例已在实例中举例说明，并且包括选择性地与含src同源2(sh2)结构域的磷酸酶2(shp2)的c-sh2结构域结合的单体acs3、作为与人抗原r结合的纳米抗体的hur8和hur17、与kras蛋白结合的darpin k19以及选择性地与细菌cas9蛋白结合的cas9(在本文用作阴性对照的实例，因为其不在哺乳动物中表达)。这些靶向结构域的氨基酸序列以及acs3的赖氨酸变体包括在表10中，并且应当理解，可在本披露的上下文中使用任何此类靶向结构域。因此，在一个实施例中，靶向结构域具有seq id no:126-135、138-139、257中的任一个的氨基酸序列或其具有至多20个氨基酸修饰(例如，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或至多10、15或20个氨基酸修饰)的变体。所谓“修饰”，我们包括一个或多个氨基酸取代(例如，保守取代)和/或添加和/或缺失的含义。在另一个实施例中，靶向结构域具有seq id no:126-135、138-139、257中的任一个的氨基酸序列或其与seq id no:126-135、138-139、257中的任一个具有至少80％序列同一性(例如，与seq id no:126-135、138-139、257中的任一个具有至少85％或90％序列同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的变体。应当理解，靶向结构域的变体可以是已被修饰以最小化靶向结构域的泛素化(例如通过修饰一个或多个赖氨酸残基，例如通过将它们中的一个或多个取代为另一种氨基酸残基和/或缺失它们中的一个或多个)和/或增加靶向结构域的稳定性(例如通过进行已知增加稳定性的一种或多种修饰，例如基于来自蛋白质晶体结构的建模预测)的变体。
[0105]
在一些实施例中，本披露提供了一种分子，其中：该靶向结构域是seq id no:126-135、138-139、257中的任一个的氨基酸序列的变体，其中一个或多个赖氨酸残基已被另一氨基酸取代和/或缺失；并且/或者该调节结构域是seq id no:42-82中的任一个的氨基酸序列的变体，其中一个或多个赖氨酸残基已被另一氨基酸取代和/或缺失。
[0106]
所谓底物(或靶底物)，我们包括可以被本披露的分子靶向并由此变得缀合到泛素或泛素样蛋白并由此被调节(例如，降解)的任何底物的含义。
[0107]
优选地，靶底物是多肽，并且通常是细胞内多肽，我们由此包括至少一部分在细胞内的任何多肽的含义。因此，底物可以是驻留在细胞内的细胞溶胶和/或细胞器中的细胞内多肽，或者它可以是膜多肽，诸如具有至少细胞内部分的跨膜多肽(例如，gpcr)。然而，泛素
存在于细胞内液和细胞外液中，并且参与许多细胞过程的调节。细胞外泛素与免疫应答的调节有关(sujashvili,“advantages of extracellular ubiquitin in modulation of immune responses[细胞外泛素在免疫应答的调节中的优势],”mediators inflamm[炎症介质]2016,epub2016:4190390)；并且baska等人提出泛素-蛋白酶体途径的成分在哺乳动物附睾液(ef)中分泌(baska等人,“mechanism of extracellular ubiquitination in the mammalian epididymis[哺乳动物附睾中的细胞外泛素化机制],”j cell physiol[细胞生理学杂志]2008,215(3):684-96)。因此，应当理解，在特定上下文中，本披露的分子可以用于调节细胞外靶底物。然而，优选地，底物是细胞内多肽。
[0108]
在一个实施例中，底物定位在质膜、细胞质、细胞核、线粒体、内体、内质网、线粒体和高尔基体中的一者或多者中。
[0109]
可能的靶底物的实例包括致癌蛋白、信号传导蛋白、gpcr、翻译后修饰蛋白、粘附蛋白、受体、细胞周期蛋白、检查点蛋白、病毒蛋白、朊病毒蛋白、细菌蛋白、寄生虫蛋白(parasitic protein)、真菌蛋白、dna结合蛋白、结构蛋白、酶、免疫原、抗原和致病蛋白。应当理解，靶底物可以是任何潜在的治疗靶标，无论是常规可成药的还是目前不可成药的。
[0110]
在一个具体的实施例中，底物选自由ras、kras和shp2组成的组。其他可能的靶底物包括人鼻病毒(hrv)蛋白酶3c、毒蕈碱性乙酰胆碱受体2(m2r)、β-2肾上腺素能受体(β2-ar)、交叉连接核酸内切酶mus81(mus81)和人抗原r(hur)。
[0111]
在一些实施例中，调节结构域和靶向结构域通过接头连接。所谓接头，我们包括将调节结构域附接到靶向结构域的化学部分的含义。优选的是，调节结构域与靶向结构域例如通过接头共价结合。
[0112]
因此，调节结构域和靶向结构域可通过使分子交联的任何常规方式连接，诸如o'sullivan等人(“comparison of two methods of preparing enzyme-antibody conjugates:application of these conjugates for enzyme immunoassay[酶-抗体缀合物的两种制备方法的比较：这些缀合物在酶免疫测定中的应用],”anal biochem[分析生物化学]1979,100:100-8)一般描述的那些方式。例如，调节结构域或靶向结构域中的一者可富含硫醇基团，而另一者与能够与那些硫醇基团反应的双功能试剂(例如，碘乙酸的n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhia)或n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)(一种在缀合的物质之间并入二硫桥的异双功能交联剂))反应。例如用间-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯获得的酰胺和硫醚键通常在体内比二硫键更稳定。已知双马来酰亚胺试剂允许硫醇基团(例如，抗体的半胱氨酸残基的硫醇基团)以顺序或同时的方式附接到另一个含硫醇的部分(例如，t细胞抗原或接头中间体的硫醇基团)。除马来酰亚胺外，与硫醇基团反应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
[0113]
在一个特别优选的实施例中，调节结构域和靶向结构域是多肽，并且调节结构域无需接头直接附接到靶向结构域，或通过接头间接附接到靶向结构域。
[0114]
因此，应当理解，调节结构域和靶向结构域可以是可由核酸分子编码的融合多肽的组成部分。因此，在一个特别优选的实施例中，本披露的分子是融合多肽，该融合多肽包含(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将
该调节结构域靶向底物。调节结构域可在靶向结构域的n末端，或靶向结构域可在调节结构域的n末端。所谓融合多肽，我们包括具有衍生自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列(例如，如上所述的两个异源结构域，即调节结构域和靶向结构域)的蛋白质或多肽的含义。融合蛋白还可包括衍生自单独蛋白质的氨基酸部分之间的氨基酸连接区域。
[0115]
合适地，连接调节结构域和靶向结构域，以便两个结构域都保持它们各自的活性，使得可以将分子靶向靶底物，从而可以调节底物。因此，可能期望融合多肽在调节结构域与靶向结构域之间含有肽接头，例如以便防止靶向底物与靶底物之间的空间破坏。合适的接头肽是通常呈无规卷曲构象的那些，因此接头可包含甘氨酸、丝氨酸或甘氨酸加丝氨酸残基的混合物。接头可含有的其他氨基酸包括亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和苏氨酸中的任一种或多种。优选地，接头含有长度介于1与45个之间的氨基酸残基，诸如介于5与28个之间的氨基酸残基，更优选1至20个氨基酸残基或4至20个氨基酸残基，诸如长度为5至19个的氨基酸残基。最优选地，接头含有长度介于6与20个之间的氨基酸残基，诸如介于9与19个之间的氨基酸残基。接头的具体长度包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个氨基酸残基的长度。
[0116]
可使用的特别优选的接头的实例在表10中列出，这些接头包括肽ggggs(seq id no:146)或ggggsggggsggggs(seq id no:145)或leggggssr(seq id no:141)或leggggsggggsggggssr(seq id no:142)、aaaggggsggggsggggsgt(seq id no:143)或ggggg(seq id no:144)或leggsr(seq id no:211)或legggsggssr(seq id no:212)或leggggsgggssr(seq id no:213)或legggsgggsgggssr(seq id no:214)或leggggsgpsggggpsgsr(seq id no:215)或lesnggggspapapggggsgssr(seq id no:216)或leggggsypydvpdyasggggssr(seq id no:217)或tggsaggsggsaggsggsaggsggsa(seq id no:218)或agsggstgsggsptpstsggstgsggas(seq id no:219)或agsggsggsggsgnsstsggsggsggas(seq id no:220)或ggspvpstpgggsgggsggspvpstpgs(seq id no:221)或spgtgspgtgspgtgspgtgspgtgspg(seq id no:222)。应当理解，由于引入核苷酸序列中的限制性克隆位点，存在这些实例中的“le”和“sr”。还应当理解，任何这些示例性接头中的一个或多个丝氨酸残基可被甘氨酸残基取代。
[0117]
编码合适的靶向结构域的多核苷酸是本领域已知的，或者可以容易地从已知序列设计(诸如从已知与靶底物相互作用的蛋白质序列设计)或包含在核苷酸序列数据库(诸如genbank、embl和dbest数据库)中。编码合适的调节结构域的多核苷酸是本领域已知的，或者可以容易地从已知的e2酶序列设计和制备。
[0118]
编码合适的接头肽的多核苷酸可以容易地从接头肽序列设计和制备。
[0119]
因此，可以使用熟知的基因工程技术来容易地构建编码本披露的融合多肽的多核苷酸。
[0120]
然后在合适的宿主中表达核酸以产生本披露的分子，例如融合多肽。因此，可根据已知技术(根据本文包含的教导内容适当修改)使用编码本披露的融合多肽的核酸以构建表达载体，然后将该表达载体用于转化适当的宿主细胞以表达和产生本披露的融合多肽。
[0121]
应当理解，可将编码本披露的多肽的核酸连接到多种其他核酸序列以引入适当的宿主中。伴随核酸将取决于宿主的性质、将核酸引入宿主中的方式以及是否需要附加型维
持或整合，如本领域所熟知的。
[0122]
如上所述和实例中所证明，诸位发明人已发现可以通过包含含有e2泛素或泛素样缀合结构域而不是e3连接酶的调节结构域的分子提供对靶底物的靶向调节。因此，在一个实施例中，本披露的分子或融合多肽不包含e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分。所谓e3泛素或泛素样连接酶的功能部分，我们包括e3泛素或泛素样连接酶仍然能够协助将泛素或泛素样蛋白例如直接(如用hect e3泛素连接酶)或间接(如用ring e3泛素连接酶)转移到底物的一部分。测定e3泛素或泛素样连接酶活性可以使用本领域已知的任何合适的技术进行，并且可涉及测试e3泛素或泛素样连接酶是否能够与底物和e2-ub或e2-ubl结合(参见例如，richting等人(“quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of protac mode of action[protac作用模式的定量活细胞动力学降解和机制分析],”acs chem biol[acs化学生物学]2018,13(9):2758-70)描述的三元复合物形成测定)。所谓“不包含e3泛素或泛素样连接酶”，我们包括本披露的分子或多肽不共价附接到e3泛素或泛素样连接酶的含义。例如，当本披露的分子是融合多肽时，编码该融合多肽的核苷酸序列也不编码e3泛素或泛素样连接酶。
[0123]
在一个实施例中，本披露的分子(例如，本披露的多肽)不包含e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分，该e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分是包含一个或多个选自由以下项组成的组的结构域的e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分：ring(非常有趣的新基因)结构域、u-盒结构域、hect(与e6-ap羧基末端同源)结构域和rbr结构域。在一个实施例中，本披露的分子包含亚细胞定位信号，诸如细胞核定位信号、线粒体定位信号或内体定位信号。
[0124]
本披露的融合多肽的实例包括表12a中列出的那些，因此在一个优选的实施例中，本披露的分子是表12a中列出的具有相应的seq id no:156-167、170-195、202-205、236-248、253-256和266-275的融合多肽中的任一个，更优选地其中本披露的分子具有seq id no:156-167、171-195、202-204、236-248、253-256、267、270和272中的任一个的氨基酸序列。还包括seq id no:156-167、170-195、202-205、236-248、253-256和266-275的多肽的变体，优选seq id no:156-167、171-195、202-204、236-248、253-256、267、270和272中的任一个的多肽的变体，例如具有至多50个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代(优选保守取代)和/或添加和/或缺失，诸如至多45、40、35、30、25或20个修饰，例如至多19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸修饰)的变体，或与表12a中列出的分别具有seq id no:156-167、170-195、202-205、236-248、253-256和266-275(优选seq id no:156-167、171-195、202-204、236-248、253-256、267、270和272)的融合多肽中的任一个具有至少50序列同一性(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的变体。应当理解，变体应是其中调节结构域和靶向结构域仍然能够执行它们各自的功能、使得可以将分子靶向靶底物、从而可以调节底物的变体。还应当理解，变体内调节结构域的e2泛素或泛素样缀合结构域必须仍然与人e2酶或其功能部分具有至少80％的序列同一性。还应当进一步理解，表12a中列出的融合多肽的变体可以是其中靶向结构域(例如，acs3或k19或其变体)被另一靶向结构域(诸如视情况而定，acs3或k19或其变体)取代并且/或者调节结构域被另一调节结构域取代的变体。
[0125]
在一些实施例中，本披露的分子包括可检测标志物，例如以允许鉴定或选择含有
本披露的分子的细胞。所谓“可检测标志物”，我们包括当在本披露的分子内时可直接或间接检测、使得可以同样检测分子的存在的标志物的含义。例如，可能期望在本披露的融合多肽中包括可检测标志物以便确定融合多肽是否被表达。因此，在一个实施例中，本披露的分子进一步包含可检测标志物。可检测标志物的实例包括亲和标签，诸如血凝素a表位标签(ypydvpdya；seq id no:124)、glu-glu标签(ceeeeympme；seq id no:125)和flag标签(其与抗flag抗体结合)。可使用的标志物的其他实例是放射性标记、荧光标记、酶促标记或其他基于氨基酸的标记。可使用任何合适的标志物，但为了最小化可能导致本披露的分子的蛋白水解降解的自身泛素化，不含有赖氨酸残基的标志物是优选的。编码此类肽标志物的核酸分子可从例如西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich corporation)(美国密苏里州圣路易斯(st.louis,mo.,usa))获得。应当理解，可检测标志物可存在于融合多肽的n末端或融合多肽的c末端，或者如果肽接头存在于调节结构域与靶向结构域之间，则可检测标志物可存在于融合多肽的接头内。在不同位置具有可检测标志物的构建体的实例可以见于表12a。
[0126]
在另一个实施例中，本披露的分子可包含可用于将本披露的分子引导到特定亚细胞位置的另外的定位部分。所谓定位部分，我们包括将本披露的分子靶向特定亚细胞位置并由此与本披露的分子在不存在该定位部分的情况下在该亚细胞位置的浓度相比增加本披露的分子在该亚细胞位置的浓度的部分的含义。亚细胞位置可以是靶底物主要驻留的位置。例如，如果靶底物主要驻留在细胞核中，则可能期望包括将分子引导到细胞核的定位部分。同样，应当理解，本披露的分子可用于在特定亚细胞位置选择性地调节(例如，降解)靶底物。例如，该分子可用于调节(例如，降解)驻留在线粒体中的靶底物，但不调节驻留在细胞核中的那些相同底物。
[0127]
评估亚细胞定位的手段是本领域技术人员熟知的。例如，这可以通过免疫荧光染色和高内涵成像来测试。可以使用特异性抗体对靶蛋白进行染色，并且通过用抗标签抗体染色来确定本披露的分子的存在。通过使用带荧光标签的二抗，这可通过高内涵共聚焦成像来检测。另外，可以用特定染料对细胞核、线粒体或其他细胞器进行染色。各种定位基序是本领域技术人员熟知的，包括定位于细胞核的核定位序列(nls)(lange等人,j biol chem[生物化学杂志]2007,282(8):5101-05)和定位于质膜的caax基序或棕榈酰化位点(michaelson等人,mol biol cell[细胞分子生物学]2005,16:1606-16；guan和fierke,sci china chem[科学中国化学]2011,54(12):1888-97；aicart-ramos等人,biochim biophys acta-biomembranes[生物化学生物物理学报-生物膜]2011,1808(12):298194)。任何这样的定位基序可包括在本披露的分子中。
[0128]
虽然表12a中列出的融合多肽以特定取向(例如，从n末端到c末端为“调节结构域-接头-靶向结构域”)示出，但是为避免疑义，反向取向也包括在本披露的范围内。例如，seq id no:193的融合多肽(ha_ufc1_接头2_acs3)的取向为“调节结构域-接头-靶向结构域”，然而，应当理解，反向取向“靶向结构域-接头-调节结构域”也包括在本披露的范围内。
[0129]
因此，应当理解，本披露提供了一种融合多肽，该融合多肽包含调节结构域、靶向结构域、任选的调节结构域与靶向结构域之间的肽接头以及任选的可检测标志物和/或定位结构域。例如，本披露包括一种融合多肽，该融合多肽包含调节结构域、靶向结构域、调节结构域与靶向结构域之间的肽接头以及任选地可检测标志物和/或定位结构域。
[0130]
在一个优选的实施例中，本披露的第一方面包括一种融合多肽，该融合多肽包含具有与人e2酶(例如，如以下表3-9中的任一个中列出)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2酶以及能够将e2酶靶向底物的靶向结构域(例如，单体或纳米抗体)。
[0131]
在一个优选的实施例中，本披露的第一方面包括一种融合多肽，该融合多肽包含与人e2酶(例如，如以下表3-9中的任一个中列出)的功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域以及能够将e2酶靶向底物的靶向结构域(例如，单体或纳米抗体)。优选地，功能部分是ubc结构域。
[0132]
本披露的第二方面提供了一种化合物，该化合物包含(i)根据本披露的第一方面的分子以及(ii)能够将该分子靶向细胞的靶向部分。
[0133]
根据本披露的第一方面的分子的优选项包括上述那些。例如，该化合物可包含本披露的第一方面的融合多肽以及能够将该分子靶向细胞的靶向部分。
[0134]
应当理解，细胞是含有本披露的分子或多肽能够调节的靶底物的细胞。因此，细胞可含有期望降解的底物，并且本披露的分子包含作为降解结构域的调节结构域。
[0135]
所谓靶向部分，我们包括能够靶向含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞的任何部分的含义。所谓含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞，我们包括含有该底物的所有细胞或含有该底物的细胞子集(仅在该细胞子集中期望调节(例如，降解)底物)的含义。优选地，靶向结构域能够选择性地靶向含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞。例如，优选的是，靶向部分靶向该细胞的程度大于任何其他类型的细胞，并且最优选地仅靶向含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞。
[0136]
在一个实施例中，靶向部分是由含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞表达或与之相关的实体的特异性结合配偶体。通常，所表达的实体在细胞上选择性表达。例如，所表达的实体在例如待治疗的个体中的含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞上的丰度通常比在其他细胞上的丰度高10或100或500或1000或5000或10000。
[0137]
所谓“结合配偶体”，我们包括与由特定细胞表达的实体结合的分子的含义。优选地，结合配偶体选择性地与该实体结合。例如，优选的是，结合配偶体的kd值(解离常数)是由另一细胞(例如，不含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞，或含有底物但其中不期望在该细胞中调节(例如，降解)该底物的细胞)表达的至少一种其他实体的至多五分之一或十分之一(即，亲和力更高)，并且优选地是其1/100或1/500以下。更优选地，该实体的结合配偶体的kd值是由另一细胞(例如，不含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞，或含有底物但其中不期望在该细胞中调节(例如，降解)该底物的细胞)表达的至少一种其他实体的1/1000或1/5000以下。
[0138]
通常，结合配偶体是以比在宿主的任何其他细胞中显著更大的浓度在含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞中或上与存在或配偶体可接近的实体结合的结合配偶体。因此，结合配偶体可在含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞上与以比在其他细胞上显著更高的量表达的表面分子或抗原结合。类似地，结合配偶体可与已被含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞比其他细胞更大程度地分泌到细胞外液中的实体结合。例如，如果靶底物驻留在癌细胞中，则结合配偶体可与在细胞膜上表达或已被分泌到肿瘤细胞外液中的肿瘤相关抗原结合。
[0139]
在一个优选的实施例中，结合配偶体是与含有期望调节(例如，降解)的底物的细
胞中存在或该细胞可接近的实体结合的配偶体。优选地，实体是当被结合配偶体结合时导致结合配偶体(和任何相关分子，例如本披露的第二方面的化合物)内化到细胞中的实体。应当理解，当细胞内递送依赖于胞吞途径作为主要摄取机制时，可能期望在化合物(例如，本披露的第一方面的分子)内包括从内体或溶酶体或其可包含在其中的任何其他囊泡逃逸的手段，或者以其他方式参与另一种手段(即在化合物外部)以介导这种逃逸。用于增强内体逃逸的方法是技术人员熟知的并且包括hum gen ther[人类基因疗法]2011,22(10):a14-a14和等人(sci rep[科学报告]2016,6:32301)中综述的那些。例如，本披露的第二方面的化合物(和/或本披露的第一方面的分子)可含有内体逃逸结构域。
[0140]
靶向部分可以是多肽、肽、小分子或拟肽中的任一种。通常，靶向部分是多肽，诸如单体、纳米抗体、抗体、抗体片段、scfv、胞内抗体、微型抗体、新型支架、肽结合物或配体结合结构域中的任一种。
[0141]
在一个优选的实施例中，靶向部分是结合配偶体，诸如抗体。抗体可以是与由含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞表达的抗原(例如，在该细胞的表面上表达的抗原)结合的抗体。优选地，抗原是当被抗体结合时导致本披露的第二方面的化合物例如通过受体介导的胞吞作用内化到细胞中的抗原。
[0142]
其中本披露的分子和靶向部分是多肽，应当理解，本披露的第二方面的化合物还可构成包含调节结构域、靶向结构域和靶向部分的融合多肽。因此，靶向部分可以是自身与包含靶向结构域和调节结构域的融合多肽融合的多肽。
[0143]
应当理解，本领域技术人员可以容易地为任何给定细胞选择合适的结合配偶体，例如通过鉴定对该细胞特异的表面抗原或分子并找到该抗原或分子的结合配偶体。已经对针对肿瘤相关抗原、免疫细胞抗原和感染因子的抗体及其片段进行了大量研究。因此，在一些实施例中，为给定细胞类型选择适当的靶向部分通常涉及检索例如由muro(“challenges in design and characterisation of ligand-targeted drug delivery systems[配体靶向药物递送系统的设计和表征挑战],”jcontrol release[控释杂志]2012,164(2):125-37)和carter等人(“identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology[肿瘤学中用于抗体靶向的细胞表面抗原的鉴定和验证],”endocr-relat cancer[内分泌相关癌症]2004,11:659-87)的综述所指导的文献。替代性地，可从患者(例如，通过活组织检查)取得细胞，并且制备针对该细胞的抗体。此类“量身定制”的抗体是已知的。已经证明，抗体赋予与不仅来自从其获得肿瘤细胞的患者而且大量其他患者的肿瘤细胞的结合。因此，多种此类抗体已经可商购获得。为给定的不需要细胞鉴定合适的结合配偶体的其他方法包括遗传方法(例如，微阵列)、蛋白质组学方法(例如，微分质谱法)、免疫学方法(例如，用肿瘤细胞免疫动物并鉴定特异性靶向恶性细胞的抗体分泌克隆)、使用患病细胞本身的抗体库的噬菌体展示选择(表型筛选；参见rust等人,mol cancer[分子癌症]2013,12:11，sandercock等人,mol cancer[分子癌症]2015,14:147，以及williams等人,oncotarget[肿瘤靶标]2016,7(42)68278-91)和其中使用系统生物学方法鉴定靶标的计算机方法。
[0144]
应当理解，靶向结构域是通常在细胞内部起作用以将调节结构域引导到靶底物(例如，细胞内多肽)的结构域而靶向部分通常在细胞外部起作用以将调节结构域和靶向结构域靶向该细胞的靶向结构域。
[0145]
诸如用于癌症疗法的抗体-药物缀合物由carter和senter(cancer j[癌症杂志]2008,14(3):154-69)以及chari等人(angewandte chemie international edition[应用化学国际版]2014,53:3751)综述，并且应当理解，本披露的该方面的化合物可被认为是此类抗体药物缀合物(还可参见us 5,773,001；us 5,767,285；us 5,739,116；us 5,693,762；us 5,585,089；us 2006/0088522；us 2011/0008840；us 7,659,241；hughes 2010nat drug discov[自然综述：药物发现]9:665,lash 2010；in vivo:the business&medicine report[体内：商业与医学报告]32-38；mahato等人,2011,adv drug deliv rev[先进药物递送综述]63:659；jeffrey等人,2006,bmcl[生物有机与药物化学快报]16:358；drugs r d[药物研发]11(1):85-95)。adc通常包含针对肿瘤细胞上存在的靶标的单克隆抗体、细胞毒性药物和将该抗体附接到该药物的接头。因此，本披露的第二方面的化合物可以是包含作为抗体的靶向部分、调节结构域和靶向结构域的adc。调节结构域和靶向结构域的优选项包括上文关于本披露的第一方面描述的那些。
[0146]
靶向部分可以已知的方式附接到本披露的第一方面的分子。例如，如果靶向部分是多肽诸如抗体，并且本披露的第一方面的分子是融合多肽，则靶向部分、调节结构域和靶向结构域可以表达为融合多肽，如本领域所熟知且如上所述。替代性地，靶向部分可通过任何其他已知的手段共价或非共价附接到本披露的第一方面的分子。
[0147]
在一些实施例中，靶向部分通过接头与本披露的分子连接。所谓接头，我们包括将靶向部分附接到本披露的第一方面的分子的化学部分的含义。附接可以是共价的或非共价的。优选地，附接是共价的。因此，靶向部分和本披露的第一方面的分子可通过使分子交联的任何常规方式连接，例如如上文关于本披露的第一方面所述。应当理解，大量的同双功能和异双功能交联化学物质将适于将靶向部分连接到t细胞抗原，并且可使用任何这样的化学物质。
[0148]
在一些实施例中，本披露的第一方面的分子和本披露的第二方面的化合物由合适的核酸分子编码并在合适的宿主细胞中表达。因此，本披露的第三方面提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物。因此，当本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物是融合多肽时，应当理解，本披露包括编码此类融合多肽的多核苷酸。本披露的第一方面的分子和本披露的第二方面的化合物的优选项包括上文关于本披露的它们的相应方面描述的那些。
[0149]
多核苷酸可以是dna，或者它可以是rna。它可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，可在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。
[0150]
编码本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物的合适的核酸分子可使用如本领域熟知的标准克隆技术、定点诱变和pcr来制备。用于克隆和工程化基因和cdna、用于使dna突变以及用于在宿主细胞中从多核苷酸表达多肽的分子生物学方法是本领域熟知的，如在“molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆实验手册]”,第三版,sambrook,j.和russell,d.w.(编辑),cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny[纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社](通过援引并入本文)中举例说
明。合适的多核苷酸的实例包括下表12c中已被指定为seq id no:223-235、249-252和258-265的那些，优选地其中多核苷酸是seq id no:223-235、249-252、259、262和264中的任一个。
[0151]
本披露的第四方面提供了一种载体，该载体包含本披露的第三方面的多核苷酸。载体可以是任何类型，例如重组载体，诸如表达载体。表达载体含有允许多肽在宿主细胞中表达和/或分泌的元件(例如，启动子、翻译起始和终止信号以及适当的转录调节区域)。合适的表达系统包括组成型或诱导型表达系统。特别地，载体可以是病毒载体，例如慢病毒或腺病毒或逆转录病毒。最特别地，载体可以是慢病毒或腺相关病毒(aav)载体。其他载体包括溶瘤病毒。
[0152]
应当理解，在某些实施例中，核酸分子和载体可经由使用下文所述且本领域已知的制剂和方法的基因治疗方法用于本披露的治疗方面。
[0153]
本披露的第五方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本披露的第三方面的多核苷酸或本披露的第四方面的多核苷酸。可以使用多种宿主细胞中的任一种，诸如原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，哺乳动物细胞、人类细胞、酵母、昆虫或植物细胞)。宿主细胞可以是细胞系，诸如癌细胞系。细胞的合适实例包括ad293、mda-mb-231、u20s、hct116、hela和hek 293细胞。许多合适的载体和宿主细胞是本领域非常熟知的。优选地，宿主细胞是稳定的细胞系。替代性地，宿主细胞可以是从患者获得的细胞。
[0154]
本披露还包括用于制备本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物的方法。例如，本披露包括在合适的宿主细胞中表达编码本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物的重组载体，以及回收该分子或化合物。用于表达和纯化多肽的方法是本领域非常熟知的。
[0155]
本披露还提供了一种产生细胞的方法，该方法包括引入根据本披露的第三方面的多核苷酸分子或根据本披露的第四方面的载体。引入多核苷酸分子和/或载体的合适方法包括上文所述的那些，并且通常是本领域已知的。
[0156]
除了在产生本披露的分子或化合物的方法中使用宿主细胞之外，宿主细胞本身可直接用于疗法中，例如用于细胞介导的疗法中。例如，选择性调节或降解处于特定翻译后状态(例如，磷酸化状态)的致病蛋白质同时仍保持其他翻译后状态的表达可能是有用的。因此，本披露提供了一种治疗方法，该治疗方法包括向受试者施用根据本披露的宿主细胞，例如在药物或者预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症中使用。因此，本披露还提供了根据本披露的第五方面的宿主细胞，其在医学中使用，例如在预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症中使用。本披露还提供了所述宿主细胞在制备在医学中使用(例如，在预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症中使用)的药物中的用途。foight等人,“multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses[用于编程分级细胞反应的蛋白质二聚化的多输入化学控制]”,nat biotechnol[自然
·
生物技术]2019,37(10):1209-16描述了protac在细胞疗法中的用途。下文提供了本披露的各种药剂(例如，分子、化合物、多核苷酸、载体和组合物)如何用于疗法中的进一步讨论。
[0157]
如下文所解释，虽然本披露的分子或本披露的化合物在不存在任何其他治疗剂(例如，抗癌化合物)的情况下可能在临床上有效，但与另外的治疗剂结合施用该分子或化
合物(或编码所述分子或化合物的多核苷酸)可能是有利的。
[0158]
因此，本披露的第六方面提供了一种组合物，该组合物包含本披露的第一方面、根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸、根据本披露的第四方面的载体或根据本披露的第五方面的细胞以及另外的治疗剂。
[0159]
在一个实施例中，另外的治疗剂选自由以下项组成的组：抗癌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、免疫治疗剂、抗炎剂、抗生素以及它们的任何组合。此类药剂的实例是本领域熟知的，并且可以由技术人员容易地鉴定。
[0160]
优选地，另外的治疗剂是抗癌剂。另外的抗癌剂可选自烷化剂，包括氮芥，例如二氯甲基二乙胺(hn2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(l-沙可来新)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，诸如六甲基三聚氰胺、噻替哌；烷基磺酸盐，诸如白消安；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(甲基-ccnu)和链脲菌素(链脲佐菌素)；以及三氮烯，诸如氨烯咪胺(dtic；二甲基三氮烯咪唑-甲酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物，诸如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物，诸如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶)；5-fu)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；fudr)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；以及嘌呤类似物和相关抑制剂，诸如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-mp)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；tg)和喷司他丁(2'-助间型霉素)；天然产物，包括长春花生物碱，诸如长春花碱(vlb)和长春新碱；表鬼臼毒素，诸如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，诸如更生霉素(放线菌素d)、柔毛霉素(道诺霉素；红比霉素)、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素c)；酶，诸如l-天冬酰胺酶；以及生物反应调节剂，诸如干扰素alphenome；其他药剂，包括铂配位复合物，诸如顺铂(cis-ddp)和卡铂；蒽醌，诸如米托蒽醌和蒽环霉素；取代脲，诸如羟基脲；甲基肼衍生物，诸如丙卡巴肼(n-甲基肼，mih)；以及肾上腺皮质抑制剂，诸如米托坦(o,p
′‑
ddd)和氨鲁米特；紫杉醇及其类似物/衍生物；细胞周期抑制剂；蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米()；信号转导酶(例如，酪氨酸激酶)抑制剂，诸如伊马替尼()；cox-2抑制剂和激素激动剂/拮抗剂，诸如氟他米特和它莫西芬。特别地，可使用替拉扎明。
[0161]
本披露的第七方面提供了根据本披露的第一方面的分子、根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸、根据本披露的第四方面的载体、根据本披露的第五方面的细胞或根据本披露的第六方面的组合物，其在医学中使用。
[0162]
本披露的第八方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本披露的第一方面的分子、根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸、根据本披露的第四方面的载体、根据本披露的第五方面的细胞或根据本披露的第六方面的组合物以及一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
[0163]
虽然根据本披露的第一方面的分子、根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸、根据本披露的第四方面的载体、根据本披露的第五方面的细胞或根据本披露的第六方面的组合物可以单独施用，但优选的是将其作为药物制剂与一种或多种可接受的载剂、稀释剂或赋形剂一起呈现。所谓“药学上可接受的”，包括制剂是无菌且无热原的。合适的药物载剂、稀释剂和赋形剂是药学领域熟知的。载剂在与抑制剂相容且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。通常，载剂将是无菌且无热原的水或盐水；然而，可使用其他可接受的载剂。
[0164]
在适当的情况下，制剂可以单位剂型存在并且可通过药学领域熟知的任何方法来
制备。此类方法包括使活性成分(例如，本披露的分子、化合物、多核苷酸、载体或组合物)与构成一种或多种辅助成分的载剂缔合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载剂或细分的固体载剂或两者均匀且紧密地缔合然后(如果需要)使产物成形来制备制剂。
[0165]
适用于口服施用的根据本披露的制剂可作为以下形式呈现：离散单位，诸如胶囊、扁囊剂或片剂，它们各自含有预定量的活性成分；粉末或颗粒；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂呈现。
[0166]
在一些实施例中，单位剂量制剂是含有活性成分的日剂量或单位、日亚剂量或其适当部分的制剂。应当理解，除了上文特别提及的成分之外，本披露的制剂还可包括本领域中考虑到所讨论的制剂类型的其他常规试剂，例如适用于口服施用的那些可包括调味剂。
[0167]
向个体施用的本披露的药剂的量是有效抗击特定个体的病症的量。该量可由医师确定。
[0168]
优选地，在本文所述的任何医学用途的上下文中，待治疗的受试者是人。替代性地，受试者可以是动物，例如家养动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如实验室啮齿动物，例如小鼠、大鼠或兔)或农业中重要的动物(即家畜，例如马、牛、绵羊或山羊)。
[0169]
应当理解，本披露的分子可以按各种方式递送到细胞(例如，含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞)。例如，本披露的分子可以是融合多肽，该融合多肽可以由于其附接到单独的靶向部分而被靶向个体中的细胞，如上文关于本披露的第二方面的化合物所述。这样，融合多肽被带到细胞附近并且可被递送到细胞，例如通过靶向部分与细胞上(例如，细胞表面上)的实体结合之后的内化。替代性地，本披露的分子可以是融合多肽，并且通过将编码融合多肽的多核苷酸或载体引入细胞中将其递送到细胞。
[0170]
因此，本披露的第九方面提供了一种将根据本披露的第一方面的分子递送到个体中的细胞(例如，含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞)的方法，该方法包括：向该个体施用本披露的第二方面的化合物或向该个体施用本披露的第三方面的多核苷酸或本披露的第四方面的载体，其中该多核苷酸或载体在该细胞中编码该分子。
[0171]
该分子、化合物、多核苷酸或载体可口服或通过任何肠胃外途径(例如，以包含活性成分的药物制剂的形式，任选地以药学上可接受的剂型中的无毒有机酸或无机酸或碱、加成盐的形式)施用。活性成分可以不同的剂量施用。
[0172]
本披露还提供了根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸或根据本披露的第四方面的载体，其在将根据本披露的第一方面的分子递送到个体中的细胞(例如，含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞)中使用。
[0173]
类似地，本披露还提供了根据本披露的第二方面的化合物、根据本披露的第三方面的多核苷酸或根据本披露的第四方面的载体在制造用于将根据本披露的第一方面的分子递送到个体中的细胞(例如，含有期望调节(例如，降解)的底物的细胞)的药物中的用途。
[0174]
本披露的第十方面提供了一种多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含：(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物；任选地其中该试剂盒不包含e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分。
[0175]
调节结构域、e2泛素或泛素样缀合结构域、靶向结构域、底物和e3泛素或泛素样连
接酶或其功能部分的优选项包括上文关于本披露的第一方面描述的那些。
[0176]
在一个实施例中，试剂盒进一步包含适于将调节结构域连接到靶向结构域的连接工具。可使用任何合适的连接工具，包括如本文别处所述的接头。因此，试剂盒还可包含能够将调节结构域连接到靶向结构域的接头。连接可以是共价的或非共价的。
[0177]
在另一个实施例中，试剂盒进一步包含靶向部分，该靶向部分能够靶向含有待调节(例如，降解)的底物的细胞。因此，应当理解，试剂盒可用于其中选择适当的调节结构域、靶向结构域和靶向部分然后将它们组合以为给定个体形成定制治疗的“即插即用”环境。应当理解，此类试剂盒适用于本文和下文所述的本披露的治疗方面。例如，如果显示癌症依赖于特定致癌基因的表达或活性，则该致癌基因可以被靶向以进行降解或其他调节。这可使用混杂的e2酶或其功能部分或变体来实现，但是如果已知致癌基因是特定e2酶的底物蛋白，则可选择该e2酶。靶向部分的优选项包括上文关于本披露的第二方面描述的那些。优选的是，靶向部分是抗体。
[0178]
本披露的第十一方面提供了一种多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含：(a)本披露的第一方面的分子；以及(b)靶向部分，该靶向部分能够靶向含有待调节(例如，降解)的底物的细胞。本披露的第一方面的分子和底物的优选项包括上文关于本披露的第一方面描述的那些，并且靶向部分的优选项包括上文关于本披露的第二方面描述的那些。优选的是，靶向部分是抗体。同样，应当理解，此类试剂盒适用于本文和下文所述的本披露的治疗方面，并且可用于“即插即用”环境。
[0179]
在一个实施例中，试剂盒进一步包含适于将本披露的第一方面的分子连接到靶向部分的连接工具。可使用任何合适的连接工具，包括如本文别处所述的接头。因此，试剂盒还可包含能够将本披露的第一方面的分子连接到靶向部分的接头。连接可以是共价的或非共价的。
[0180]
本披露的第十二方面提供了一种多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含：(a)编码调节结构域的多核苷酸，该调节结构域包含具有与人e2酶或其功能部分具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)编码靶向结构域的多核苷酸，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物；任选地其中该试剂盒不包含编码e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分的多核苷酸。
[0181]
调节结构域、e2泛素或泛素样缀合结构域、靶向结构域、底物和e3泛素或泛素样连接酶或其功能部分的优选项包括上文关于本披露的第一方面描述的那些。
[0182]
在一个实施例中，该试剂盒包含一个或多个启动子序列，这些启动子序列能够引导这些多核苷酸中的一者或两者在含有该待调节的底物的细胞中表达。启动子可以是组成型活性的或它们可以是诱导型的，从而允许暂时调节多核苷酸在细胞中的表达。使用组织特异性启动子以便将表达靶向特定细胞类型或组织可能是有用的。此类启动子是本领域熟知的，并且可以例如基于查阅科学文献容易地获得或设计。
[0183]
本披露提供的另一种多部分试剂盒包含：(a)编码根据本披露的第一方面的分子的多核苷酸以及(b)能够靶向含有待调节的底物的细胞的靶向部分。根据本披露的第一方面的分子和靶向部分的优选项包括上述那些。应当理解，这样的试剂盒也可用于如上所述的“即插即用”系统中，其中编码根据本披露的第一方面的分子的多核苷酸可用于表达这样的分子，然后可以将该分子附接到合适的靶向部分，例如取决于最终的治疗应用。
[0184]
如下文所讨论，本披露的药剂可用于预防或治疗受试者的由底物的异常水平介导的疾病或病症。因此，应当理解，在治疗受试者之前，确认或确定哪种底物在细胞(例如，从受试者取得的活组织检查中的细胞)中处于异常水平可能是有用的。因此，应当理解，可能有用的是上述多部分试剂盒中的任一种进一步包含一种或多种试剂以评估含有待调节的底物的细胞的表达谱。评估细胞(例如，活组织检查样品中)的表达谱可使用用于测量核酸(例如，dna或rna转录物)或蛋白质水平的常规测定进行。例如，可使用转录组或蛋白质组技术。可使用任何合适的试剂，包括编码底物的核酸的结合配偶体、底物本身的结合配偶体以及pcr引物。优选地，试剂是与底物结合的抗体。
[0185]
如下文进一步所讨论，本披露的药剂可用于通过评估本披露的分子对细胞、组织或器官的一种或多种特性的影响来评估底物的功能。因此，在一些实施例中，上述多部分试剂盒中的任一种还可包含用于评估细胞的特性的工具。这样，这些试剂盒可以用于筛选环境中，例如以鉴定对细胞的给定特性具有特定影响的底物。
[0186]
所谓细胞的特性，我们包括存活、生长、增殖、分化、迁移、形态、信号传导、代谢活性、基因表达、蛋白质翻译和细胞-细胞相互作用中的任一种。评估细胞的一种或多种特性可使用本领域已知的任何合适的方法进行。例如，细胞存活、生长、增殖、分化、迁移和形态中的任一种可通过显微镜检查或图像分析来评估。还可使用适当的标志物来检测特性。例如，以可检测方式标记的蛋白质、报告物的表达和/或对细胞组分和标志物的单步标记可以例如通过荧光显微镜检查使细胞结构、多细胞组织和其他读数直接可视化(例如，e-钙粘蛋白染色以鉴定细胞-细胞接触)。基因表达可通过功能基因组(例如，微阵列)技术来评估，蛋白质翻译可通过蛋白质组学技术或免疫组织化学技术来评估，诸如此类。可使用免疫荧光、hoeschst染色或膜联蛋白v测定中的任一种。因此，应当理解，技术人员可选择适当的技术来评估给定的特定，从而选择适当的手段。手段的实例包括抗体、引物、酶促试剂、免疫测定试剂、感兴趣实体(例如，蛋白质或核酸)的可检测标志物中的任一种。
[0187]
本披露的第十三方面提供了一种预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用本披露的第一方面的分子、本披露的第二方面的化合物、本披露的第三方面的多核苷酸、本披露的第四方面的载体、根据本披露的第五方面的细胞、本披露的第六方面的组合物和本披露的第八方面的药物组合物。
[0188]
类似地，本披露提供了本披露的第一方面的分子、本披露的第二方面的化合物、本披露的第三方面的多核苷酸、本披露的第四方面的载体、根据本披露的第五方面的细胞、本披露的第六方面的组合物和本披露第八方面的药物组合物，其在预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症中使用。
[0189]
同样，本披露提供了本披露的第一方面的分子、本披露的第二方面的化合物、本披露的第三方面的多核苷酸、本披露的第四方面的载体、本披露的第六方面的组合物和本披露的第八方面的药物组合物在制造用于预防或治疗受试者的由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的药物中的用途。
[0190]
所谓预防或治疗病症，我们包括减少或减轻患者的症状(即姑息用途)、防止症状恶化或进展、治疗障碍(例如，通过抑制或消除致病因子)或者预防从中摆脱的受试者的病症或障碍的含义。
[0191]
所谓“由底物或其形式的异常水平介导的病症”，我们包括其中至少部分病理由底
物或其形式的异常水平介导的任何生物学或医学病症或障碍的含义。该病症可由底物或其形式的异常水平引起，或者底物或其形式的异常水平可能是该病症的影响因素。所谓异常水平，我们包括底物或其形式以高于或低于正常非病理状态下的底物或其形式的水平存在的含义。应当理解，底物本身的量可能在病理状态与非病理状态之间保持相同，但是在病理状态下以特定形式(例如，特定的翻译后修饰形式)驻留的底物的量的比例可能更高或更低。为避免疑义，所谓底物的异常水平，我们包括该底物形式(诸如翻译后修饰形式(例如，磷酸化形式))的异常水平的含义。具体病症的实例包括癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、病毒性疾病、细菌性疾病、朊病毒性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病、关节炎、免疫缺陷和炎性疾病。
[0192]
本披露的药剂(例如，本披露的第一方面的分子、本披露的第二方面的化合物、本披露的第三方面的多核苷酸、本披露的第四方面的载体、本披露的第五方面的细胞、本披露的第六方面的组合物和本披露的第八方面的药物组合物)可以任何合适的方式配制，并且/或者通过任何合适的施用途径向个体施用和/或以例如如上所述且如由医师确定的适当剂量向个体施用。
[0193]
本披露的第十四方面提供了一种调节底物的方法，该方法包括使底物与本披露的第一方面的分子在该分子有效调节底物的分子的条件下接触。本披露的第一方面的分子和底物的优选项包括上述那些。
[0194]
所谓调节，我们包括可以由泛素或泛素样蛋白介导的任何可能类型的调节(包括上述那些，例如调节靶底物的一种或多种活性和/或调节靶底物的细胞定位和/或调节靶底物的稳定性)的含义。优选地，调节涉及降解底物。因此，在一个实施例中，调节涉及底物被降解，或阻止底物被降解，或底物的亚细胞定位被改变，或底物的一种或多种活性被调节(例如，增加或减少)，或底物的翻译后修饰的程度被调节。该方法可在体内或体外进行。
[0195]
所谓“在分子有效调节底物的条件下”，我们包括使底物与本披露的分子在允许底物与该分子之间形成复合物的条件下接触、使得泛素或泛素样蛋白可以缀合到底物并由此调节底物的含义。最低条件是存在e1蛋白、泛素或泛素样蛋白，以及由泛素或泛素样蛋白介导的特定调节的细胞机器。例如，如果特定调节是泛素介导的降解，则分子有效降解底物的条件将包括这种降解所需的细胞机器，例如蛋白酶体等。通常，该方法在细胞内进行，因此细胞条件对于分子调节底物是有效的。然而，体外泛素化测定是已知的，因此该方法可在体外进行，例如以进一步理解泛素或泛素样蛋白添加的机制、动力学和位置。
[0196]
应当理解，本披露的药剂将用于鉴定和/或验证底物作为潜在药物靶标的底物。本披露的药剂提供了细胞底物(包括细胞内底物)的靶向调节(例如，降解)，因此这种调节的效果在治疗环境中可能是有益的。
[0197]
因此，本披露的第十五方面提供了一种将底物鉴定为潜在药物靶标的方法，该方法包括：
[0198]
(a)提供包含该底物的细胞、组织或器官；
[0199]
(b)使该细胞、组织或器官与根据本披露的第一方面的分子或根据本披露的第二方面的化合物或根据本披露的第三方面的多核苷酸或根据本披露的第四方面的载体接触；以及
[0200]
(c)评估该分子、化合物、多核苷酸或载体对该细胞、组织或器官的一种或多种特
性的影响，其中鉴定与特定疾病状态相关的影响指示该底物是该特定疾病的潜在药物靶标。
[0201]
合适的细胞或它们可以来源的组织/器官包括骨髓、皮肤、软骨、肌腱、骨骼、肌肉(包括心肌)、血管、角膜、神经、脑、胃肠、肾、肝、胰腺(包括胰岛细胞)、肺、垂体、甲状腺、肾上腺、淋巴、唾液、卵巢、睾丸、宫颈、膀胱、子宫内膜、前列腺、外阴和食道。还包括免疫系统的各种细胞，诸如t淋巴细胞、b淋巴细胞、多形核白细胞、巨噬细胞和树突细胞。细胞可以是干细胞、祖细胞或体细胞。优选地，细胞是哺乳动物细胞，诸如人类细胞或来自动物诸如小鼠、大鼠、兔等的细胞。应当理解，细胞可来源于正常或健康的生物组织，或来源于患有疾病或疾患的生物组织，诸如来自肿瘤的组织或流体。
[0202]
应当理解，该方法可在体内、离体或体外进行。例如，该方法可在离体的组织或器官上、在体外的细胞培养物中或者在驻留在其体内自然环境中的细胞、组织或器官上进行。
[0203]
应当理解，本披露的第一方面的分子可通过与本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物直接接触(例如，当化合物包括与细胞表面上的实体结合的靶向部分时，导致化合物内化)或者通过表达本披露的第三方面的多核苷酸或本披露的第四方面的载体而递送到细胞、器官或组织。
[0204]
所谓评估分子、化合物、多核苷酸或载体对细胞、组织或器官的一种或多种特性的影响，我们包括评估对细胞、组织或器官的任一种或多种特性的影响的含义，已知这些特性与特定疾病状态相关。这样，已知调节(例如，降解)底物对一种或多种特性有影响，可以将该底物鉴定为特定疾病的潜在药物靶标。
[0205]
可以评估细胞、组织或器官的任何特性，并且对于给定的疾病或病症，技术人员将能够容易地鉴定待评估的合适特性。因此，一种或多种特性可以是上文关于本披露的第十二方面描述的细胞的任何特性，例如选自由以下项组成的组的特性：存活、生长、增殖、分化、迁移、形态、信号传导、代谢活性、基因表达、蛋白质翻译和细胞-细胞相互作用。组织和器官的特性包括形态和多细胞组织。在癌症的背景下，待评估的特性可包括细胞生长、增殖、分化和迁移中的任一种或多种。
[0206]
评估细胞、组织或器官的一种或多种特性可使用本领域已知的任何合适的方法进行，例如如上文关于本披露的第十二方面所述。在一些实施例中，该方法可使用上文描述的本披露的多部分试剂盒中的一种来进行。
[0207]
以与本披露的第十五方面类似的方式，应当理解，本披露的药剂可用于评估底物的功能，例如通过降解底物并评估影响，或通过以其他方式调节底物并评估其上调的影响。
[0208]
因此，本披露的第十六方面提供了一种评估底物的功能的方法，该方法包括：
[0209]
(a)提供包含该底物的细胞、组织或器官；
[0210]
(b)使该细胞、组织或器官与根据本披露的第一方面的分子或根据本披露的第二方面的化合物或根据本披露的第三方面的多核苷酸或根据本披露的第四方面的载体接触；以及
[0211]
(c)评估该分子、化合物、多核苷酸或载体对该细胞、组织或器官的一种或多种特性的影响。
[0212]
细胞、组织和器官以及细胞、组织或器官的一种或多种特性的优选项包括上文关于本披露的第十五方面描述的那些。
[0213]
应当理解，该方法可在体内、离体或体外进行。例如，该方法可在离体的组织或器官上、在体外的细胞培养物中或者在驻留在其体内自然环境中的细胞、组织或器官上进行。还应当理解，该方法允许评估细胞基因或蛋白质的功能，例如当底物是由基因编码的蛋白质时。在一些实施例中，该方法可使用上文描述的本披露的多部分试剂盒中的一种来进行。
[0214]
本披露的第十七方面提供了一种鉴定可用于预防或治疗由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的药剂的方法，该方法包括：
[0215]
提供该底物；
[0216]
提供测试剂，该测试剂包含(a)调节结构域，该调节结构域包含具有与人e2泛素或泛素样结构域具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的e2泛素或泛素样缀合结构域，以及(b)靶向结构域，该靶向结构域能够将该调节结构域靶向底物，任选地其中该测试剂不包含e3泛素或泛素样连接酶或其部分；
[0217]
使该底物和测试剂在该测试剂有效促进该底物的调节的条件下接触；以及
[0218]
确定该测试剂是否调节该底物。
[0219]
底物以及由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的优选项包括上述那些。例如，底物(例如，蛋白质)可以是细胞内蛋白质，该细胞内蛋白质本身或其形式(例如翻译后修饰形式，诸如磷酸化形式)与特定疾病或病症有关。
[0220]
应当理解，测试剂可以是根据本披露的第一方面的分子。因此，该方法可用于评估本披露的第一方面的候选分子调节底物(例如，降解底物)的功效，并由此将该分子鉴定为可用于抗击由底物或其形式的异常水平介导的疾病或病症的分子。
[0221]
应当理解，该方法可在体内、离体或体外进行。例如，该方法可在离体的组织或器官上、在体外的细胞培养物中或者在驻留在其体内自然环境中的细胞、组织或器官上进行。
[0222]
所谓“测试剂有效促进底物的调节的条件”，我们包括使底物与本披露的分子在允许底物与该分子之间形成复合物的条件下接触、使得泛素或泛素样蛋白可以缀合到底物并由此调节底物的含义。最低条件包括上文关于本披露的第十四方面所定义的那些。优选的是，该方法在细胞内进行，因此细胞条件对于测试剂促进底物的调节是有效的。然而，体外泛素化测定是已知的，因此该方法可在体外进行。
[0223]
在一个优选的实施例中，测试剂是降解底物的药剂。应当理解，在一些情况下，对测试剂进行高通量筛选是优选的，并且该方法可用作“文库筛选”方法，这是本领域技术人员熟知的术语。因此，测试剂可以是测试剂文库。用于制备和筛选此类文库的方法是本领域已知的。
[0224]
本披露包括鉴定在治疗疾病或病症中使用的药物或先导化合物的筛选方法。应当理解，能够高通量操作的筛选测定是特别优选的。应当理解，调节(例如，降解)底物的测试剂的鉴定可以是药物筛选途径中的初始步骤，并且可例如基于药剂在所讨论的疾病或病症的测定中的功效来进一步选择药剂和/或进一步修饰药剂。因此，该方法还可包括在所讨论的疾病或病症的测定中测试测试剂的步骤。各种疾病和病症的测定是本领域已知的。
[0225]
该方法可包括合成和/或纯化所鉴定的药剂或所修饰的药剂的另外的步骤。本披露还可包括合成、纯化和/或配制所鉴定的测试剂的步骤。也可对药剂进行其他测试，例如毒理学或代谢测试，如本领域技术人员所熟知的。本披露包括本披露的第一方面的分子或本披露的第二方面的化合物或本披露的第三方面的多核苷酸或本披露的第四方面的载体
在药物靶标验证中或在药物发现中的用途。
[0226]
在前面的描述中，为清楚起见，可单独描述特定实施例。除非另外明确规定特定实施例的特征与另一实施例的特征不相容，否则某些实施例可以包括本文结合一个或多个实施例描述的相容特征的组合。
[0227]
对于本文披露的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行的顺序进行，并且视情况而定，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。
[0228]
本文提及的所有文件都通过援引以其全文并入本文。在本说明书中列出或讨论明显在先发表的文件不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
[0229]
实例
[0230]
实例1-mda-mb-231细胞中shp2蛋白的降解，比较e3融合多肽和e2融合多肽。
[0231]
简介
[0232]
本实验的目的是确定能够降解靶蛋白的生物protac(本文称为融合多肽)是否可以通过使用e2泛素缀合酶作为“调节”或“降解”结构域而不是标准e3连接酶“降解”结构域来产生。先前的研究已经证明了生物protac使用e3“降解”结构域来降解靶蛋白的能力(portnoff等人,j.biol.chem[生物化学杂志].,2014 289(11):7844-5；pan等人,oncotarget[肿瘤靶标],2016 7(28):44299-44309；fulcher等人,open biol[开放生物学],2017 7(5).pii:170066)。对于本实验，用编码融合多肽和对照蛋白的慢病毒构建体转导mda-mb-231乳腺癌细胞。选择ube2d1 e2泛素缀合酶并入融合蛋白中作为接头和shp2结合单体acs3上游的n末端“降解”结构域(sha等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊],2013 110(37):14924-9)。对照包括与acs3的n末端和c末端e3连接酶(vhl；von hippel
–
lindau)多肽融合体、单独的acs3单体、单独的vhl、单独的ube2d1和未转导的对照细胞。靶shp2降解的程度将通过蛋白质印迹分析并通过蛋白质印迹条带的密度测定来确定。
[0233]
材料和方法
[0234]
如主要“方法”部分的“慢病毒颗粒的产生”部分所述产生慢病毒颗粒。在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_acs3(seq id no:149)、ha_vhl(seq id no:168)、ha_vhl_接头4_acs3(seq id no:154)、ha_acs3_接头4_vhl(seq id no:200)、ha_ube2d1(seq id no:169)和ha_ube2d1_接头4_acs3(seq id no:194)。
[0235]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括mda-mb-231未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：兔抗shp2(细胞信号传导技术公司(cst)#3397；1:1000稀释度)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司(licor)#925-32211；1:15,000稀释度)；以及小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)。然后在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将shp2蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α微管蛋白)的相应密度测定值。然后将这些值作为针对对照(未转导的)mda-mb-231细胞观察到的shp2/α-微管蛋白值的百分比给出。
[0236]
结果
[0237]
图1a示出了shp2蛋白和α-微管蛋白上样对照的蛋白质印迹。ha_ube2d1_接头4_acs3的两个重复样品(在图中标记为“ube2d1_acs3”)表明shp2蛋白水平与对照样品相比降低。密度测定量化表明shp2蛋白水平降低90％(图1b)。表达ha_vhl_接头4_acs3(在图中标记为“vhl_acs3”)的样品证明没有可检测的shp2，而反向取向ha_acs3_接头4_vhl样品(在图中标记为“acs3_vhl”)导致shp2水平降低大约70-80％(图1a和1b)。单独的ha_vhl(在图中标记为“vhl”)和单独的ha_ube2d1(在图中标记为“ube2d1”)对照似乎不会对shp2表达水平产生负面影响；然而，ha_acs3单体样品重复确实证明了shp2蛋白水平的一些可变性。
[0238]
结论
[0239]
这些数据表明包含e2泛素缀合酶的融合多肽能够降低靶蛋白表达。这种减少最可能的方法是通过靶标泛素化和随后的蛋白酶体降解。通过检查不同取向的vhl融合构建体观察到的数据表明，结合和降解结构域相对于彼此的取向可影响靶标泛素化的有效性，并因此影响e3连接酶的降解。
[0240]
实例2a-研究e3连接酶和e2融合多肽中的融合多肽结构域取向和接头长度。
[0241]
简介
[0242]
本实验的目的是研究“靶向”结构域与“调节/降解”结构域之间的接头的长度以及这些结构域相对于彼此的取向，并确定这些变量如何影响融合多肽介导的靶标表达的变化。图1中所示的数据表明，对于vhl(e3连接酶)降解结构域，n末端位置产生更多的靶shp2降解。这是fulcher等人(open biol[开放生物学],2017(5).pii:170066)报告的取向。对于本实验，用编码融合多肽和对照蛋白的慢病毒构建体转导mda-mb-231乳腺癌和u20s骨肉瘤细胞，在两种取向上比较短(9个氨基酸)接头与长(19个氨基酸)接头。选择ube2d1 e2泛素缀合酶作为e2融合多肽“调节/降解”结构域以及vhl作为e3融合多肽“降解结构域”。shp2-结合单体acs3(sha等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊],2013 110(37):14924-9)用作所有融合多肽构建体中的“结合”结构域。对照包括单独的acs3单体、单独的vhl、单独的ube2d1和未转导的对照细胞。靶shp2降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0243]
材料和方法
[0244]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_acs3(seq id no:149)、ha_ube2d1(seq id no:169)、ha_ube2d1_接头2_acs3(seq id no:159)、ha_ube2d1_接头1_acs3(seq id no:158)、ha_acs3_接头2_ube2d1(seq id no:203)、ha_acs3_接头1_ube2d1(seq id no:202)、ha_vhl(seq id no:168)、ha_vhl_接头2_acs3(seq id no:153)、ha_vhl_接头1_acs3(seq id no:152)、ha_acs3_接头2_vhl(seq id no:197)和ha_acs3_接头1_vhl(seq id no:196)。
[0245]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231和u20s细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括mda-mb-231和u20s未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：兔抗shp2(细胞信号传导技术公司#3397；1:1000稀释度)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)；以及兔抗gapdh(细胞信号传导技术公司#5174；1:4,000)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)。在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将
shp2蛋白条带的密度测定值除以上样对照(gapdh)的相应密度测定值。然后将这些值作为分别针对对照(未转导的)mda-mb-231和u20s细胞观察到的shp2/gapdh值的百分比给出。
[0246]
结果
[0247]
图2a和3a示出了shp2蛋白和gapdh上样对照条带的蛋白质印迹。在图2和3中，ube2d1“调节/降解”结构域构建体使用较短的名称e2d1。在mda-mb-231和u20s细胞系中，ube2d1(e2d1)融合多肽构建体导致shp2蛋白水平相对于对照细胞减少60-90％(图2和图3)。在mda-mb-231细胞中，在不同接头长度和取向之间shp2蛋白的减少没有太大变化(图2)。在u20s细胞中，ha_acs3_接头1_ube2d1构建体(在图中标记为“acs3_短_e2d1”)有稍微更多的变化，表现为效果最差的形式(图3a)。在mda-mb-231和u20s细胞中，在n末端位置具有vhl e3连接酶降解结构域导致shp2水平降低最大，而与接头长度无关(图2和图3)。在vhl降解结构域的n末端具有acs3结合结构域导致shp2蛋白水平在两种细胞系中的降低的效果都较差(图2和图3)。
[0248]
结论
[0249]
这些数据表明，包含e2泛素缀合酶的融合多肽可能比e3连接酶融合多肽更少受结构域取向的影响。该数据再次显示，使用ube2d1作为“调节/降解”结构域的e2融合多肽能够降低靶shp2蛋白水平。在一些结果之间观察到一些可变性，这可能表明每个细胞样品中构建体活性或构建体量的差异。
[0250]
实例2b
–
进一步研究e2融合多肽中的融合多肽结构域接头长度
[0251]
简介
[0252]
在研究取向对protac活性的影响之后，本实验的目的是进一步研究“靶向”结构域与“调节/降解”结构域之间的接头的长度，以确定不同的接头长度如何影响融合多肽介导的靶标表达的变化。图2a、2b、3a和3b中所示的数据证明，具有9个氨基酸的接头或19个氨基酸的接头的包含e2泛素缀合酶的融合多肽都能够降低mda-mb-231和u20s细胞中的靶shp2蛋白水平。对于本实验，测试了长度为6、11、13、16、19、23、24、26和28个氨基酸的其他接头。同样选择ube2d1 e2泛素缀合酶作为e2融合多肽“调节/降解”结构域。shp2-结合单体acs3(sha等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊],2013 110(37):14924-9)同样用作所有融合多肽构建体中的“结合”结构域。对照包括未转导的对照细胞。靶shp2降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0253]
材料和方法
[0254]
mrna合成：将编码e2d1_acs3_ha(ube2d1_acs3_ha)接头变体并由t7启动子、5'utr、编码融合多肽的开放阅读框、3'utr和polya尾组成的线性dna模板用于mrna的体外转录，如别处所述(vaidyanathan s等人,uridine depletion and chemical modification increase cas9 mrna activity and reduce immunogenicity without hplc purification[在不进行hplc纯化的情况下尿苷耗尽和化学修饰可增加cas9 mrna活性并降低免疫原性].mol ther nucleic acids[分子疗法-核酸]12,530-542(2018))。
[0255]
按以下列排列产生融合多肽：ube2d1_接头_acs3_ha，使用野生型ube2d1并且其中使用的接头对应于以下序列：
[0256][0257]
在这些实验中使用的融合多肽对应于seq id no:223-235的核酸序列，它们编码seq id no:236-248的氨基酸序列。
[0258]
用mrna转染细胞：使用rnaimax(英杰公司(invitrogen))根据制造商的说明书用mrna转染u20s细胞。将每孔4x 103个u2os细胞等分到胶原包被的96孔板上并在37℃下孵育48小时。然后用每孔100ng每种mrna编码的融合多肽转染细胞(使用rnaimax作为转染试剂)并在37℃下孵育24小时。
[0259]
对细胞进行高内涵成像以量化shp2降解：然后用多聚甲醛固定细胞。然后使用对shp2和ha标签特异的抗体探测这些表位的水平，并使用cytation 5高内涵成像系统进行检测。基于在每个实验中的未处理细胞内发现的shp2水平，将shp2水平归一化为范围0-100％。数据对应于n＝3或更多个生物重复。
[0260]
结果
[0261]
图3c示出了包含不同氨基酸长度的接头的构建体的shp2蛋白的归一化荧光强度。
研究了融合多肽功效对ube2d1与acs3结合结构域之间的接头长度的依赖性。一般而言，较短的接头(长度为6-20个氨基酸)始终显示出较高的shp2降解活性，如由归一化shp2信号的较低百分比所指示，然后是较长的接头。然而，甚至更长的接头(例如，长度为24-28个氨基酸)也产生靶标降解活性。
[0262]
结论
[0263]
这些数据表明，所有测试长度的接头都导致靶标成功降解。另外，针对长度为19个(接头2和11)和28个(接头15-18)氨基酸残基的接头测试不同的接头组合物，表明不同的接头序列不会废除靶标降解活性。所有测试的组合物都导致靶标降解。因此，不管接头长度如何并且不管接头序列的变化如何，都可以保持靶标降解活性。
[0264]
实例3-研究结合结构域亲和力对e3连接酶和e2融合多肽的活性的影响。
[0265]
简介
[0266]
本实验的目的是使用acs3单体作为结合结构域或突变体acs3v33r研究生物融合多肽的活性，如通过靶蛋白水平降低所测量的。在mda-mb-231和u20s细胞中测试融合多肽变体。将报道的对shp2具有高亲和力(shp2 c-sh2结构域kd＝4-9.1nm)的标准acs3单体与具有较低亲和力(shp2 c-sh2结构域kd＝1.2μm)的v33r acs3突变体进行比较(sha等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊],2013 110(37):14924-9和补充信息)。在sha等人的出版物中，acs3单体被称为cs3。对照包括单独的acs3单体、单独的vhl、单独的ube2d1和未转导的对照细胞。用标准acs3结合结构域或acs3v33r结合结构域测试具有ube2d1或vhl的n末端和c末端调节/降解结构域的融合多肽。测试的所有融合多肽构建体都具有19个氨基酸的“长”接头。靶shp2降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0267]
材料和方法
[0268]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_acs3(seq id no:149)、ha_ube2d1(seq id no:169)、ha_ube2d1_接头2_acs3(seq id no:159)、ha_ube2d1_接头2_acs3(v33r)(seq id no:160)、ha_acs3_接头2_ube2d1(seq id no:203)、ha_acs3(v33r)_接头2_ube2d1(seq id no:195)、ha_vhl(seq id no:168)、ha_vhl_接头2_acs3(seq id no:153)、ha_vhl_接头2_acs3(v33r)(seq id no:155)、ha_acs3_接头2_vhl(seq id no:197)和ha_acs3(v33r)_接头2_vhl(seq id no:201)。
[0269]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231和u20s细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括mda-mb-231和u20s未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：兔抗shp2(细胞信号传导技术公司#3397；1:1000稀释度)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)；以及兔抗gapdh(细胞信号传导技术公司#5174；1:4,000)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)。然后在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将shp2蛋白条带的密度测定值除以上样对照(gapdh)的相应密度测定值。然后将这些值作为分别针对对照(未转导的)mda-mb-231和u20s细胞观察到的shp2/gapdh值的百分比提供。
[0270]
结果
[0271]
图4a和5a示出了shp2蛋白和gapdh上样对照条带的蛋白质印迹。在图4和5中，ube2d1“调节/降解”结构域构建体使用较短的名称e2d1。在mda-mb-231和u20s中，具有标准acs3结合结构域的所有样品都表现出比突变的、亲和力较低的变体acs3(v33r)更大的shp2蛋白水平降低(图4和图5)。在mda-mb-231细胞中，具有标准acs3结合结构域的ube2d1(e2d1)融合多肽构建体(在两种取向上)表现出shp2蛋白降低大约80-90％(图4b)。通过比较，具有突变的acs3(v33r)结合结构域的ube2d1(e2d1)融合多肽构建体(在两种取向上)表现出shp2蛋白降低大约35-60％(图4b)。当检查n末端vhl e3连接酶融合多肽时，这些差异甚至更大，其中无法检测到具有acs3的shp2蛋白。然而，对于acs3(v33r)变体，shp2蛋白相对于对照细胞的降低为40％(图4b)。在u20s细胞(图5)中，观察到与针对mda-mb-231细胞描述的模式(图4)相似的结果模式。
[0272]
结论
[0273]
这些数据表明，通过降低结合结构域的结合亲和力，融合多肽的活性降低并且更多的靶蛋白在细胞中保持未降解。这些数据表明，增加结合结构域的亲和力可以增加靶蛋白降解的量。再次，该数据表明，具有n末端vhl e3连接酶“降解”结构域是测试的e3连接酶融合多肽的最有活性的取向。使用ube2d1和acs3的e2泛素缀合“调节/降解”结构域构建体在目前测试的两种取向上都表现出相当可比的活性。在实例之间观察到一些可变性，这可能是由转导效率和慢病毒滴度的差异引起的。
[0274]
实例4-使用e2融合多肽降解内源kras蛋白。
[0275]
简介
[0276]
本实验的目的是确定是否可以使用包含e2泛素缀合酶作为“调节/降解”结构域的融合多肽来降解替代性内源靶蛋白。这在两种不同的细胞系mda-mb-231和ad293细胞中测试。所测试的融合多肽构建体的结合结构域是设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)k19或e3_5。k19结合gtp-和gdp结合的kras两者(bery等人,nat commun[自然通讯].2019 10(1):2607)。e3_5充当阴性对照未选择的darpin(binz等人,j mol biol[分子生物学杂志],2003 332(2):489-503)。对照包括单独的darpin e3_5、单独的vhl和未转导的对照细胞。所有融合多肽都包含darpin k19或e3_5的n末端“结合结构域”和ube2d1或vhl的c末端“调节/降解”结构域。构建体中的结构域通过20个氨基酸的接头(“接头3”)连接。靶kras降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0277]
材料和方法
[0278]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_vhl(seq id no:168)、ha_e3_5(seq id no:151)、ha_k19_接头3_vhl(seq id no:198)、ha_e3_5_接头3_vhl(seq id no:199)、ha_k19_接头3_ube2d1(seq id no:204)和ha_e3_5_接头3_ube2d1(seq id no:205)。
[0279]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231和ad293细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括mda-mb-231和ad293未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：小鼠抗kras(ls生物科学公司(ls-bioscience)#ls-c175665；1:2000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；以及小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#
926-68070；1:15,000稀释度)。然后在odyssey上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将kras蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α-微管蛋白)的相应密度测定值。然后将这些值作为分别针对对照(未转导的)mda-mb-231和ad293细胞观察到的kras/α-微管蛋白值的百分比给出。
[0280]
结果
[0281]
在图6观察到，在使用e2泛素缀合酶融合多肽k19_e2d1(ha_k19_接头3_ube2d1)的mda-mb-231和ad293细胞中的蛋白质印迹中内源kras降解大于80％。在图6中，ube2d1“调节/降解”结构域构建体使用较短的名称e2d1。阴性对照融合多肽e3_5_e2d1(ha_e3_5_接头3_ube2d1)在这些细胞中没有导致任何kras降解(图6a和6b)。在这种形式中，e2融合多肽(使用ube2d1)在降低mda-mb-231和ad293细胞中的kras蛋白水平方面比e3连接酶融合多肽(使用vhl)更有效。k19_vhl e3连接酶融合多肽仅在mda-mb-231细胞中表现出kras蛋白水平降低，而在ad293细胞中则没有。
[0282]
结论
[0283]
这些数据证明，e2泛素缀合酶“调节/降解”结构域能够调节shp2以外的靶标。在这种情况下，结合结构域(darpin k19)募集内源kras，从而导致下游kras蛋白水平降低。在所测试的接头和结构域取向中，靶向kras的e2融合多肽能够在mda-mb-231细胞和ad293细胞中均表现出活性。相反地，靶向kras的e3融合多肽在mda-mb-231细胞中具有一些活性，但在ad293细胞中没有活性。
[0284]
这些数据表明，(i)所测试的形式对于e3融合多肽活性是次优的(因为该取向以前对靶向shp2的vhl融合多肽不太有效；然而，尽管shp2降低，但总能检测到蛋白质水平)，并且/或者(ii)e3连接酶融合多肽的活性可能取决于细胞背景而有所不同，例如，由于elob/c/cul2/rbx1 e3连接酶机器所需的某些衔接蛋白的表达水平而不同(参见图7)。由于e2融合多肽不太依赖于多种内源蛋白的表达来产生靶标结合和泛素转移，这显然是使用e2融合多肽的优点并且可允许在更大范围的细胞类型中具有活性。
[0285]
实例5a-研究一组核心e2泛素和泛素样缀合酶作为靶向shp2的融合多肽中的“调节/降解”结构域。
[0286]
简介
[0287]
本实验的目的是确定当以e2融合多肽形式(即核心e2_接头2_acs3)表达时哪些核心e2泛素或泛素样缀合酶序列能够最大程度降低靶蛋白表达。测试26种不同核心e2泛素或泛素样缀合酶序列以及融合多肽构建体的表达，并且通过蛋白质印迹测定所得shp2蛋白水平并将其与先前实例中使用的e2d1_acs3融合多肽进行比较。在mda-mb-231和u20s细胞中测试该组构建体。所测试的核心e2结构域是ube2d1、ube2b、ube2c、ube2d2、ube2d3、ube2e1、ube2f、ube2g1、ube2g2、ube2h、ube2i、ube2j2、ube2k、ube2l3、ubel6、ube2m、ube2o、ube2q1、ube2q2、ube2r1、ube2s、ube2t、ube2u、ube2w、birc6和ufc1。在蛋白质印迹中，这些样品由缺少前两个字母“ub”使得ube2d1显示为e2d1的较短命名法显示(图8a和9a)。对照包括单独的acs3单体和未转导的对照细胞。靶shp2降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0288]
材料和方法
[0289]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_acs3
(seq id no:149)、ha_ube2d1_接头2_acs3(seq id no:159)、ha_ube2b_接头2_acs3(seq id no:156)、ha_ube2c_接头2_acs3(seq id no:157)、ha_ube2d2_接头2_acs3(seq id no:171)、ha_ube2d3_接头2_acs3(seq id no:172)、ha_ube2e1_接头2_acs3(seq id no:173)、ha_ube2f_接头2_acs3(seq id no:174)、ha_ube2g1_接头2_acs3(seq id no:175)、ha_ube2g2_接头2_acs3(seq id no:176)、ha_ube2h_接头2_acs3(seq id no:177)、ha_ube2i_接头2_acs3(seq id no:178)、ha_ube2j2_接头2_acs3(seq id no:179)、ha_ube2k_接头2_acs3(seq id no:180)、ha_ube2l3_接头2_acs3(seq id no:181)、ha_ubel6_接头2_acs3(seq id no:182)、ha_ube2m_接头2_acs3(seq id no:183)、ha_ube2o_接头2_acs3(seq id no:184)、ha_ube2q1_接头2_acs3(seq id no:185)、ha_ube2q2_接头2_acs3(seq id no:186)、ha_ube2r1_接头2_acs3(seq id no:187)、ha_ube2s_接头2_acs3(seq id no:188)、ha_ube2t_接头2_acs3(seq id no:189)、ha_ube2u_接头2_acs3(seq id no:190)、ha_ube2w_接头2_acs3(seq id no:191)、ha_birc6_接头2_acs3(seq id no:192)和ha_ufc1_接头2_acs3(seq id no:193)。
[0290]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231和u20s细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括mda-mb-231和u20s未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：小鼠抗shp2(艾博抗公司#ab76285；1:1000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；以及兔抗ha标签(艾博抗公司#ab137838；1:1000)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)。然后在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将shp2蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α微管蛋白)的相应密度测定值。将这些值作为针对ube2d1_acs3 e2融合多肽观察到的shp2/α微管蛋白值的百分比提供(图8b和9b)，以确定任何其他核心e2是否能够分别对mda-mb-231和u20s细胞中的靶蛋白水平产生更大的影响。
[0291]
结果
[0292]
与先前的数据一致，在mda-mb-231和u20s细胞中在ha_ube2d1_接头2_acs3(在图中标记为“e2d1_acs3”)中都观察到shp2蛋白的降解(分别为图8和图9)。以这种形式测试的几种核心e2(n末端e2核心结构域和c末端acs3结合结构域)导致shp2蛋白水平有较小降低，如通过蛋白质印迹所测定的(图8a和9a)。许多测试的构建体似乎没有降低shp2蛋白水平。当量化蛋白质印迹带密度并将其归一化为上样对照时，在mda-mb-231和u20s细胞中，核心ha_ube2b_接头2_acs3(在图中标记为“e2b_acs3”)和较小程度的ha_ube2d2_接头2_acs3(在图中标记为“e2d2_acs3”)比ha_ubed1_接头2_acs3更大程度地降低shp2蛋白水平(分别为图8b和9b)。ha蛋白质印迹指示了这些带ha标签的融合多肽构建体的相对表达水平和/或稳定性。ha_ube2d1_接头2_acs3和ha_ube2d2_接头2_acs3都显示最小的ha条带，表明在细胞中差的构建体表达或所表达的构建体的差的稳定性。而在两种细胞系中，ha_ube2b_接头2_acs3构建体比ha_ube2d1_接头2_acs3和ha_ube2d2_接头2_acs3表现出更高的带ha标签的蛋白表达水平(图8a和9a)。大部分具有多种核心e2“调节/降解”结构域的测试构建体通过蛋白质印迹显示出高ha条带强度，表明细胞内部构建体表达水平和/或稳定性高。
[0293]
结论
[0294]
这些数据表明，对于导致靶蛋白的细胞表达水平降低的靶调节，使用ha_ube2b_接头2_acs3、ha_ube2d1_接头2_acs3和ha_ube2d2_接头2_acs3构建体在mda-mb-231细胞中均产生最低的shp2蛋白水平。许多其他核心e2构建体仅最低限度地降低靶标表达(如果有的话)。对于e2泛素缀合酶核心结构域融合多肽，靶标降解被认为是通过泛素介导的机制进行的，涉及靶标泛素化、多泛素化和最后的蛋白酶体降解。e2泛素样缀合酶核心融合多肽(例如，ha_ube2f_接头2_acs3、ha_ube2i_接头2_acs3和ha_ube2m_接头2_acs3)可以其他方式(例如，在泛素转移本身不存在的情况下转移泛素样分子)翻译后修饰或调节靶蛋白。
[0295]
实例5b-比较核心e2泛素和泛素样缀合酶作为靶向k19的融合多肽中的“调节/降解”结构域。
[0296]
简介
[0297]
在确定ube2d1(e2d1)在任一取向上起作用以降解不同内源靶蛋白(例如，shp2和k19)之后，本实验的目的是确定不同核心e2酶ube2b是否也能够降低靶蛋白表达，而与取向无关。在u20s细胞中测试构建体。所测试的核心e2结构域是ube2d1(作为阳性对照)和ube2b。在蛋白质印迹中，这些样品由缺少前两个字母“ub”使得ube2d1显示为e2d1的较短命名法显示(图13)。对照包括未转导的对照细胞。靶k19降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0298]
材料和方法
[0299]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽的慢病毒颗粒：ha_k19_接头2_ube2d1(seq id no:253)、ha_ube2d1_接头2_k19(seq id no:254)、ha_k19_接头2_ube2b(seq id no:255)和ha_ube2b_接头2_k19(seq id no:256)。研究了含有以下降解结构域的protac：ube2d1(e2d1)、ube2b(e2b)和vhl。在“结合结构域_降解结构域”和“降解结构域_结合结构域”两种取向上测试kras靶向的protac。阴性对照darpin e3_5以两种取向与各种降解结构域(seq id no:274-276和278)组合用作阴性对照结合结构域。还包括具有e3降解结构域的融合多肽作为对照，如下：ha_vhl_接头2_k19(seq id no:277)和ha_k19_接头2_vhl(seq id no:279)。
[0300]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导hpac胰腺癌细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括hpac未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：小鼠抗kras(ls生物科学公司(ls-bioscience)#ls-c175665；1:2000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；以及小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)。然后在odyssey上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将kras蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α-微管蛋白)的相应密度测定值。然后将这些值作为针对对照(未转导的)hpac细胞观察到的kras/α-微管蛋白值的百分比给出。
[0301]
结果
[0302]
图13示出了k19蛋白和α-微管蛋白上样对照条带的蛋白质印迹。在图13中，ube2d1和ube2b“调节/降解”结构域构建体使用较短的名称e2d1和e2b。在hpac细胞中，ube2d1
(e2d1)融合多肽构建体的两种取向均导致k19蛋白水平相对于对照降低(图13a)。类似地，vhl融合多肽构建体的两种取向都导致k19蛋白水平相对于对照降低，尽管k19_vhl取向表现出较低水平的降低。这些数据与在其他细胞系中所见的数据相关，表明hpac胰腺癌细胞是用于研究protac活性的另外的有效模型。转到图13b，将ube2b(e2b)融合多肽构建体(在两种取向上)与ube2d1(e2d1)融合多肽构建体(在两种取向上)进行比较，它们都导致k19蛋白水平降低70-90％(k19_e2d1降低87％；e2d1_k19降低86％；k19_e2b降低85％；并且e2b_k19降低79％)。
[0303]
结论
[0304]
这些数据表明，使用ube2b降解结构域可以导致kras蛋白表达物降解，以及实例5a的替代构建体中的shp2表达物降解。此外，protac融合多肽的两种取向都能够导致靶标降解。总之，这些数据证明，与多个靶结构域融合的多个e2泛素或泛素样缀合结构域产生功能性protac，而与这些结构域在融合多肽中的取向无关。
[0305]
实例6a-使acs3结合结构域中的赖氨酸残基突变以确定这是否将提高融合多肽在细胞中的活性和稳定性。
[0306]
简介
[0307]
本实验的目的是确定存在于融合多肽内的acs3单体“结合”结构域中的三个赖氨酸残基(k7、k55和k64)是否易于自身泛素化。如果这些赖氨酸残基被泛素化，则这可能导致融合多肽降解、稳定性差且细胞中的活性降低。使赖氨酸残基作为ube2d1_acs3构建体的一部分单独突变和组合突变。结构建模指示哪些氨基酸残基变化应保持单体稳定性。使赖氨酸残基k7突变为谷氨酰胺(k7q)。使赖氨酸残基k55突变为酪氨酸(k55y)，并且使赖氨酸残基k64突变为组氨酸(k64h)。表达含有这些acs3变体的融合多肽的u20s细胞中对shp2降解和融合多肽表达的影响通过分别探测shp2蛋白和ha标签表达水平的蛋白质印迹来测量。通过蛋白质印迹将α-微管蛋白表达水平确定为上样对照。对照样品包括单独的acs3单体、ube2d1_acs3(wt)和未转导的对照细胞。靶shp2降解的程度通过蛋白质印迹分析确定，并通过蛋白质印迹条带的密度测定量化。
[0308]
材料和方法
[0309]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_acs3(seq id no:149)、ube2d1_接头2_acs3(seq id no:159)、ube2d1_接头2_acs3(k7q)(seq id no:161)、ube2d1_接头2_acs3(k55y)(seq id no:162)、ube2d1_接头2_acs3(k64h)(seq id no:163)、ube2d1_接头2_acs3(k7q、k55y)(seq id no:164)、ube2d1_接头2_acs3(k7q、k64h)(seq id no:165)、ube2d1_接头2_acs3(k55y、k64h)(seq id no:166)和ube2d1_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)(seq id no:167)。
[0310]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导u20s细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。还包括u20s未转导的对照(“细胞”)裂解物。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：小鼠抗shp2(艾博抗公司#ab76285；1:1000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)；以及兔抗ha标签(艾博抗公司#ab137838；1:1000)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)。
然后在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将shp2蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α微管蛋白)的相应密度测定值。将这些值作为针对u20s对照细胞观察到的shp2/α微管蛋白值的百分比提供。另外，对于每个样品，将带ha标签的蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α微管蛋白)的相应密度测定值。将这些值作为针对ube2d1_acs3(wt)观察到的ha/α微管蛋白值的百分比提供，以确定细胞中的融合多肽蛋白表达是否可以通过去除结合结构域赖氨酸残基来改善。
[0311]
结果
[0312]
这些结果显示，所有ha_ube2d1_接头2_acs3(在图中标记为“e2d1_acs3”)样品(野生型和赖氨酸突变体)都能够导致shp2蛋白表达降低至少75％(图10a和10b)。这些结果在测试的所有变体之间似乎是相当的。所有赖氨酸突变变体也表现出ha表达水平相对于野生型acs3变体增加(图10c)。ha表达的最大增加似乎涉及单独的位置7处的赖氨酸突变(k7q)或与其他赖氨酸突变组合，针对三重突变体(k7q、k55y、k64h；图10c)观察到最高水平。
[0313]
结论
[0314]
这些数据表明，从acs3单体序列中去除赖氨酸残基似乎增加了细胞中融合多肽表达的水平，同时不会对细胞中靶标shp2降解的程度产生负面影响。似乎增加ha表达同时保持融合多肽与靶标shp2相互作用的能力的关键残基是k7。与ha_ube2d1_接头2_acs3 wt相比，包括该突变的所有变体似乎都显示出改善的稳定性和活性特征。三重突变体(k7q、k55y、k64h)表现出最大的ha表达和靶标降解增加。这些数据表明，在e2融合多肽构建体内，赖氨酸残基代表自身泛素化的倾向，这可以通过用替代残基替换这些残基来解决。在这种情况下，进行内部结构建模研究以选择最佳突变来维持acs3单体稳定性。这些数据表明，活性似乎得以保持，因为靶标shp2降解在测试的变体中相当或增加。
[0315]
实例6b-使融合多肽的ube2d1或ube2b调节结构域的催化位点突变或者降低结合结构域对靶蛋白的亲和力减少了靶蛋白降解。
[0316]
简介
[0317]
本实验的目的是进一步研究点突变改变融合多肽的活性的能力。这些实验旨在确定存在于融合多肽内的acs3单体“结合”结构域中的三个赖氨酸残基(k7、k55和k64)是否易于在具有不同半胱氨酸催化位点的ube2d1和ube2b中自身泛素化。还用acs3的v33r突变测试这些突变体以降低结合结构域对靶蛋白shp2的亲和力。最后，使ube2d1在残基f62(其涉及与一些e3连接酶相互作用)处进一步突变，以确定其对活性的影响。
[0318]
材料和方法
[0319]
mrna合成：将编码在结合结构域和调节结构域中具有各种点突变的靶向shp2的融合多肽并由t7启动子、5'utr、编码融合多肽的开放阅读框、3'utr和polya尾组成的线性dna模板用于mrna的体外转录，如别处所述(vaidyanathan s等人,uridine depletion and chemical modification increase cas9 mrna activity and reduce immunogenicity without hplc purification[在不进行hplc纯化的情况下尿苷耗尽和化学修饰可增加cas9 mrna活性并降低免疫原性].mol ther nucleic acids[分子疗法-核酸]12,530-542(2018))。
[0320]
所使用的mrna序列编码以下融合多肽：ube2d1_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)_ha(seq id no:240)、ube2d1(c85a)_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)_ha(seq id no:266)、
ube2d1_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h、v33r)_ha(seq id no:267)、ube2d1(c85a)_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h、v33r)_ha(seq id no:268)、ube2d1(f62a)_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)_ha(seq id no:269)、ube2b_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)_ha(seq id no:270)、ube2b(c88a)_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h)_ha(seq id no:271)、ube2b_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h、v33r)_ha(seq id no:272)和ube2b(c88a)_接头2_acs3(k7q、k55y、k64h、v33r)_ha(seq id no:273)。
[0321]
用mrna转染细胞：使用rnaimax(英杰公司)根据制造商的说明书用mrna转染u20s细胞。将每孔3.5x 105个u2os细胞接种到6孔板上并在37℃下孵育24小时。然后用每孔3μg每种mrna编码的融合多肽转染细胞(使用rnaimax作为转染试剂)并在37℃下孵育24小时。
[0322]
蛋白质印迹分析和量化：从细胞中除去培养基，然后用pbs洗涤。使用accutase(西格玛公司(sigma))收获细胞并在37℃下孵育3分钟。然后添加完全培养基中和accutase。然后收集细胞悬浮液并以1200rpm(300x g)离心5分钟以沉淀细胞。将细胞沉淀在pbs中洗涤并转移到1.5ml eppendorf管中。然后将这些试管以1200rpm(300x g)离心5分钟并弃去上清液。在含有稀释度为1:100的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(细胞信号传导技术公司(cell signalling technology))的ripa裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))中裂解细胞沉淀。将裂解物在冰上孵育30分钟，然后通过在4℃下以15,000rpm(17,000x g)离心10分钟来澄清。通过bca测定法(皮尔斯(pierce)/赛默飞世尔科技公司，根据制造商的说明书)测定每种裂解物的蛋白质浓度。然后将每孔40μg来自每个细胞系的裂解物上样到4％-12％ bolt凝胶(赛默飞世尔科技公司)上并在200v下运行25分钟，然后使用iblot根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)转移到膜上。然后将膜在odyssey封闭缓冲液(力科尔公司)中封闭，并使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析(参见下表2)。
[0323]
然后根据制造商的说明书(力科尔公司)在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件根据制造商的说明书(力科尔公司)测量蛋白质印迹条带的密度。
[0324]
结果
[0325]
为了进一步研究点突变改变融合多肽的活性的能力，检查了一组突变体结合结构域和调节结构域融合多肽。用编码一组靶向shp2蛋白的变体融合多肽的mrna转染u20s细胞，以进行泛素化和随后的降解。使用rnaimax转染细胞，孵育24小时并收获，并且通过蛋白质印迹分析shp2蛋白水平。本实例中使用的融合多肽变体的结合结构域包含k7q、k55y和k64h点突变，以相对于未突变的acs3结合结构域增加融合多肽表达(如图10c所示)。
[0326]
研究的另外的点突变包括：
[0327]
(i)使调节结构域的催化性半胱氨酸残基突变(例如，ube2d1(c85a)和ube2b(c88a))，这导致通过使调节结构域的催化残基失活而将shp2蛋白水平拯救至正常水平(或接近正常)(参见图10d、10e和10f)；
[0328]
(ii)通过包括acs3的另外的v33r突变而降低结合结构域对靶蛋白shp2的亲和力，这导致将shp2蛋白水平拯救至接近正常表达水平。shp2表达水平未被完全拯救。这可能是因为acs3的v33r点突变没有完全废除靶标结合，但确实使亲和力降低到大约1/100(sha等人,proc.natl.acad.sci.u s a[美国国家科学院院刊],2013110(37):14924-9和补充信息；参见图10d、10e和10f)；以及
[0329]
(iii)使涉及与e3连接酶相互作用的ube2d1残基f62突变以确定对活性的影响(即，f62a)，这导致shp2蛋白被完全拯救。
[0330]
结论
[0331]
这些数据表明，通过使e2调节结构域(例如，ube2d1或ube2b)的催化性半胱氨酸突变为丙氨酸，使调节结构域失活并且靶蛋白修饰(在这种情况下为shp2的泛素化和降解)被抑制。另外，通过降低结合结构域对靶蛋白的亲和力，也降低了靶蛋白修饰的程度。在本实例中，acs3的v33r突变使对shp2的结合亲和力降低到大约1/100(sha等人,proc.natl.acad.sci.u s a[美国国家科学院院刊],2013110(37):14924-9和补充信息)。
[0332]
最后，这些数据表明，e3连接酶与e2调节结构域的相互作用可能是调节结构域活性的关键，因为ube2d1的f62a突变似乎废除了shp2降解。结构研究已经显示残基f62涉及ube2d1与e3连接酶rnf4之间的相互作用(gundogdu和walden,protein science[蛋白质科学].2019；28:1758-1770)，这可能涉及催化泛素化。假设该残基突变为丙氨酸可防止e3与ube2d1相互作用，这似乎可防止融合多肽导致靶标shp2降解。
[0333]
实例7
–
使用e2泛素缀合酶融合多肽降解核靶标。
[0334]
简介
[0335]
本实验的目的是确定e2融合多肽形式是否可以成功降解主要的核靶标。人抗原r是选择的靶，因为单结构域抗体/纳米抗体序列可用于该靶标。人抗原r(hur/elavl1)是参与靶mrna的稳定和翻译上调的rna结合蛋白。hur主要定位在细胞核中，但是响应于不同刺激而被输出到细胞质，这是一个由几种翻译后修饰调节的过程，这也会影响其与靶mrna的结合(doller等人,cell signal[胞信号],200820:2165
–
2173)。选择两个单独的纳米抗体序列用于本实验：hur8和hur17。hur8对靶标人抗原r的结合亲和力为2100nm，而hur17的结合亲和力为30nm。包括靶向cas9蛋白的对照cas9 v
hh
纳米抗体结合结构域。cas9是细菌蛋白，因此不会在哺乳动物细胞中内源性表达。因此，cas9 v
hh
纳米抗体不应选择性地与哺乳动物细胞中的任何蛋白质结合。将这三种v
hh
纳米抗体以两种取向克隆到ube2d1融合体中：(ub)e2d1_接头_v
hh
和v
hh
_接头_(ub)e2d1。使用的接头是19个氨基酸的接头2(seq id no:142)。将编码这些构建体的慢病毒颗粒转导到2种不同的细胞系(mda-mb-231和u20s)中，并通过蛋白质印迹分析研究所得的对hur表达的影响。
[0336]
材料和方法
[0337]
在hek293ft细胞中产生编码以下融合多肽(或单个组分)的慢病毒颗粒：ha_ube2d1_接头2_cas9、ha_ube2d1_接头2_hur8、ha_ube2d1_接头2_hur17、ha_cas9_接头2_ube2d1、ha_hur8_接头2_ube2d1和ha_hur17_接头2_ube2d1。
[0338]
根据“用慢病毒转导细胞”中所述的方法转导mda-mb-231和u20s细胞，并如主要方法部分内的“蛋白质印迹分析和量化”中所述为蛋白质印迹分析做准备。使用以下抗体对样品裂解物进行蛋白质印迹分析：兔抗hur/elavl1(细胞信号传导技术公司#12582；1:1000稀释度)与第二山羊抗兔irdye800(力科尔公司#925-32211；1:15,000稀释度)；以及小鼠抗α微管蛋白(力科尔公司#926-42213；1:10,000稀释度)与第二山羊抗小鼠irdye680rd(力科尔公司#926-68070；1:15,000稀释度)。然后在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件对蛋白质印迹条带进行密度测定。对于每个样品，将hur蛋白条带的密度测定值除以上样对照(α微管蛋白)的相应密度测定值。然后将这些值作为针对每种相应对照裂解
bio))确认慢病毒颗粒的存在。然后在使用前在无菌steriflip(密理博公司(millipore))管中通过0.22μm孔径过滤器过滤含有慢病毒颗粒的上清液。
[0349]
用慢病毒转染细胞
[0350]
使ad293、mda-mb-231、u20s、hct116、hela和hpac细胞在6孔板中在2ml适当的培养基中生长，达到大约60-80％汇合。在慢病毒转导之前，除去所有培养基并用2ml含有10％ fbs的rpmi(英杰公司)(含有16μg/ml聚凝胺(最终浓度为8μg/ml；西格玛奥德里奇公司))替换。将2ml如上所述产生的含有慢病毒颗粒的上清液添加到每个孔中。然后将细胞在37℃和5％ co2下孵育24小时，之后将每种细胞类型的培养基替换为新鲜的完全培养基。然后将细胞在37℃和5％ co2下再孵育24小时，之后添加选择抗生素(嘌呤霉素；赛默飞世尔科技公司)。对于ad293、mda-mb-231、u20s和hpac细胞以2μg/ml添加嘌呤霉素；对于hct116细胞以4μg/ml添加，并且对于hela细胞以10μg/ml添加。在37℃、5％ co2下将细胞保持在含有抗生素的相关培养基中，直到可以收获足够的细胞用于蛋白质印迹分析。细胞样品由转导细胞池构成。
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蛋白质印迹分析和量化
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从转导的细胞中除去培养基，然后用pbs洗涤。使用accutase(西格玛公司(sigma))收获细胞并在37℃下孵育3分钟。然后添加完全培养基中和accutase。然后收集细胞悬浮液并以1200rpm(300x g)离心5分钟以沉淀细胞。将细胞沉淀在pbs中洗涤并转移到1.5ml eppendorf管中。然后将这些试管以1200rpm(300x g)离心5分钟并弃去上清液。在含有稀释度为1:100的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(细胞信号传导技术公司(cell signalling technology))的ripa裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))中裂解细胞沉淀。将裂解物在冰上孵育30分钟，然后通过在4℃下以10,000rpm(17,000x g)离心10分钟来澄清。将上清液收集在新的1.5ml eppendorf管中并储存在-80℃下。通过bca测定法(皮尔斯/赛默飞世尔科技公司，根据制造商的说明书)测定每种裂解物的蛋白质浓度。然后将每孔40μg来自每个细胞系的裂解物上样到4％-12％ bolt凝胶(赛默飞世尔科技公司)上并在200v下运行25分钟，然后使用iblot根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)转移到膜上。然后将膜在odyssey封闭缓冲液(力科尔公司)中封闭，并使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析(参见下表2)：
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表2.抗体供应商和稀释度
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然后根据制造商的说明书(力科尔公司)在odyssey系统上显示印迹，并使用image studio软件根据制造商的说明书(力科尔公司)测量蛋白质印迹条带的密度。
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表3.e2泛素化酶、底物、替代名称和uniprot登录号
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表4.e2泛素化酶、功能以及相关的e1和e3酶
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表5.e2泛素化酶的亚细胞定位(数据来源：uniprot)。
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表6.e2泛素化酶、氨基酸数量、ubc的氨基酸数量和催化性半胱氨酸残基的位置。
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表7.e2泛素缀合酶的全氨基酸序列和相应的seq id no。
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表8.e2泛素缀合酶的ubc氨基酸序列和相应的seq id no。
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表9.e2泛素缀合酶的ubc核酸序列和相应的seq id no。
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表10.表达标签、靶向结构域、接头、调节结构域和相应的seq id no。
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表11.用作实验对照的带ha标签的调节和靶向结构域以及相应的seq id no。
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表12a.本披露的核心e2融合多肽序列和相应的seq id no。
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表12b.含有e3的融合多肽和相应的seq id no。
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表12c.编码本披露的融合多肽的多核苷酸序列
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