一种LAMP2B/VWF-A3区域共修饰的外泌体及其制备方法和应用

一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.任何外来直接或间接暴力侵袭血管，均可能发生开放性或闭合性血管损伤。由于工农业和交通事业迅速发展，以及医源性血管插管、造影等检查的增多，发生亦不少见。以冠心病支架治疗为例，冠脉在介入治疗放置支架后，支架会损伤血管内皮细胞，造成局部的炎症反应引起，引起支架的再狭窄，增加病人痛苦和经济负担。药物能够有效防止支架放置后再狭窄的发生，但是此类药物涂抹支架仅能维持较短时间，很难精准靶向损伤血管，因此，需要一种既能载药又能靶向损伤血管的新型有效“载体”。
3.外泌体(exosome)即非可溶性的微囊泡结构，大小在30～100nm，具有磷脂双分子层结构，包含有dna、rna、活性脂质等信号转导物质。已有的大量研究表明，exosome可穿透血脑屏障、胎盘屏障等生物屏障，是药物治疗的良好纳米载体。但，同时研究发现，exosome静脉注射后，大量蓄积于肝脏和肺脏，很难靶向到损伤器官部位，因此，要将外泌体应用到血管损伤修复中，需要提高其靶向损伤血管的能力。然而目前，还未有关于靶向损伤血管的外泌体的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体，通过将靶向损伤血管胶原的vwf的a3区域与外泌体表面标记蛋白融合表达，使构建的外泌体具有靶向损伤血管的作用。
5.本发明提供了一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体，所述外泌体是由过表达lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的哺乳细胞系分泌得到。
6.优选的，所述lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.优选的，所述哺乳细胞系过表达gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白。
8.优选的，所述gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.优选的，所述哺乳细胞系包括293t或msc。
10.本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
11.1)构建过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体；
12.2)将过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体转染哺乳细胞系，获得lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达细胞；
13.3)将所述lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达细胞转染哺乳动物细胞系，得到的
转染细胞系进行培养，固液分离，从得到的细胞培养上清液中分离纯化外泌体。
14.优选的，所述过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体的构建方法，包括以下步骤：合成两端带有xhoi/bamhi的粘性末端的编码lamp2b-vwf-a3融合蛋白的基因序列，插入经xhoi/bamhi双酶切后的线性化plvx-puro质粒中，转入大肠杆菌感受态扩增，提取质粒进行测序验证，确定dna序列无误后质粒保存备用。
15.优选的，所述重组载体的转染滴度为108细胞。
16.本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体在靶向受损血管中的应用。
17.本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体作为载体在制备治疗血管损伤相关疾病的药物中的应用。
18.本发明提供了一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体，所述外泌体是由过表达lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的哺乳细胞系分泌得到。由于血管损伤后，基底膜的胶原暴露引发凝血反应，血液中的vwf因子结合暴露的胶原，血小板通过受体结合vwf因子，这样vwf因子就链接了损伤血管部位的胶原和血小板，使血小板聚集凝血。本发明通过“仿生”vwf因子结合受损血管胶原这一生物学过程，在外泌体中稳定表达vwf因子胶原链接部分，也就是vwf的a3区域(vwf蛋白过大，全长表达困难)，这样修饰后的外泌体具有靶向损伤血管胶原的作用。vwf的a3区域与lamp2b(外泌体的表面标记)的融合可保证vwf的a3区域稳定过表达于外泌体表面中，使构建了过表达lamp2b-vwf-a3的工程化外泌体(lamp2b-vwf-a3-exosome)具有靶向损伤血管的功能。
19.进一步的，本发明提供的lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体，将绿色荧光蛋白与lamp2b/vwf-a3区域共同融合表达，其中绿色荧光蛋白(gfp)可发挥追踪靶向位置的作用，便于直观追踪外泌体的位置，监测外泌体是否达到损伤器官部位，有利于后续外泌体作为载体在损伤血管相关疾病的药物的应用。
附图说明
20.图1为gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白表达序列设计示意图，其中sp区域为载体的导向序列，vwf-a3区为靶向受损血管胶原的结合位点，lamp2b为外泌体的标记蛋白，gfp为标签蛋白；
21.图2为gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白修饰的exosome示意图；
22.图3为293t转染细胞成功表达gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白融合蛋白；
23.图4为gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白电镜鉴定图；
24.图5为表达gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白的exosome的检测结果；
25.图6为gfp-lamp2b-vwf-a3修饰exosome的损伤血管靶向性验证结果。
具体实施方式
26.本发明提供了一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体，所述外泌体是由过表达lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的哺乳细胞系分泌得到。
27.在本发明中，所述lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的氨基酸序列优选如seq id no:1(mvcfrlfpvpgsglvlvclvlgavrsyalelnltdsenatclyakwqmnftvryettnktyktvtisdhgtvtyn
gsicgddqngpkiavqfgpgfswianftkaastysidsvsfsyntgdnttfpdaedkgiltvdellairiplndlfrcnslstlekndvvqhywdvlvqafvqngtvstneflcdkdktstvaptihttvpsptttptpkekpeagtysvnngndtcllatmglqlnitqdkvasvininpntthstgscrshtallrlnsstikyldfvfavknenrfylkevnismylvngsvfsiannnlsywdaplgssymcnkeqtvsvsgafqintfdlrvqpfnvtqgkystaqdcsadddnflvpiavgaalagvlilvllayfiglkhhhagyeqfgsgagsdvillldgsssfpasyfdemksfakafiskanigprltqvsvlqygsittidvpwnvvpekahllslvdvmqreggpsqigdalgfavryltsemhgarpgaskavvilvtdvsvdsvdaaadaarsnrvtvfpigigdrydaaqlrilagpagdsnvvklqriedlptmvtlgnsflhkl*)所示。编码所述lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的基因序列如seq id no:3(atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagtacgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcaccattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagctcaagactgcagtgcagatgacgacaacttccttgtgcccatagcggtgggagctgccttggcaggagtacttattctagtgttgctggcttattttattggtctcaagcaccatcatgctggatatgagcaatttggttcgggagcgggaagtgacgtgatccttctcctggatggctcctccagtttcccagcttcttattttgatgaaatgaagagtttcgccaaggctttcatttcaaaagccaatatagggcctcgtctcactcaggtgtcagtgctgcagtatggaagcatcaccaccattgacgtgccatggaacgtggtcccggagaaagcccatttgctgagccttgtggacgtcatgcagcgggagggaggccccagccaaatcggggatgccttgggctttgctgtgcgatacttgacttcagaaatgcatggtgccaggccgggagcctcaaaggcggtggtcatcctggtcacggacgtctctgtggattcagtggatgcagcagctgatgccgccaggtccaacagagtgacagtgttccctattggaattggagatcgctacgatgcagcccagctacggatcttggcaggcccagcaggcgactccaacgtggtgaagctccagcgaatcgaagacctccctaccatggtcaccttgggcaattccttcctccacaaactgtaa)所示。
28.在本发明中，所述哺乳细胞系优选过表达gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白。所述gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的氨基酸序列优选如seq id no:2(mvcfrlfpvpgsglvlvclvlgavrsyalelnltdsenatclyakwqmnftvryettnktyktvtisdhgtvtyngsicgddqngpkiavqfgpgfswianftkaastysidsvsfsyntgdnttfpdaedkgiltvdellairiplndlfrcnslstlekndvvqhywdvlvqafvqngtvstneflcdkdktstvaptihttvpsptttptpkekpeagtysvnngndtcllatmglqlnitqdkvasvininpntthstgscrshtallrlnsstikyldfvfavknenrfylkevnismylvngsvfsiannnlsywdaplgssymcnkeqtvsvsgafqintfdlrvqpfnvtqgkystaqdcsadddnflvpiavgaalagvlilvllayf
iglkhhhagyeqfgsgagsmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelykgsgsgsdvillldgsssfpasyfdemksfakafiskanigprltqvsvlqygsittidvpwnvvpekahllslvdvmqreggpsqigdalgfavryltsemhgarpgaskavvilvtdvsvdsvdaaadaarsnrvtvfpigigdrydaaqlrilagpagdsnvvklqriedlptmvtlgnsflhkl*)所示。编码所述gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的基因序列如seq id no:4(atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagtacgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcaccattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagctcaagactgcagtgcagatgacgacaacttccttgtgcccatagcggtgggagctgccttggcaggagtacttattctagtgttgctggcttattttattggtctcaagcaccatcatgctggatatgagcaatttggttcgggagcgggaagtatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagggaagcggttctggatctgacgtgatccttctcctggatggctcctccagtttcccagcttcttattttgatgaaatgaagagtttcgccaaggctttcatttcaaaagccaatatagggcctcgtctcactcaggtgtcagtgctgcagtatggaagcatcaccaccattgacgtgccatggaacgtggtcccggagaaagcccatttgctgagccttgtggacgtcatgcagcgggagggaggccccagccaaatcggggatgccttgggctttgctgtgcgatacttgacttcagaaatgcatggtgccaggccgggagcctcaaaggcggtggtcatcctggtcacggacgtctctgtggattcagtggatgcagcagctgatgccgccaggtccaacagagtgacagtgttccctattggaattggagatcgctacgatgcagcccagctacggatcttggcaggcccagcaggcgactcc
aacgtggtgaagctccagcgaatcgaagacctccctaccatggtcaccttgggcaattccttcctccacaaactgtaa)所示。
29.在本发明中，所述哺乳细胞系优选包括293t或msc。
30.本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
31.1)构建过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体；
32.2)将过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体转染哺乳细胞系，获得lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达细胞；
33.3)将所述lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达细胞转染哺乳动物细胞系，得到的转染细胞系进行培养，固液分离，从得到的细胞培养上清液中分离纯化外泌体。
34.在本发明中，所述过表达lamp2b-vwf-a3区域融合基因的重组载体的构建方法，优选包括以下步骤：合成两端带有xhoi/bamhi的粘性末端的编码lamp2b-vwf-a3融合蛋白的基因序列，插入经xhoi/bamhi双酶切后的线性化plvx-puro质粒中，转入大肠杆菌感受态扩增，提取质粒进行测序验证，确定dna序列无误后质粒保存备用。
35.本发明对所述插入线性化载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的插入方法即可，例如双酶切后进行连接。所述转入大肠杆菌感受态的方法优选为氯化钙法。提取质粒的方法优选采用质粒提取试剂盒完成。所述测序时，测序引物的核苷酸序列如seq id no:7(cgcaaatgggcggtaggcgtg)和seq id no:8(caaagaacggagccggttgg)所示。
36.本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染的方法即可，例如lipo2000转染法。所述转染哺乳细胞系优选为293t。
37.在本发明中，所述重组载体的转染滴度优选为10
8/
细胞。本发明对所述哺乳细胞系的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的用于重组载体转染的细胞即可。在本发明实施例中，所述哺乳细胞系为293细胞。
38.在本发明实施例中，为了准确定位外泌体的积累位置，在融合基因中还包括标记基因，例如gfp编码基因。所述重组载体中过表达的融合基因为gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合基因，核苷酸序列如seq id no:6所示。gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。
39.鉴于所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体具有良好的靶向受损血管的功能，本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体在靶向受损血管中的应用。
40.本发明提供了所述lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体作为载体在制备治疗血管损伤相关疾病的药物中的应用。
41.在本发明中，所述药物中活性成分优选包括脂溶性的中药成分，比如治疗支架再狭窄的中药黄芪甲苷。所述脂溶性中药成分通过相似相容原理，与外泌体结合并转运至受损血管，达到血管损伤修复的目的。
42.下面结合实施例对本发明提供的一种lamp2b/vwf-a3区域共修饰的外泌体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1
44.gfp-lamp2b-vwf-a3蛋白修饰的exosome的获得
45.1.主要材料和来源：
46.293培养试剂dmem、胎牛血清(gibco公司产品)、胰蛋白酶(hyclong公司产品)、二氧化碳培养箱(esco公司)、无血清培养基(gibco公司产品)，倒置显微镜，荧光显微镜，生物显微镜，电子显微镜，超净工作台，台式离心机；plvx-gfp-vector(对照空载的质粒载体)；plvx-lamp-gfp-a3(gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达质粒)；plvx-gfp-lamp2b((gfp-lamp2b蛋白过表达过表达质粒)(广州迪利杰生物科技有限公司)；plvx-gfp-vector-exosome(gfp-对照空载质粒转染的外泌体)；gfp-lamp2b-vwf-a3-exosome(gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达的外泌体)；plvx-gfp-lamp2b-exosme(gfp-lamp2b蛋白过表达的外泌体)制备试剂：重水(d2o，上海麦克林生化科技公司)，分析纯蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)，胎牛血清(gibico)，兔抗人gfp抗体(immunoway公司)，辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg二抗(cell signaling technology公司)，hrp化学发光底物、100-kda mwco超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国millipore公司)；透射电子显微镜(fei tecnai 12，philips公司)；定量pcr试剂(北京康为世纪公司)。
47.2)实验方法
48.a.重组过表达载体的构建方法
49.①
plvx-gfp-lamp-gfp-a3重组过表达载体的构建方法：将编码gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白的dna序列(seq id no:4)的两端连接xhoi/bamhi的粘性末端，进行人工合成，插入经xhoi/bamhi双酶切后的线性化plvx-puro质粒中，转入大肠杆菌感受态扩增，提取质粒进行测序验证，确定dna序列无误后质粒保存备用。
50.②
plvx-gfp-lamp2b重组过表达载体的构建方法：将编码gfp-lamp2b融合蛋白(seq id no:5，mvcfrlfpvpgsglvlvclvlgavrsyalelnltdsenatclyakwqmnftvryettnktyktvtisdhgtvtyngsicgddqngpkiavqfgpgfswianftkaastysidsvsfsyntgdnttfpdaedkgiltvdellairiplndlfrcnslstlekndvvqhywdvlvqafvqngtvstneflcdkdktstvaptihttvpsptttptpkekpeagtysvnngndtcllatmglqlnitqdkvasvininpntthstgscrshtallrlnsstikyldfvfavknenrfylkevnismylvngsvfsiannnlsywdaplgssymcnkeqtvsvsgafqintfdlrvqpfnvtqgkystaqdcsadddnflvpiavgaalagvlilvllayfiglkhhhagyeqfgsgagsmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk)的dna序列(seq id no:6，atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagtacgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagc
accattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagctcaagactgcagtgcagatgacgacaacttccttgtgcccatagcggtgggagctgccttggcaggagtacttattctagtgttgctggcttattttattggtctcaagcaccatcatgctggatatgagcaatttggttcgggagcgggaagtatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag)两端连接上xhoi/bamhi的粘性末端，进行人工合成，插入经xhoi/bamhi双酶切后的线性化plvx-puro质粒中，转入大肠杆菌感受态扩增，提取质粒进行测序验证，确定dna序列无误后质粒保存备用。
51.(3)分别收集经plvx-gfp-lamp-gfp-a3重组过表达载体、plvx-gfp-vector(gfp-对照空载质粒)及plvx-gfp-lamp2b(gfp-lamp2b蛋白过表达质粒)转染的293细胞培养上清：选择生长状态良好的3～5代收集plvx-gfp-lamp-gfp-a3、plvx-gfp-vector(gfp-对照空载质粒)和plvx-gfp-lamp2b的293细胞，先用含10％胎牛血清的dmem培养基培养，待细胞融合至70％～80％时换无血清培养基培养，48h后收集培养上清，离心机1000rpm离心15min以去除漂浮的活细胞，-80℃冰箱储存备用。
52.(4)plvx-gfp-vector(对照空载的质粒载体)及plvx-lamp-gfp-a3(gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达质粒)plvx-gfp-lamp2b(gfp-lamp2b蛋白过表达质粒)转染的293细胞培养上清中外泌体的分离纯化(应用蔗糖密度梯度离心法完成，具体参见公开号为cn104490931a的专利)：将收集的293上清液于4℃、2 000
×
g离心10min，以去除细胞碎片；收集上清后于4℃、10000
×
g离心30min，以去除细胞器；将上清转移至100-kda mwco超滤离心管，4℃、1 000
×
g离心30min进行浓缩；将浓缩液缓慢移至5ml30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)，4℃、100 000
×
g离心3h；收集底部5ml蔗糖/重水层(含exosome)，pbs稀释后加入100-kda mwco超滤离心管中，4℃、1 000
×
g离心30min，pbs洗涤3次；最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于－70℃保存。
53.(5)透射电镜观察exosome的基本形态：exosome和4％pfa按1：1混合，充分混匀后取20ul滴在干净的封口膜，在铜网正面扣在液滴上，室温放置20分钟，100ulpbs洗两次每次3min,进行1％的戊二醛固定5-10min,固定后用ddh2o洗五次每次3min,用2％醋酸双氧铀染液，4℃染色10-30min,稍微放在ddh2o中清洗一下，透射电镜拍摄gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达的293细胞培养上清中外泌体及其对照exosome直径约为100nm囊泡状结构(图4)。
54.(6)western blot检测gfp-vector-exosome(gfp-对照空载质粒转染的外泌体)；gfp-lamp2b-vwf-a3-exosome(gfp-lamp2b-vwf-a3区域融合蛋白过表达的外泌体)；gfp-lamp2b-exosme(gfp-lamp2b蛋白过表达的外泌体，近过表达exosome的表面标记-lamp2b无vwf a3区域)的表面标记蛋白：配制15％sds-page电泳胶，将上述提取的exosome充分裂解后加入1/4体积的5
×
sds上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350ma，120min)将蛋白质转至pvdf膜上，用含50g/l脱脂牛奶的tbs/t室温封闭1h，分别与兔抗人gfp抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用tbs/0.5％tween 20洗膜3次后，与hrp标记的山羊抗兔igg二抗37℃温育1h)，tbs/0.5％tween 20洗膜3次后，加入预混hrp化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如附图5所示，gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白成功过表达于exosome中(图5)。
55.实施例2
56.动物实验gfp-lamp2b-vwf-a3蛋白修饰的exosome靶向血管的作用
57.1.原料说明
58.sd大鼠(济宁医学院动物实验中心，此实验由济宁医学院附属医院伦理委员会批准)；
59.pcna抗体(美国bioworld公司)
60.生物显微镜(日本nikon公司)，病理切片he染色及pcna组织化学染色的实验平台(德国leica公司)；
61.2.实验方法
62.1)颈总动脉血管损伤模型的构建：术前对sd大鼠进行禁食12小时处理。用3％异氟烷吸入麻醉。颈部备皮，取仰卧位固定于手术台，用画线笔标记手术切口。术前给予尾静脉注射低分子肝素(100u/kg)创造全身肝素化。用碘伏消毒手术区域，铺无菌洞巾。取颈部正中切口，长约4cm。大鼠颈动脉位置较深，位于气管旁开约2-3mm，常有迷走神经伴行。气管由白色环状的软骨构成。在左侧气管旁，钝性分离胸锁乳突肌后，丝线牵开、固定，找到粗大、搏动的颈动脉，继续往上游离出颈内动脉、颈外动脉。用血管夹临时夹闭颈总动脉近心端，在血管夹及颈总动脉分叉之间选取合适位置，用眼科剪剪一v型切口，将2f fogarty球囊导管插入至颈内动脉(远心端距分叉处0.3-0.5cm)，用ptca压力泵打入4-5个大气压，回拉球囊(以出现摩擦感，且能拉动球囊为合适压力)，重复刺激三次后放掉球囊内气体并拔除球囊，以此通过球囊的摩擦力损伤颈总动脉的血管内皮。
63.2)gfp-lamp2b-vwf-a3融合蛋白修饰的exosome血管损伤部位的靶向作用
64.通过尾静脉，将gfp-vector-exosome、gfp-lamp2b-vwf-a3-exosome及gfp-lamp2b-exosme注射颈总动脉血管损伤的大鼠模型，注射的浓度均为5x105/200μl的pbs溶液，24h小时后，切取损伤的颈总动脉及对侧未损伤的血管，通过荧光显微镜检测绿色荧光分析exosome的靶向情况，结果显示经过vwfa3区域修饰的gfp-lamp2b-vwf-a3-exosome能够定向靶向血管，且其靶向损伤血管的量大于对侧健康血管(图6)，证明gfp-lamp2b-vwf-a3-exosome具有很好的损伤血管靶向性。
65.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。