一种IGFBP-1的单克隆抗体及其制备方法和应用

一种igfbp-1的单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种igfbp-1的单克隆抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胎膜早破是指孕产妇在临产前发生的胎膜破裂，临床发生率为5％-17％，是一种常见的多发性产科并发症，对母婴生命安全危害极大。
3.胎膜早破的主要临床表现为持续或者间断的阴道排液。因胎膜完整性遭到破坏，胎儿宫内感染和新生儿呼吸窘迫综合征的发生率明显升高，是诱发围生儿早产、死亡、难产及产后出血等不良妊娠结局的关键诱因，对母婴均有较大的危险性。及时发现和处理胎膜早破可以有效减少胎儿的病死率和母婴并发症的发生。因此对胎膜早破疑似患者的快速和准确的诊断具有重大临床意义。
4.胎膜早破早期诊断的金标准是在羊膜腔内注入如美蓝等有色物质，若阴道内有相应颜色液体流出即可诊断为胎膜早破，该法操作不便，并有羊膜腔穿刺相关并发症风险，故临床很少用。目前常用的方法是通过检测阴道分泌物中是否有胎儿或者羊水的成分来判断胎膜早破的发生，主要类型有：
5.1、阴道液酸碱度检查。胎膜破损时，羊水会混入阴道液导致ph升高。当其ph值≥6.5时即为阳性,提示胎膜早破。然而阴道液中混有其他的碱性物质如精液、血液或细菌污染等,可出现假阳性。而流出的羊水量较少时，会造成假阴性。
6.2、涂片染色检查。取阴道液涂于玻片上，干燥后显微镜下观察，出现羊齿状结晶提示为羊水。但精液和宫颈黏液可造成假阳性。
7.3、超声检查：对于可疑胎膜早破孕妇，超声检测羊水量可能有一定帮助，如果超声检查提示羊水量明显减少，同时孕妇还有过阴道排液的病史，在排除其他原因导致的羊水过少的前提下，应高度怀疑胎膜早破，但其准确率不高，应结合生化指标检测手段进一步确诊。
8.4、免疫方法检测：针对胎盘、羊水和胎儿成分的免疫学检查如：阴道液人绒毛膜促性腺激素(β-hcg)、催乳素、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)、胎盘α微球蛋白1(placental alpha-microglobulin-1，pamg-1)和igfbp1等标志物的检测在近几年应用最多。由于免疫学检查采用无创的手段采集阴道分泌液，检测便捷快速，结果精准，是近年来采用最多的胎膜早破生化检测方法，多集中在单个或联合igfbp-1、pamg-1、afp和β-hcg的检测。
9.igfbp-1目前已成为胎膜早破的关键标志物之一。igfbp-1是由234个氨基酸组成的一种与胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，igf)具有高亲和力的蛋白，igfbp-1表达具有较大的组织特异性，通常由胎儿肝脏、肾、孕期子宫蜕膜和黄体化颗粒细胞合成并分泌。由于igfbp-1不能透过胎膜，正常孕妇的阴道分泌物、尿液、宫颈黏液以及性生活留下的精液中igfbp-1含量极少，常规检测方法很难检测到。当发生胎膜破裂时，羊水
中的igfbp-1可通过胎膜破口渗出到阴道内，此时阴道分泌物中可检测到高浓度的igfbp-1，对胎膜早破的阳性预测准确率接近100％，已成为胎膜早破检测的金指标。
10.开发igfbp-1单克隆抗体能解决我国在igfbp-1检测试剂盒方面的需求缺口，降低检测成本，推动国内胎膜早破和早产风险孕妇的精准处理。


技术实现要素：

11.针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种igfbp-1抗原多肽，目的二在于提供包含上述抗原多肽的免疫抗原，目的三在于提供采用上述免疫抗原免疫动物获得的igfbp-1的单克隆抗体，目的四在于提供上述单克隆抗体在制备胎膜早破诊断试剂中的应用，目的五在于提供一种胎膜早破检测试纸卡。本技术筛选得到两种igfbp-1特有的抗原表位，针对该抗原表位制备的单克隆抗体可用于igfbp-1检测，为胎膜早破的诊断与治疗提供可靠的科学依据。
12.为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
13.一种igfbp-1抗原多肽，其氨基酸序列分别如seq id no：1或seq id no：2所示；其中，氨基酸序列如seq id no：1所示的抗原表位位于igfbp-1蛋白的n端，氨基酸序列如seq id no：2所示的抗原表位位于igfbp-1蛋白的c端。
14.一种免疫抗原，采用上述igfbp-1抗原多肽与大分子蛋白共价偶联制备。
15.优选地，所述大分子蛋白为klh、bsa或ova。
16.一种抗体，是将上述免疫抗原免疫动物制备。
17.优选地，所述抗体为单克隆抗体。
18.上述单克隆抗体的制备方法，采用上述免疫抗原免疫小鼠获得免疫的脾细胞，将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选后获得igfbp-1的单克隆抗体株，将所述igfbp-1的单克隆抗体株分泌的抗体进行纯化，获得所述单克隆抗体。
19.上述抗体在制备胎膜早破诊断试剂中的应用。
20.一种胎膜早破检测试纸卡，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；所述金标垫制备过程中，采用的胶体金标记针对抗原表位1的单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上划有两种抗体，为检测线和质控线，所述检测线用针对抗原表位2的单克隆抗体划线，所述质控线用兔抗鼠多抗划线；所述抗原表位1和抗原表位2不同，两者选自氨基酸序列如seq id no：1或seq id no：2所示的抗原表位。
21.作为对上述胎膜早破检测试纸卡的进一步优化，所述胶体金标记的标记条件为：ph8.5、标记量为5ug/ml，室温标记半小时后采用1％的bsa进行室温封闭1小时；4℃，12000rpm离心15min，收集金沉淀后用20mm的硼酸缓冲液重悬，并喷涂在玻璃纤维上干燥，制备金标垫。
22.作为对上述胎膜早破检测试纸卡的进一步优化，所述检测线和质控线的划线浓度均为1mg/ml。
23.有益效果：本发明通过筛选获得的两个igfbp-1抗原表位分别位于蛋白的两端，在天然状态下处于蛋白的外周，作为表位能有效地被抗体识别和结合，所制备的抗体特异性和亲和力更高，显著提高igfbp-1的检测灵敏度。
附图说明
24.图1是单克隆抗体筛选结果图；
25.图2是单克隆抗体配对结果图；
26.图3是空白对照和1ng/ml的重组igfbp-1测试结果图。
具体实施方式
27.本发明提供一种igfbp-1的单克隆抗体及制备方法。
28.1、通过生信检索和对比igfbp同源蛋白，以及对igfbp-1序列抗原性的分析，筛选出igfbp-1中n端抗原表位(n端-stydgskalhv-c端，其中s和y为磷酸化修饰)(seq id no：1)及c端抗原表位(n端-dpncqiyfnvqn-c端)(seq id no：2)，这2个表位位于蛋白表面，在天然状态下处于蛋白的外周，作为表位能有效地被抗体识别和结合，而且在孕晚期igfbp1这个位点高度磷酸化，因此我们对n端位点采用磷酸化修饰，更贴近生理状态，所制备的抗体特异性和亲和力更高，有助于提高igfbp-1的检测灵敏度。
29.2、免疫抗原采用合成的多肽与大分子蛋白，如klh、bsa、ova等，进行共价偶联获得。筛选抗原采用真核细胞表达的igfbp-1全序列重组蛋白。
30.3、小鼠免疫采用多点皮下法或肌肉注射法，佐剂为佛氏佐剂或铝佐剂。
31.4、采用peg进行b细胞与骨髓瘤细胞的融合，hat筛选后，用igfbp-1重组蛋白包被的elisa方法筛选，最后得到igfbp-1的单克隆抗体株，该抗体针对的为igfbp-1中n端和c端抗原多肽的表位。
32.实施例1
33.1、免疫抗原和检测抗原的制备
34.(1)、将2种多肽、klh、edc分别用50mm mes缓冲液(ph6)溶解，终浓度分别为2mg/ml，1mg/ml及500mg/ml。
35.(2)、取500μl的多肽溶液加入到1ml的klh溶液中并混合，并往里缓慢滴加100μl edc溶液，边滴加边振荡，并置于磁力搅拌器室温反应2h，使多肽和klh进行偶联。
36.(3)、反应结束后，将混合物加入15kda的透析袋中，4℃下用1l的pbs中透析5次，除去偶联副产物，换液间隔为4-6h。
37.(4)、收集透析后的多肽-klh偶联物，
38.2、小鼠免疫
39.4只6-8周龄balb/c雌性小鼠，采用肌肉多点免疫。
40.表1小鼠免疫流程表
41.备注：抗原与铝佐剂按照1:1体积混合，融合前三天的加强免疫不加佐剂腹腔注射。
42.3、elisa血清和培养上清检测
43.(1)抗原包被：将重组igfbp-1蛋白用碳酸盐包被缓冲液(无水碳酸钠63.6克及碳
酸氢钠33.6克溶于蒸馏水中稀释至1000ml)稀释到5μg/ml，100μl/孔，包被96孔板，然后37℃恒温恒湿孵育2h。
44.(2)封闭：孵育2h后倒弃包被液，用含有0.1％ bsa的pbs进行封闭，每孔200μl，37℃孵育2h。
45.(3)洗涤：每孔用200μl的pbst洗3次，并拍干。
46.(4)加样：小鼠的血清分别用pbs稀释4-12万倍后，取于100μl加入96孔板，37℃孵育20min。融合细胞筛选直接取细胞培养板内100μl的培养上清加入elisa板即可。
47.(5)洗涤：将酶标板内的待测血清(或培养上清)倒空，每孔用200μl的pbst洗3次，并拍干。
48.(6)二抗：hrp标记的兔抗鼠igg抗体用pbs稀释2000倍后，每孔加入100μl，37℃孵育20min。
49.(7)洗涤：倒弃二抗溶液，每孔用200μl的pbst洗3次，并拍干。
50.(8)显色：每孔加入显色液100μl，置于室温下显色10min。
51.(9)终止：每孔加入终止液50μl，并于450nm酶标仪检测od值。
52.4、细胞融合
53.(1)脾淋巴细胞的制备
54.拉颈处死免疫小鼠，75％的酒精浸泡消毒5min。无菌取出脾脏，用dmem不完全培养基清晰外层后置于小培养皿内，用5ml注射器往脾脏内注入培养基，冲出脾脏内细胞，通过多次注射直至脾脏颜色从深红变为微红。1200rpm离心5min收集脾细胞，用dmem不完全培养基重悬并计数。
55.(2)细胞融合
56.从培养皿收集sp2/0骨髓瘤细胞，按照骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：10的比例混合均匀，离心清洗2次(1000rpm，5min)。完全去除无血清培养基，轻轻敲打离心管，边转边敲打，将细胞沉淀完全分散。将离心管置于加了37℃水的250ml烧杯中，轻微摇晃2min后缓慢滴加1ml的50％ peg，静置60s进行融合。90s后缓慢滴加37℃的不完全dmem 30ml,900rpm离心5min收集细胞。hat完全培养基(15％小牛血清)重悬细胞，100μl/孔加入饲养细胞的培养板，隔2天换液，7天后更换为ht培养基，13天后换成正常完全培养基。待融合的细胞克隆长满10％孔底的时候进行上清中抗体检测，具体elisa血清和培养上清检测所述。
57.(3)细胞亚克隆
58.采用有限稀释法进行亚克隆。提前一天按照前述制备好饲养细胞。在显微镜下用油性笔对筛选到的阳性克隆做标记，用10μl的移液枪把克隆吸出后用ht培养基梯度稀释，每孔100μl加入到饲养细胞板中，每个梯度1排。培养7～10天，每2天换液，在肉眼观察到克隆后再次检测上清中抗体，再将阳性孔内的细胞继续扩大培养并冻存。
59.(4)抗体配对
60.杂交瘤细胞培养上清采用饱和硫酸铵法初步提纯后，采用高碘酸法偶联hrp。具体如下：(1)称取1mg hrp溶解于1ml蒸馏水中；(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1m naio4溶液，室温下避光搅拌20分钟；(3)将上述溶液用15kd的超滤管过滤；
(4)用1ml的10mm(ph9.5)碳酸盐缓冲液重悬，取100ul分别加入1ml的1mg/ml的igfbp-1碳酸盐缓冲液中(0.01m)，室温避光轻轻搅拌2小时；(5)加0.03ml新配的4mg/ml nabh4液，混匀，再置4℃2小时；(6)将上述溶液用15kd的超滤管过滤，用500ulpbs重悬；(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；(8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15m ph7.4的pbs中；(9)抗体棋盘杂交：采用100ul 5ug/ml的未标记抗体包板，封闭后与5ug/ml的igfbp-1重组蛋白反应，清洗3次后分别交叉加入hrp标记的抗体，37℃反应半小时后清洗显色，得到4对配对合适的抗体，结果如图1和2。
61.实施例2
62.一种快速检测试剂卡：包括如下组分：
63.1、用于使检测样品显色的胶体金，所述胶体金标记本发明中针对抗原表位1的igfbp-1磷酸化单克隆抗体抗体。标记条件为ph8.5，标记量为5ug/ml，室温标记半小时后采用1％的bsa进行室温封闭1小时。4℃，12000rpm离心15min，收集金沉淀后用20mm的硼酸缓冲液(ph7.5，1％bsa，1％蔗糖)重悬，并喷涂在玻璃纤维上干燥。
64.2、检测线用针对igfbp-1表位2的单克隆抗体(1mg/ml)划线，质控线为兔抗鼠多抗(1mg/ml)划线。样品垫采用20mm的硼酸缓冲液浸泡后干燥处理(ph7.5，1％bsa，1％蔗糖，0.75％曲拉通-100)
65.3、检测卡由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成。样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2-3mm重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机且为3mm条子，包装后干燥室温保存。
66.4、用1ng/ml的重组igfbp-1测试，结果如图3，左边为空白对照只有c线，没有t线，右边为1ng/ml的重组igfbp-1，有显著的t线出现，说明能有效检测到igfbp-1。
67.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。