一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用。


背景技术：

2.细胞培养肉，是指利用细胞培养技术，在体外培养动物肌肉干细胞并通过分化形成肌肉组织，并将其加工为食用的肉类蛋白，属于一种新兴的未来食品。细胞体外培养主要包括贴壁培养和悬浮培养两种主要方式，相比于贴壁培养，悬浮培养细胞具有明显的优势：悬浮细胞可以在培养基中以悬浮的状态进行生长增殖，细胞密度可达到每毫升数千万个细胞，而且传代方便、易收获细胞。然而，许多细胞由于锚定生长的特性只能贴壁培养，一次性收获的细胞数量受到严重限制。对于商业化培养模式来说，首要的是实现细胞数量的最大化。因此，将贴壁细胞系驯化为悬浮生长的细胞系是非常重要的。
3.传统的贴壁培养使用动物血清为细胞贴壁、增殖和分化提供所需的营养成分和生物因子，但血清成分不明确，在提取的血清中可能带入支原体、病毒等，不能满足食品安全的要求。近年的研究表明，无血清培养基对细胞的生长速率、细胞密度、产物及蛋白表达水平可与血清培养基相比，并且可以通过精确控制无血清培养基组分调控细胞的增殖分化节点，其显著的优势将逐步取代含血清细胞培养。
4.由于无血清悬浮生长的技术壁垒高，很少有细胞系能轻易地从贴壁生长模式转变为无载体无血清悬浮生长模式。目前，胚胎干细胞已经成功实现悬浮培养、成纤维细胞可实现90％以上的细胞以单细胞无血清悬浮生长、间充质干细胞仍以细胞锚定成团的方式悬浮生长。肌肉干细胞在微载体上悬浮贴壁培养而收获的细胞受限、依赖于血清生长而且不满足细胞培养肉的商业化需求，还没有真正实现无载体无血清悬浮生长。
5.因此，迫切需要将肌肉干细胞驯化为适应无载体无血清悬浮生长的干细胞系，放大悬浮培养以扩增足够数量的肌肉干细胞，是实现细胞培养肉商业化生产的重要手段。


技术实现要素：

6.1.发明目的
7.本发明针对目前肌肉干细胞无载体无血清悬浮培养领域研究的空白，提供了一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用，该驯化方法是将猪肌肉干细胞依次进行2d贴壁生长、3d微载体贴壁悬浮培养、3d微载体贴壁悬浮放大培养和无载体无血清悬浮培养，得到适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系，并利用上述方法驯化猪肌肉干细胞yp-s4-sc获得适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系幼猪肌肉干细胞株yp-s4-s-sc，该细胞系可在摇瓶、转瓶和反应器中进行无载体无血清悬浮培养，最高细胞密度达在1.5
×
106/ml左右，并稳定增殖8代左右，细胞活率在90％以上，可用于大规模的细胞培养肉制备。
8.2.技术方案
9.为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
10.本发明提供了一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，驯化后获得的猪肌肉干细胞系能适应无载体无血清悬浮培养，该方法包括如下步骤：
11.s1：猪肌肉干细胞2d贴壁生长，猪肌肉干细胞用含15％～20％胎牛血清的dmem培养基，37℃培养箱中培养2～3天，换液培养，细胞密度在60～80％进行胰酶消化处理，离心得到细胞沉淀；
12.s2：3d微载体贴壁悬浮培养，用含15％～20％胎牛血清的dmem培养基重悬s1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的dmem培养基转瓶中，进行3d微载体贴壁悬浮培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；5～6天后添加终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液(3d digest溶液)，37℃培养箱中50
±
5rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀；
13.s3：3d微载体贴壁悬浮放大培养，用含15％～20％胎牛血清的完全培养基重悬s2中的细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的完全培养基的生物反应器中，进行3d微载体贴壁悬浮放大培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；6～7天后去除50％培养基并加入终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液(3d digest溶液)，微载体完全溶解后离心收获适应贴壁悬浮的细胞；
14.s4：无载体无血清悬浮培养驯化，将s3中收获的适应贴壁悬浮的细胞接种到含有0.01％羟丙基甲基纤维素和0.1％抗结团剂的无血清培养基中，悬浮驯化培养，稳定增殖后得到适应无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系。
15.优选地，上述步骤s1中，用含15％胎牛血清的dmem培养基，37℃培养箱中培养2天，进行换液，细胞密度在60％进行胰酶消化处理。
16.优选地，上述步骤s2中，用含15％胎牛血清的dmem培养基重悬s1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1mg/ml微载片、15％胎牛血清的dmem培养基转瓶，进行3d微载体贴壁悬浮培养；3天后更换50％的新鲜培养基；5天后添加终浓度为1mg/ml的微载片裂解液(3d digest溶液)，37℃培养箱中50rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀。
17.优选地，上述步骤s2中，转瓶接种后的细胞密度为(2～10)
×
104个/ml。
18.优选地，上述步骤s2中，3d微载体贴壁悬浮培养条件为：37℃培养箱中，磁力搅拌体系控制在转速为40rpm，5min；0rpm，2h；24h后转速调整为50rpm，可以使细胞更好的贴壁在微载体上。
19.优选地，上述步骤s3中，用含15％胎牛血清的完全培养基重悬s2中的细胞沉淀，接种到含1mg/ml微载片、15％胎牛血清的完全培养基的生物反应器中，进行3d微载体贴壁悬浮放大培养；3天后更换50％的新鲜培养基；6天后去除50％培养基并加入终浓度为1mg/ml的微载片裂解液(3d digest溶液)，微载体完全溶解后离心收获适应贴壁悬浮的细胞。
20.优选地，上述步骤s4中，无血清培养基中接种后的细胞密度为(2～5)
×
105个/ml。
21.优选地，上述步骤s4中悬浮驯化培养条件为：37℃，转速为90～120rpm。
22.优选地，上述猪肌肉干细胞为猪肌肉干细胞yp-s4-sc，保藏于中国典型培养物保
s-sc，该细胞系可在摇瓶、转瓶和反应器中进行无载体无血清悬浮培养，最高细胞密度在1.5
×
106/ml左右，并稳定增殖8代左右，细胞活率在90％以上，可用于大规模的细胞培养肉制备。猪肌肉干细胞的悬浮增殖，打破了肌肉干细胞的贴壁生长特性，悬浮增殖可以节省培养空间和培养成本、人工成本等，在推进培养肉发展方面发挥重要作用。本发明提供的干细胞系yp-s4-s-sc，是国际上首个可悬浮培养的猪肌肉干细胞系。
附图说明
38.图1是肌肉干细胞在2d 10cm上的生长图片。
39.图2是肌肉干细胞在3d微载体上的生长图片。
40.图3是肌肉干细胞在无血清摇瓶中，不同生长周期的倍增及细胞活率的结果。
41.图4是肌肉干细胞无血清悬浮放大后在植物蛋白支架上的贴壁情况。
42.图5是肌肉干细胞无血清悬浮放大后在植物蛋白支架上的细胞存活情况。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
44.需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
45.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
46.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
47.如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
48.如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“a、b和c中的至少一个”明确包括仅a、仅b、仅c以及它们各自的组合。
49.浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
50.实施例1
51.本实施例提供一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，以自发永生化细胞系猪肌肉干细胞yp-s4-sc(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:c2022256，保藏日为2022年8月6日)为原始细胞系，包括如下步骤：
52.s1：猪肌肉干细胞2d贴壁生长，将原代猪肌肉干细胞yp-s4-sc从液氮罐中取出，37℃水浴锅中快速融合，之后加入到4ml15％胎牛血清(sigma，f8318)的dmem培养基(gibco，c11330500bt)中，330g离心5min，去除冻存液得到细胞沉淀；用15％胎牛血清的dmem培养基重悬细胞，然后细胞接种到铺有胶原的10cm培养皿中，37℃培养箱中培养2天，进行换液，3天细胞密度在60％左右时进行消化传代；如图1所示，用胰酶消化2min，之后加入血清培养基终止消化，330g离心5min，分离得到细胞沉淀；
53.s2：猪肌肉干细胞的3d微载体贴壁悬浮培养，用10ml含15％胎牛血清的dmem培养基重悬细胞沉淀，取10μl重悬液进行细胞计数；在无菌的125ml转瓶中加入10ml 15％胎牛血清的dmem培养基，60mg微载片(华龛，f01-100)，轻轻摇晃使其充分溶解；将细胞悬液放置于125ml转瓶中，加入培养基补至60ml，细胞密度为4
×
104个/ml，放入37℃培养箱中，磁力搅拌体系控制在转速为40rpm，5min；0rpm，2h持续运行，使细胞更好的贴壁在微载体上，24h后，转速调整为50rpm；第3天取出转瓶，停止搅拌5～10min左右，使微载体充分沉淀后，用移液枪从侧口吸除50％上清液，再更换50％新鲜培养基，继续培养并观测肌肉干细胞在微载体上的增殖情况(如图2所示)；第5天取出转瓶，让微载体自然无搅拌5～10min沉降，吸出约2/3的上清液，再向转瓶中添加终浓度为1mg/ml的微载体裂解液(3d digest溶液)，将转瓶于37℃培养箱中50rpm裂解20～30min，微载片完全被溶解后，330g离心5min，获得细胞沉淀并进行重悬计数，细胞增殖10～16倍；
54.s3：3d微载体贴壁悬浮放大培养，将2g微载体片与500ml含15％胎牛血清的完全培养基加入到无菌瓶中，使微载片完全溶解；将转瓶培养收集的7.5
×
107细胞用50ml含15％胎牛血清的完全培养基重悬，转移到无菌瓶，加培养基至终体积为2l；用鲁尔连接器将无菌瓶连接到生物反应器(华龛，3d flotrix
@
vivaspin)，用蠕动泵以300ml/min的速度将容器中的所有介质泵入生物反应器中，将do设定值设置为70％，ph设置为7.2，温度设置为37℃，搅拌设置为35rpm，控制器将自动调节空气和co2输入以及热垫，以保持系统在设置点；第3天，用蠕动泵以300ml/min的速度泵出容器中1l的废介质到废瓶中，用蠕动泵以300ml/min的速度注入1l新鲜的含15％胎牛血清的完全培养基；第6天，用蠕动泵以300ml/min的速度将容器中的废介质泵出1l到废瓶中，用蠕动泵以300ml/min的速度注入浓缩的3d微载体裂解液(digest溶液，终浓度1mg/ml)，在微载体溶解过程中，搅拌速度提高到50rpm，当所有微载体完全溶解后，将培养瓶中的细胞悬浮液以300ml/min的速度泵入采集瓶，330g离心5min，弃上清液，在500ml pbs中重悬，取样品进行计数细胞，细胞增殖10～16倍，计数完成之后再次进行离心，弃上清液，加入冻存液，进行细胞冻存；
55.s4：猪肌肉干细胞的无载体无血清悬浮培养驯化，s3收获的细胞进行复苏，将细胞放入125ml摇瓶中，加入含有0.01％羟丙基甲基纤维素(selleck，s4444)和0.1％抗结团剂(gibco，01-0057ae)的无血清培养基20ml，细胞为1
×
107，细胞密度为5
×
105个/ml，转速为90rpm，120rpm进行悬浮驯化；第2天、4天补10ml的无血清培养基，同时对细胞的生长情况和代谢指标进行检测；第6天将细胞悬液收集至50ml离心管中，330g离心5min，回收上清，加入4ml胰酶替代物tryple
tm express(gibco,12604-021)，37℃消化2min。加入6ml dmem/f12，终止消化并吹散细胞，再次进行离心，加入10ml培养液进行重悬，取细胞悬液进行细胞计数，细胞增殖显著。根据计数结果取5
×
106个进行冻存；将剩余重悬细胞放入摇瓶中，细胞密度为5
×
105个/ml，进行连续培养，获得适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系，
个细胞加入含有0.01％羟丙基甲基纤维素和0.1％抗结团剂的无血清培养基1.2l(0.5mm钙离子)，细胞密度为6.7
×
104个/ml，转速为90～120rpm。
72.(2)第2天、4天补600ml的无血清培养基，同时对细胞的生长情况和代谢指标进行检测。
73.(3)第6天将细胞悬液收集至50ml离心管中，330g离心5min，回收上清，加入胰酶替代物，37℃消化2min。加入dmem/f12，终止消化并吹散细胞，再次进行离心，加入10ml培养液进行重悬，并取细胞悬液进行细胞计数，细胞活率在98％以上(表2)。
74.表2yp-s4-s-sc在生物反应器中的悬浮放大培养结果
[0075][0076]
实施例5
[0077]
本实施例提供适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系在制备细胞培养肉中的应用，重点评估其在植物花生蛋白支架上的再贴壁能力，具体包括如下步骤：
[0078]
(1)花生蛋白支架制备：将花生蛋白支架室温浸泡于超纯水中直至完全膨胀，用解剖刀切成2cm
×
2cm
×
0.5cm大小，60℃真空干燥3h，121℃高温高压灭菌15min，将灭菌后的支架浸泡在无血清培养基中，置于37℃培养箱中备用。
[0079]
(2)细胞接种：用镊子将浸泡在无血清培养基中的花生蛋白支架夹入低黏附培养皿中，轻微挤压去除多余培液；取细胞悬液200、300、400μl，细胞密度1.25
×
107cells/μl，均匀接种于花生蛋白支架上；完成细胞接种后，转移至37℃培养箱中静置2h，待细胞迁移至支架后，向培养皿中加入无血清培养基30ml，置于37℃培养箱中继续培养。
[0080]
(3)花生蛋白支架上细胞的掉落情况：每天吸取浸泡支架的无血清培养基，300g离心，进行细胞计数，记录每天细胞的掉落情况(表3)。
[0081]
表3不同密度细胞接种到植物蛋白支架上的脱落情况
[0082][0083]
(4)显微镜下检测细胞的贴壁能力及细胞存活情况：在显微镜下观察记录肌肉干细胞在花生蛋白支架上的贴壁情况(如图4所示)，在显微镜下观察记录肌肉干细胞在花生蛋白支架上的存活情况(如图5所示)，表明适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系幼猪肌肉干细胞株yp-s4-s-sc可以在蛋白支架表面生长，制备成细胞培养肉。