sBCMA变体及其Fc融合蛋白

sbcma变体及其fc融合蛋白
1.序列表
2.本技术包含序列表，其已经以ascii格式电子提交并且特此通过提及而以其整体合并。创建于2020年8月11日的所述ascii复本被命名为121076-5004-pr_st25.txt并且大小为60.0千字节。
i.发明领域
3.本发明涉及可溶性b-细胞成熟抗原(sbcma)变体和sbcma变体-fc融合蛋白，编码所述sbcma变体和/或sbcma变体-fc融合蛋白的多核苷酸，制备所述sbcma变体和/或sbcma变体-fc融合蛋白的方法，和使用包含所述sbcma变体和/或sbcma变体-fc融合蛋白的组合物的方法，例如在治疗疾病例如肿瘤/癌症、免疫调节病症、纤维变性等中。
4.ii.发明背景
5.肿瘤坏死因子(“tnf”)家族由被称为tnf家族配体和tnf家族受体的配体和其特异性受体对组成(bazzoni等人,n.engl.j.med.1996、334(26):1717)。所述家族牵涉免疫系统和可能地其他非免疫系统的调节。tnf家族信号传导的调节可以导致大量的随后事件。tnf可以起始生物对于外来侵入的一般性保护性炎症反应，其包括经改变的在细胞运输中所牵涉的粘着分子的展示，趋化因子产生以驱动特定细胞到特定区室中，以及各种效应细胞的引发。因此，这些途径的调节具有临床潜力(us 9,650,430 b2)。
6.b-细胞成熟抗原(bcma)是肿瘤坏死因子受体家族的一个成员。在图7中显示了bcma的细胞外结构域的氨基酸序列。例如，bcma为关于增殖诱导配体(april)和tnf家族的b-细胞激活因子(baff)的受体。抗-bcma抗体(包括抗体药物缀合物(adc))在早期测试中已显示出在治疗癌症中的初步成功，因为具有bcma双特异性t细胞参与性抗体和使用bcma的car-t构建体。
7.以前在wo 99 12965和us 7,276,241 b2(其通过提及而合并入本文)中描述了april。在图7中显示了april的细胞外结构域的氨基酸序列。april表达和功能研究暗示，该蛋白质被肿瘤细胞利用来诱导快速增殖。另外，april可以在其他疾病场景中起作用，例如在细胞增殖性疾病例如与一些自身免疫疾病(例如，狼疮)相关联地发生的那些中，或者在其中细胞群体快速扩展的炎性疾病(例如，细菌性脓毒症)中(us 7,276,241b2)。
8.以前在wo/0012964和us 9,650,430 b2(其通过提及而合并入本文)中描述了baff。在图7中显示了baff的细胞外结构域的氨基酸序列。baff是对于b细胞的细胞存活和成熟因子，并且baff的过产生与全身性自身免疫疾病相关联。在人中，在一定比例的具有自身免疫风湿性疾病(特别是系统性红斑狼疮和舍格伦综合征)的患者的血液中可检测到高水平的baff(groom等人,j.clin.invest.,2002,109:59；zhang等人,j.immunol.,2001,166:6；cheema等人,arthritis rheum.2001,44:1313，其全部通过提及而合并入本文)。baff也是对于t细胞的一种有效共刺激剂，并且该共刺激完全通过baff-r而发生(ng等人,j.immunol.,2004,173:807，其通过提及而合并入本文)。
9.跨膜激活物和caml互作物(taci)(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13b
(tnfrsf13b))是iii型跨膜蛋白。几种蛋白质(baff/blys、april、黏结蛋白聚糖-2)已被鉴定为taci配体。taci与其配体的相互作用诱导转录因子nfat、ap1和nf-κb的激活，并且通过调节b细胞增殖和存活而在体液免疫中发挥至关重要的作用。b细胞的taci激活导致其分化和成熟，包括抗体同种型转换，和t细胞非依赖性抗体产生(chinen等人,j allergy clin immunol.2011,127(6):1579，其通过提及而合并入本文)。
10.april和baff可以与受体例如bcma、baff-受体(baffr)和taci相结合，并且因此中和april和/或baff可以用于治疗疾病，例如由于改变的通过bcma、baffr和/或taci的信号传导途径而引起的癌症、自身免疫疾病和纤维变性。
11.用于癌症、免疫调节病症和纤维变性病症的当前治疗对于许多疾病类型来说是不适当的，这归因于差的效力、低的对于存活的影响、引起严重副作用的毒性或其组合。因此，存在鉴定和开发另外的用于治疗癌症和/或免疫调节病症的方法的需要，所述方法可以提供效力而不诱导严重的副作用。本发明满足了这个和其他的需要。
12.本发明的目标是提供具有经改善的特性(例如，增加的对于april和/或baff的结合亲和力，等等)的sbcma变体或sbcma变体-fc融合蛋白，以及制备此类sbcma变体和/或其fc融合蛋白和在治疗具有癌症和/或免疫调节病症的患者中使用此类sbcma变体和/或其fc融合蛋白的方法。
13.iii.发明概述
14.本发明尤其提供了sbcma变体和其fc融合蛋白，编码所述sbcma变体和/或其fc融合蛋白的多核苷酸，制备所述sbcma变体和/或其fc融合蛋白的方法，和使用所述sbcma变体和/或其fc融合蛋白(特别是用于治疗疾病例如癌症或免疫调节病症)的方法。在一些实施方案中，所述sbcma变体用于治疗癌症或免疫调节应用。在一些实施方案中，所述sbcma变体-fc融合蛋白用于治疗癌症或免疫调节应用。
15.在一个方面，本发明提供了组合物，其包含相比于seq id no:1而言包含至少一个氨基酸置换的变体可溶性b-细胞成熟抗原(sbcma)，其中所述氨基酸置换在从由下列各项组成的组中选择的位置编号处：1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、16、19、20、22、23、25、26、29、31、32、35、36、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54，其中所述编号是按照eu索引的。
16.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
17.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换出现在所述位置中的一个，所述位置中的二个，所述位置中的三个，所述位置中的四个，所述位置中的五个，所述位置中的六个，所述位置中的七个，所述位置中的八个，或所述位置中的九个处。
18.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36a、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、
k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
19.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：m1v、l2s、q3p、m4t、s9p、n11d、s16g、h19y、n31s、n31d、t32i、t36a、r39h、n47s、k50e和n53e。
20.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：s16g、h19y和t36a。
21.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：l2s/s9p/e12k/n31d/t36a/n42s/n53s、m1v/t32p/t36a/t46i/n53d/a54v、q3r/s16n/t36a/a43t、f14l/s16g/t36a/v45a/n47d、m1t/m4v/s9f/s16g/t32a/q38r、m1a/s9a/q38r、g6e/q25r/q38r、m1v/m4i/g6e/s9p/n11d/v49m/t52m/a54v、n11d/s16g/n31s、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、g6e/q7r/h19y/l35s、h19y/n42d/s48p/t52a、m1v/n31d/t32i/t36a、m1v/a5t/h19l/t36a、m1t/n31d/t32a/t36a/q38r/s44d/v49a/k50e、m1v/t36a/q38r/a43v、m1v/l2s/s9p/q10h/t36a/q38r/k50g、t36a/q38r/n53s、m1t/l2s/l35p/t36a/q38r/t46a/k50r、a5t/a20v/t36a/q38r、m1t/s16g/i22v/t36a/s44g/t46a/v49a、s16g/t36a、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、m1c/l2c/q3r/m4e/n11d/s16g/t36p、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、n11d/n31d/t32i/t36a/s44n/n47d/n53d、m1r/l2c/q3r、h19y/t36a/s44g、h19y/t32i/t36a/v49a、h19y/n31s/t36a/v45a、h19y/n31s/t36a、h19y/t36p/t52a、h19y/n31d/t52m、m1v/h19y/v45m、s16g/h19y/n47d、s16g/h19y/k50t、s16g/h19y/s44n/k50r、n11d/h19y/s48t、s9p/n11d/s16r/t32a/q38r/s44g/t46i/t52a/n53d/a54t、n11d/s16g/s44r、h19l/t32a/s44g/g51e/t52a、s16n/h19y/t36a/k50r、m1v/h19y/t36a/r39h/t46a、m1v/h19y/t36a、h19y/t36a/n42d/n47s/s48p、m1v/h19y/t36a/s44g/n47d、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、h19y/l35p/t36a/n42d/t46i/v49a、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、m1t/h19y/t36a、m1v/s16n/h19y/i22m/t36a、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、m1v/s9p/q10p/s16g/h19y/l26f/t36a/a43v/n53d、s16g/h19y/t36a/v49a/n53d、s16g/t36a/a43t/s44g/v45m、m4v/s9p/s16g/t36a/q38r、s9p/n11s/s16g/t36a/q38r、n11d/e12k/s16r/t36a/t52m、m4v/t32i/t36a/q38r/a43t/v45a/s48p、s9p/n11d/s16g/q25r、m1t/a5t/s9p/s16g/q25r/n31d/v49m、l2s/s9p/s16g/a20t/t32i/q38r/n42d/t46a/s48l、s16g/q25r/t46a、g6e/s9a/s16g/q25r/n31d/n47s/t52m、h19y/q38r/t52m、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、s16g/h19y/t36a、s16g/h19y/t36a/n53d、s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/n11d/t36a、m1v/l2s/m4t/h19y/t36i/v45a/v49m、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/s9p/q10r/h19y/t36a/t46a/n47s、m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a、m1v/m4t/t36a/q38r/n53k、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、m1t/n31d/t32a/t36a/a38r/s44d/v49a/k50e、m1t/s9p/p23s/q38r/n42s/s48p/v49a/a54v、h19y/t36a/s44g、h19y/t36a和m4t/t36a/q38r/n42s/s44g/t46a/n47k/s48p/t52a。
22.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、
s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
23.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
24.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma包含氨基酸置换s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
25.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma包含氨基酸置换q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
26.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma包含氨基酸置换m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、l2c、q3p、q3r、m4e、m4i、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31s、t32a、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
27.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:67具有至少90％序列同一性。
28.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:68具有至少90％序列同一性。
29.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:69具有至少90％序列同一性。
30.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:49具有至少90％序列同一性。
31.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma与seq id no:74具有至少90％序列同一性。
32.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma具有seq id no:67的氨基酸序列。
33.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma具有seq id no:68的氨基酸序列。
34.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma具有seq id no:69的氨基酸序列。
35.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma具有seq id no:49的氨基酸序列。
36.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma具有seq id no:74的氨基酸序列。
37.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma展现出相比于seq id no:1而言增强的对于增殖诱导配体(a proliferation inducing ligand；april)或tnf家族的b-细胞激活因子(b-cell activating factor of the tnf family；baff)的结合亲和力。
38.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april和baff的结合亲和力。
39.在一个进一步的方面，本发明提供了核酸，其编码在本文中所描述的所述变体sbcma。
40.在一个另外的方面，本发明提供了表达载体，其包含在本文中所描述的核酸。
41.在一个进一步的方面，本发明提供了宿主细胞，其包含在本文中所描述的核酸或表达载体。
42.在一个另外的方面，本发明提供了制备变体sbcma蛋白的方法，其包括：a)在其中所述fc融合蛋白被表达的条件下培养在本文中所描述的宿主细胞；和b)回收所述变体sbcma蛋白。
43.在一个进一步的方面，本发明提供了组合物，其包含sbcma变体-fc融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)变体sbcma结构域，其相比于seq id no:1而言包含至少一个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换在从由下列各项组成的组中选择的位置编号处：1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、16、19、20、22、23、25、26、29、31、32、35、36、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54，其中所述编号是按照eu索引的；b)任选的连接体；和c)fc结构域。
44.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：a)所述变体sbcma结构域；b)所述任选的连接体；和c)所述fc结构
域。
45.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：a)所述fc结构域；b)所述任选的连接体；和c)所述变体sbcma结构域。
46.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
47.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换出现在所述位置中的一个，所述位置中的两个，所述位置中的三个，所述位置中的四个，所述位置中的五个，所述位置中的六个，所述位置中的七个，所述位置中的八个，或所述位置中的九个处。
48.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36a、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
49.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：m1v、l2s、q3p、m4t、s9p、n11d、s16g、h19y、n31s、n31d、t32i、t36a、r39h、n47s、k50e和n53e。
50.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：s16g、h19y和t36a。
51.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述氨基酸置换选自由下列各项组成的组：l2s/s9p/e12k/n31d/t36a/n42s/n53s、m1v/t32p/t36a/t46i/n53d/a54v、q3r/s16n/t36a/a43t、f14l/s16g/t36a/v45a/n47d、m1t/m4v/s9f/s16g/t32a/q38r、m1a/s9a/q38r、g6e/q25r/q38r、m1v/m4i/g6e/s9p/n11d/v49m/t52m/a54v、n11d/s16g/n31s、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、g6e/q7r/h19y/l35s、h19y/n42d/s48p/t52a、m1v/n31d/t32i/t36a、m1v/a5t/h19l/t36a、m1t/n31d/t32a/t36a/q38r/s44d/v49a/k50e、m1v/t36a/q38r/a43v、m1v/l2s/s9p/q10h/t36a/q38r/k50g、t36a/q38r/n53s、m1t/l2s/l35p/t36a/q38r/t46a/k50r、a5t/a20v/t36a/q38r、m1t/s16g/i22v/t36a/s44g/t46a/v49a、s16g/t36a、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、m1c/l2c/q3r/m4e/n11d/s16g/t36p、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、n11d/n31d/t32i/t36a/s44n/n47d/n53d、m1r/l2c/q3r、h19y/t36a/s44g、h19y/t32i/t36a/v49a、h19y/n31s/t36a/v45a、h19y/n31s/t36a、h19y/t36p/t52a、h19y/n31d/t52m、m1v/h19y/v45m、s16g/h19y/n47d、s16g/h19y/k50t、s16g/h19y/s44n/k50r、n11d/h19y/s48t、s9p/n11d/s16r/t32a/q38r/s44g/t46i/t52a/n53d/a54t、n11d/s16g/s44r、h19l/t32a/s44g/g51e/t52a、s16n/h19y/t36a/k50r、m1v/h19y/t36a/r39h/t46a、m1v/h19y/t36a、h19y/t36a/n42d/n47s/s48p、m1v/h19y/t36a/s44g/n47d、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、h19y/l35p/t36a/n42d/t46i/v49a、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、m1t/
h19y/t36a、m1v/s16n/h19y/i22m/t36a、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、m1v/s9p/q10p/s16g/h19y/l26f/t36a/a43v/n53d、s16g/h19y/t36a/v49a/n53d、s16g/t36a/a43t/s44g/v45m、m4v/s9p/s16g/t36a/q38r、s9p/n11s/s16g/t36a/q38r、n11d/e12k/s16r/t36a/t52m、m4v/t32i/t36a/q38r/a43t/v45a/s48p、s9p/n11d/s16g/q25r、m1t/a5t/s9p/s16g/q25r/n31d/v49m、l2s/s9p/s16g/a20t/t32i/q38r/n42d/t46a/s48l、s16g/q25r/t46a、g6e/s9a/s16g/q25r/n31d/n47s/t52m、h19y/q38r/t52m、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、s16g/h19y/t36a、s16g/h19y/t36a/n53d、s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/n11d/t36a、m1v/l2s/m4t/h19y/t36i/v45a/v49m、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/s9p/q10r/h19y/t36a/t46a/n47s、m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a、m1v/m4t/t36a/q38r/n53k、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、m1t/n31d/t32a/t36a/a38r/s44d/v49a/k50e、m1t/s9p/p23s/q38r/n42s/s48p/v49a/a54v、h19y/t36a/s44g、h19y/t36a和m4t/t36a/q38r/n42s/s44g/t46a/n47k/s48p/t52a。
52.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
53.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
54.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域包含氨基酸置换s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
55.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域包含氨基酸置换q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e，和至少一个从由
下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
56.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域包含氨基酸置换m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、l2c、q3p、q3r、m4e、m4i、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31s、t32a、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
57.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:67具有至少90％序列同一性。
58.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:68具有至少90％序列同一性。
59.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:69具有至少90％序列同一性。
60.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:49具有至少90％序列同一性。
61.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域与seq id no:74具有至少90％序列同一性。
62.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域具有seq id no:67的氨基酸序列。
63.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域具有seq id no:68的氨基酸序列。
64.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域具有seq id no:69的氨基酸序列。
65.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域具有seq id no:49的氨基酸序列。
66.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域具有seq id no:74的氨基酸序列。
67.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april或baff的结合亲和力。
68.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april和baff的结合亲和力。
69.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述fc结构
域为人igg fc结构域或变体人igg fc结构域。
70.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述人igg fc结构域包含人igg1的铰链-ch2-ch3。
71.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述fc结构域为变体人igg fc结构域。
72.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述连接体为iegrmd(seq id no:87)。
73.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述连接体选自由下列各项组成的组：(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和(gggs)n，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组。
74.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述连接体为ggggs(seq id no:88)。
75.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:80的氨基酸序列。
76.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:81的氨基酸序列。
77.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:82的氨基酸序列。
78.在一个进一步的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:83的氨基酸序列。
79.在一个另外的方面，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:84的氨基酸序列。
80.在一个另外的方面，本发明提供了核酸，其编码在本文中所描述的所述融合蛋白。
81.在一个进一步的方面，本发明提供了表达载体，其包含在本文中所描述的所述核酸。
82.在一个另外的方面，本发明提供了宿主细胞，其包含在本文中所描述的所述核酸或者在本文中所描述的所述表达载体。
83.在一个进一步的方面，本发明提供了制备sbcma变体-fc融合蛋白的方法，其包括：a)在其中所述融合蛋白被表达的条件下培养在本文中所描述的所述宿主细胞；和b)回收所述融合蛋白。
84.在一个另外的方面，本发明提供了在受试者中治疗、减少或预防表达april的肿瘤的转移或侵入的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
85.在一个进一步的方面，本发明提供了在具有表达april的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
86.在一个另外的方面，本发明提供了在受试者中抑制b-细胞生长、免疫球蛋白产生
或者两者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白，其中所述变体sbcma结构域与baff相结合。
87.在一个进一步的方面，本发明提供了在受试者中治疗自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病表达至少一种从由bcma、baffr、taci和其他通过与baff相结合而被激活的受体组成的组中选择的受体，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。
88.在一个另外的方面，本发明提供了在受试者中治疗表达baff和/或april的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。
89.在一个另外的方面，本发明提供了在受试者中治疗表达bcma、baffr和/或taci的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。
90.在一个进一步的方面，本发明提供了在受试者中治疗表达baff和/或april的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所描述的所述融合蛋白。
91.iv.附图简述
92.图1显示了wt-bcma与april的结合动力学。关于wt-bcma与april相结合的结合测定法显示出32pm的kd。
93.图2显示了关于bcma酵母展示文库的各种分选条件和门。
94.图3a-3d显示了sbcma变体克隆的序列，相比于在seq id no:1中所示的野生型人bcma的细胞外结构域的序列而言。图3a显示了s3克隆#1-12的序列。图3b显示了s4克隆#13-41的序列。图3c显示了s5克隆#42-74的序列。图3d显示了s6克隆#75-118的序列。
95.图4显示了各种sbcma变体克隆与april的结合曲线。
96.图5显示了各种sbcma变体克隆与baff的结合曲线。
97.图6显示了在seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83和seq id no:84中所示的sbcma变体-fc融合蛋白的氨基酸序列。变体sbcma结构域加有下划线，连接体结构域是粗体的，并且人igg1 fc结构域是斜体的。
98.图7显示了野生型人bcma的细胞外结构域(seq id no:1)、april的细胞外结构域(seq id no:85)、baff的细胞外结构域(seq id no:86)、连接体结构域(seq id no:87)和另一个连接体结构域(seq id no:88)的氨基酸序列。
99.图8a和8b显示了在基于mm1.r多发性骨髓瘤小鼠模型的肿瘤效力研究中的肿瘤生长曲线和终末肿瘤重量(实施例5)。图8a显示了用1mg/kg和10mg/kg的sbcma变体-fc融合蛋白或者1mg/kg和10mg/kg的野生型sbcma fc进行治疗的mm1.r多发性骨髓瘤小鼠模型的肿瘤生长曲线。图8b显示了在治疗组中的每一个之中的终末肿瘤重量。
100.v.发明详述
101.为了更清楚和简明地指出所要求保护的发明的主题，为在下面所写的描述和所附的权利要求书中所使用的特定术语提供下面的定义。
102.a.引言
103.本发明旨在包含氨基酸修饰的人bcma的可溶形式(例如变体sbcma蛋白)的用途。
这些变体sbcma蛋白以比野生型人bcma更紧密的亲和力与bcma配体(人baff和/或人april)之一或两者相结合。april和baff可以与受体(例如bcma、baffr和taci)相结合，并且因此中和april和/或baff可以用于治疗由于改变的通过bcma、baffr和/或taci的信号传导途径而引起的疾病。这些疾病包括癌症、自身免疫疾病和纤维变性。中和单独的april在治疗表达高水平的bcma和taci或其他通过与april相结合而被激活的受体的癌症、自身免疫疾病和纤维变性中可以是有效的。中和单独的baff在治疗表达bcma、baffr和taci或其他通过与baff相结合而被激活的受体的b细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病中可以是有效的。因此，在本文中所描述的变体sbcma可以用于治疗表达bcma、baffr、taci和/或任何其他通过与april和/或baff相结合而被激活的受体的癌症、免疫调节病症和/或纤维变性疾病，这通过更紧密地和因此优先地与所述配体(例如april和/或baff)相结合并且因此改变否则将会在处于细胞表面上的bcma、baffr和/或taci与april或baff之间出现的正常受体信号传导。
104.另外，在一些实施方案中，由于所述sbcma变体是通常被从血流中快速清除的小蛋白质，因而本发明提供了将所述sbcma变体连接至人或变体fc结构域的融合蛋白，如在本文中所讨论的。由于fc结构域通过与fcrn受体相结合而赋予延长的血清半寿期，因而sbcma变体-fc结构域融合蛋白的创建导致经改善的疗法。因此，本发明提供了sbcma结构域-fc结构域融合蛋白，其在本文中有时被称为“融合蛋白”。在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体或融合蛋白的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april的结合亲和力。在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体或融合蛋白的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于baff的结合亲和力。在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体或融合蛋白的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april和baff的结合亲和力。
105.b.定义
106.如在本文中所使用的，下面的术语具有归属于它们的含义，除非另有说明。
107.如在本文中所使用的，术语“a”、“an”或“the”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有多于一个成员的方面。例如，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“试剂”包括对于一种或多种本领域技术人员已知的试剂的提及，等等。
108.如在本文中所使用的，本文中的“蛋白质”意指至少两个经共价附接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。
109.术语“分离的”是指实质上摆脱了其天然环境并且没有其他蛋白质的分子。例如，分离的蛋白质实质上没有来自它所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其他蛋白质。术语“分离的”也指这样的制备物，其中分离的蛋白质足够纯以被作为药学组合物进行施用，或者是至少大约70-80％、80-90％或90-95％(w/w)纯的，或至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯的。特别地，优选的是，所述多肽以“基本上纯的形式”，即所述多肽制备物基本上没有它与之天然相缔合的其他多肽材料。这可以例如通过借助于众所周知的重组方法制备多肽或者通过传统的纯化方法来完成。
110.术语b-细胞成熟抗原“bcma”是指在下列文献中所描述的用于b细胞成熟的蛋白质：gras等人,international immunology,1995,7:1093；y.laabi等人,embo j.,1992,11:3897。bcma是tnf受体超家族的成员。例如，bcma是关于april和baff的受体。在图7和表3中
显示了野生型人bcma的细胞外结构域的氨基酸序列(seq id no:1)。
111.术语“配体”是指这样的生物分子，其能够与在靶细胞的表面上存在的第二生物分子例如受体相结合并且形成复合物以服务于生物学目的。配体通常是与靶蛋白质上的位点相结合的效应分子，例如通过分子间力例如离子键、氢键、疏水相互作用、偶极-偶极键或范德华力。在本发明中，april和baff是配体蛋白质。
112.术语“受体”是指在靶细胞的表面上存在的生物分子，其能够与第二生物分子例如配体相结合并且形成复合物。受体通常激活特异性的信号转导途径。例如，bcma是关于april和baff(tnf家族的成员)的受体。
113.如在本文中所使用的，“位置”意指在蛋白质的序列中的定位。在本发明的一些实施方案中，位置以成熟蛋白质的第一个氨基酸开始顺次编号，例如对于在图3中所显示的人bcma蛋白。在一些情况下，例如对于在本文中所描述的融合蛋白的fc结构域部分，所述fc结构域位置可以顺次地或者按照已建立的格式例如eu索引进行编号。eu索引或者如在kabat或eu编号方案中的eu索引是指eu编号(参见sequences of immunological interest,第5版,nih出版物,no.91-3242,e.a.kabat等人，其通过提及而整个合并；和也可参见edelman等人,1969,proc natl acad sci usa 63:78-85，其特此通过提及而整个合并)。
114.本文中的“氨基酸修饰”或“氨基酸序列修饰”意指多肽序列中的氨基酸置换、插入和/或缺失。
115.如在本文中所使用的，“亲本蛋白质”意指随后被修饰以生成变体的起始蛋白质。亲本蛋白质可以是天然出现的蛋白质，或者天然出现的蛋白质的变体或经改造的版本。亲本蛋白质可以是指蛋白质本身，包含所述亲本蛋白质的组合物，或者编码它的氨基酸序列。在该情景下，“亲本fc结构域”将会是相对于所记述的变体而言的；因此，“变体人igg fc结构域”是与人igg的亲本fc结构域相比较的，例如“变体人igg1 fc结构域”是与人igg1的亲本fc结构域相比较的，等等。
116.本文中的“野生型”或“wt”意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。wt蛋白质具有未被有意地修饰成非天然出现的序列的氨基酸序列或核苷酸序列。
117.如在本文中所使用的，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指具有由于至少一个氨基酸序列修饰而与亲本蛋白质的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质。例如，如在本文中所使用的，“变体sbcma”或“sbcma变体”意指具有由于至少一个氨基酸序列修饰而与亲本sbcma蛋白的氨基酸序列不同，然而仍然保持与关联配体相结合的能力的氨基酸序列的蛋白质，如下面所概括的。在一些实施方案中，所述亲本蛋白质为人野生型序列。在一些实施方案中，所述亲本蛋白质为具有变体的人序列。蛋白质变体可以是指蛋白质本身，包含所述蛋白质的组合物，或者编码它的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白质变体在一个位置、两个位置、三个位置、四个位置、五个位置、六个位置、七个位置、八个位置、九个位置或十个位置处具有氨基酸置换。本文中的蛋白质变体序列将会与亲本蛋白质序列具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性，和优选地至少大约85％、86％、88％、90％、93％或95％序列同一性。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的亲缘关系由参数“序列同一性”或“同一性”来描述。将本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和在权利要求书中所提及的亲本氨基酸序列(例如，seq id no:1)之间
的同一性程度计算为在两个序列的比对中精确匹配的数目除以“发明序列”的长度或亲本氨基酸序列的长度(两者中最短的)。将结果表示为同一性百分比，如下面所计算的。
118.对于本发明的目的，将在seq id no:1中所示的sbcma的细胞外结构域用作亲本蛋白质以确定在本发明的sbcma变体中的相应的氨基酸序列修饰。将sbcma变体蛋白质的氨基酸序列与seq id no:1的氨基酸序列进行比对，并且基于所述比对来确定相应于在seq id no:1中所公开的任何氨基酸残基的氨基酸位置数目，其中使用在emboss软件包(emboss:the european molecular biology open software suite,rice等人,2000,trends genet.16:276-277)(优选地，5.0.0或更近版本)的needle程序中所执行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)。所使用的参数为10的缺口打开罚分，0.5的缺口延伸罚分，和eblosum62(blosum62的emboss版本)置换矩阵。将经needle标记的“最长同一性”(使用-nobrief选项而获得的)的输出用作同一性百分比，并且如下进行计算：
119.(相同的残基x 100)/(比对的长度
–
比对中缺口的总数目)。
120.在另一个sbcma变体中的相应氨基酸残基的鉴定可以通过多个多肽序列的比对来确定，其中使用几个计算机程序，包括但不限于muscle(通过对数期望值的多序列比较(multiple sequence comparison by log-expectation)；3.5或更近版本；edgar,2004,nucleic acids research 32:1792-1797)，mafft(6.857或更近版本；katoh和kuma,2002,nucleic acids research 30:3059-3066；katoh等人,2005,nucleic acids research 33:511-518；katoh和toh,2007,bioinformatics 23:372-374；katoh等人,2009,methods in molecular biology 537:39-64；katoh和toh,2010,bioinformatics 26:1899-1900)，采用clustalw的emboss emma(1.83或更近版本；thompson等人,1994,nucleic acids research 22:4673-4680)，和采用clustal omega的embl-ebi(sievers和higgins,2014,methods mol biol.2014,1079:105
–
16)，其中使用它们各自的默认参数。
121.当其他变体多肽已偏离野生型sbcma以致于传统的基于序列的比较不能检测它们的关系时(lindahl和elofsson,2000,j.mol.biol.295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。更大的在基于序列的搜索中的灵敏度可以通过使用搜索程序来达到，所述搜索程序利用多肽家族的概率表示(特性谱(profiles))以搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程生成特性谱并且能够检测偏远的同源物(atschul等人,1997,nucleic acids res.25:3389-3402)。如果关于多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，那么可以取得更加大的灵敏度。程序例如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics 19:874-881)利用来自各种各样的来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对特性谱和溶剂化潜力)的信息作为向神经网络的输入，所述神经网络对于查询序列预测结构折叠。类似地，可以使用gough等人,2000,j.mol.biol.313:903-919的方法来将具有未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型进行比对。而这些比对可以用于生成对于所述多肽的同源性模型，并且可以使用各种各样的为该目的而开发的工具来就准确性评估此类模型。
122.对于具有已知结构的蛋白质，几个工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，scop蛋白质超家族已进行了结构比对，并且那些比对是可获取的和可下载的。可以通过使用各种各样的算法例如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins 33:88-96)或组合扩
展(shindyalov和bourne,1998,protein engineering 11:739-747)来比对两个或更多个蛋白质结构，并且另外还可以利用这些算法的执行来查询具有目的结构的结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics 16:566-567)。
123.在描述本发明的变体中，为了便于提及，调整下面所描述的命名法。采用按标准接受的iupac单字母或三字母氨基酸缩写。
124.对于氨基酸置换，在本文中使用下面的命名法：原始氨基酸，位置，所置换的氨基酸。因此，将在位置43处的丙氨酸被置换为缬氨酸命名为“ala43val”或“a43v”。多个突变通过正斜杠标记(“/”)分开，例如“n11d/s16g/n31s”，其分别表示在位置11、16和31处的置换。在表1中显示了关于20种氨基酸中的每一种的名称、3-字母缩写和1-字母缩写。
125.表1.关于20种氨基酸中的每一种的名称、3-字母缩写和1-字母缩写
[0126][0127][0128]
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然出现的基因或者经修饰从而以不会在自然界中存在的方式包含核酸区段或者其是合成的，并且其包含一个或多个控制序列。
[0129]
术语“可操作地连接”是指这样的构造，其中控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列而言合适的位置处，从而所述控制序列指导所述编码序列的表达。
[0130]
如在本文中所使用的，“fc变体”或“变体fc”意指相比于亲本fc结构域而言包含至少一个氨基酸序列修饰的蛋白质。在一些实施方案中，所述亲本fc结构域为人野生型fc序列，例如来自igg1、igg2或igg3的fc区。在一些实施方案中，所述亲本fc结构域为具有变体
的人fc序列。对于所述涉及人igg的fc结构域的在本发明中所讨论的位置，氨基酸位置编号按照eu索引，除非另有说明。所述修饰可以为添加、缺失、置换或其任何组合，如在本文中所概括的。备选地，所述变体fc结构域相比于亲本fc结构域而言可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。另外，如在本文中所讨论的，本文中的变体fc结构域仍然保持与另一个fc结构域形成二聚体以及与fcrn受体相结合的能力，如通过使用在本文中所描述的已知技术(例如，非变性凝胶电泳)所测量的。
[0131]
本文中的术语“可溶性bcma”或“sbcma”意指bcma的可溶性部分，其包含细胞外结构域(ecd)或者其片段或截短版本，而没有bcma的跨膜结构域或胞质(细胞内)结构域的整体。人野生型sbcma的ecd显示为seq id no:1。在一些实施方案中，所述亲本野生型sbcma结构域可以具有n-末端和/或c-末端截短，只要经截短的野生型sbcma保持生物学活性，例如与april和/或baff相结合，如下面所讨论的。
[0132]
术语“sbcma变体”或“sbcma”是指由于至少一个氨基酸序列修饰而引起的亲本sbcma蛋白的变体。在一些实施方案中，所述亲本蛋白质为人野生型sbcma。在一些实施方案中，所述sbcma变体保持与tgf家族成员(例如april和/或baff)的特异性结合，但是具有氨基酸序列修饰例如氨基酸置换，并且相比于野生型sbcma而言可以具有n-末端或c-末端截短。在这种情况下，特异性结合通过任何合适的结合测定法来测定，例如elisa、biacore、sapidyne kinexa或流式细胞术结合分析，所述测定法也可以用于测定结合亲和力，如在下面所概括的。如在本文中所讨论的，在一些情况下，sbcma变体可以具有相比于野生型sbcma而言增加的对于tgf家族成员(例如，april和/或baff)的结合亲和力。
[0133]
术语“结合亲和力”是指配体或其变体与蛋白质(例如，受体或其变体)形成配位键的能力。配体和蛋白质之间的结合亲和力可以由平衡解离常数(kd)(即，配体和蛋白质(例如，受体或其变体)之间的koff/kon之比)来表示。kd和结合亲和力反相关。例如，kd值涉及对于与tgf家族成员相结合来说需要的sbcma变体的浓度，并且较低的kd值(较低的sbcma变体浓度)相应于较高的对于tgf家族成员的结合亲和力。高的结合亲和力相应于配体和蛋白质之间的较大的分子间力。低的结合亲和力相应于配体和蛋白质之间的较低的分子间力。在一些情况下，配体结合亲和力的增加可以表示为离解速率(off-rate)的降低，例如至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或更多。
[0134]“特异性结合”或“与...特异性地结合”或“特异于”特定配体或其变体，意指这样的结合，其可测量地不同于非特异性相互作用。特异性结合可以例如通过测定一种分子的结合(相比于对照分子的结合而言)来测量，所述对照分子通常为不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶标相似。在一些实施方案中，结合亲和力通过使用在上面所讨论的本领域技术人员将会理解的任何合适的测定法(例如，标准biacore测定法)来测量。
[0135]
对于特定配体或其变体的特异性结合可以例如通过具有下述的对于另一个配体蛋白质的kd的蛋白质来展现：至少大约10-4
m，至少大约10-5
m，至少大约10-6
m，至少大约10-7
m，至少大约10-8
m，至少大约10-9
m，备选地至少大约10-10
m，至少大约10-11
m，至少大约10-12
m，至少大约10-15
m，或更大，其中kd是指特定的蛋白质-配体相互作用的解离速率。在一些实施
方案中，本发明的变体sbcma以相比于对照分子而言为1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、200、500、1000、5,000、10,000或更多倍的结合亲和力结合配体。
[0136]
如在本文中所使用的，“残基”意指在蛋白质中的位置和其所关联的氨基酸身份。例如，天冬酰胺297(也称为asn297或n297)为在人抗体igg1中的位置297处的残基。
[0137]
本文中的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔韧的多肽。在结构上，igg ch1结构域在eu位置215处结束，和igg ch2结构域在残基eu位置231处开始。因此，对于igg，抗体铰链在此被定义为包括位置216(在igg1中e216)至230(在igg1中p230)，其中所述编号是按照eu索引的，如在kabat中。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的n-末端和c-末端之一或两者处包含较少的氨基酸。如在本文中所概括的，在一些情况下，使用包括铰链在内的fc结构域，所述铰链通常被用作柔韧的连接体。(另外，如在本文中进一步描述的，可以与或不与所述铰链一起使用另外的柔韧的连接体组分)。
[0138]
如在本文中所使用的，“fc”或“fc区”或“fc结构域”意指包含igg分子的ch2-ch3结构域和在有些情况下包括铰链的多肽。在关于人igg1的eu编号中，所述ch2-ch3结构域包含氨基酸231至447，并且所述铰链为216至230。因此，“fc结构域”的定义包括氨基酸231-447(ch2-ch3)或216-447(铰链-ch2-ch3)或者其片段两者。因此，fc是指iga、igd和igg的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，ige和igm的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和在一些情况下包括相对于这些结构域而言n-末端的柔韧的铰链。对于iga和igm，fc可以包括j链。对于igg，所述fc结构域包含免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3，并且在一些情况下，包括在cγ1和cγ2之间的较低铰链区。在该情景下，“fc片段”可以包含较少的来自n-末端和c-末端之一或两者的氨基酸，但仍然保持与另一个fc结构域或fc片段形成二聚体的能力，如可以通过使用标准方法，通常基于大小(例如，非变性色谱法、大小排阻色谱法等)所检测的那样。人igg fc结构域在本发明中具有特别的用途，并且可以是来自人igg1、igg2或igg3的fc结构域。通常，igg1和igg2比igg3更经常被使用。在一些实施方案中，对fc区进行氨基酸序列修饰，例如以改变与一种或多种fcγr受体或与fcrn受体的结合，和/或增加体内半寿期。
[0139]
如在本文中所使用的，“igg亚类修饰”或“同种型修饰”意指这样的氨基酸序列修饰，其将一种igg同种型的一个氨基酸交换为在不同的对齐的igg同种型中的相应氨基酸。例如，因为在eu位置296处igg1包含酪氨酸并且igg2包含苯丙氨酸，所以在igg2中的f296y置换被视为是igg亚类修饰。类似地，因为igg1在位置241处具有脯氨酸并且igg4具有丝氨酸，所以具有s241p的igg4分子被视为是igg亚类修饰。注意：亚类修饰在本文中被视为氨基酸置换。
[0140]
如在本文中所使用的，“氨基酸”和“氨基酸身份”意指由dna和rna编码的20种天然出现的氨基酸之一。
[0141]
如在本文中所使用的，“效应子功能”意指由于抗体fc区与fc受体或配体的相互作用而产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于：抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。在许多情况下，所希望的是，通过在fc结构域中使用不同的igg同种型(例如，igg4)或氨基酸置换来除去大部分或所有效应子功能；然而，希望保留与fcrn受体的结合，因为这有助于所述融合蛋白在人血清中的半寿期。
[0142]
如在本文中所使用的，“fcrn”或“新生儿fc受体”意指与igg抗体fc区相结合并且至少部分地由fcrn基因所编码的蛋白质。
[0143]
如在本文中所使用的，“靶细胞”意指表达靶多肽或蛋白质的细胞。
[0144]
在本文中，在产生根据本发明的变体sbcma或sbcma变体-fc融合蛋白的情景下的“宿主细胞”意指这样的细胞，其包含编码所述变体sbcma或所述sbcma变体-fc融合蛋白的外源核酸，并且能够在合适的条件下表达这样的变体sbcma或fc融合蛋白。合适的宿主细胞在下面进行描述。
[0145]
本文中的“经改善的活性”或“经改善的功能”意指至少一种生物化学特性的所希望的变化。在该情景下的经改善的功能可以测量为特定活性的增加或减少百分比，或者“倍数”变化，具有所希望的特性的增加(例如，增加的对于april和/或baff的结合亲和力和/或特异性，增加的蛋白质稳定性，增加的体内半寿期，等等)。通常，使用变化百分比来描述小于100％的生物化学活性变化，并且使用倍数变化来描述大于100％的生物化学活性变化(相比于亲本蛋白质而言)。在本发明中，可以实现至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生物化学活性变化(通常，增加)百分比。在本发明中，“倍数增加”(或减少)是相比于亲本蛋白质而言来测量的。在许多实施方案中，所述改善为至少1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍或更高。
[0146]
c.sbcma变体-fc融合蛋白
[0147]
本发明的sbcma变体-fc融合蛋白包括组合物，其包含变体sbcma结构域，fc结构域，和任选地，连接所述变体sbcma结构域与所述fc结构域的连接体。
[0148]
在一些实施方案中，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：
[0149]
a)所述变体sbcma结构域；
[0150]
b)所述任选的连接体；和
[0151]
c)所述fc结构域。
[0152]
在一些实施方案中，本发明提供了在本文中所描述的组合物，其中所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：
[0153]
a)所述fc结构域；
[0154]
b)所述任选的连接体；和
[0155]
c)所述变体sbcma结构域。
[0156]
d.变体sbcma蛋白和结构域
[0157]
本发明提供了变体sbcma蛋白，独立地和作为融合蛋白构建体例如与fc结构域相融合的sbcma结构域。本发明的变体sbcma蛋白包括人bcma的可溶性ecd的至少一部分，通常整个ecd结构域(seq id no:1)(如在图7中所显示的)，具有氨基酸变体。在一些实施方案中，变体sbcma蛋白或sbcma变体展现出相比于野生型sbcma而言增加的对于april和/或baff的结合亲和力和/或特异性，如通过本领域中的和下面所讨论的结合亲和力测定法(例如biacore或octet测定法)来测定的。
[0158]
在一些实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)为拮抗剂，其与april和/或baff相结合以减轻或阻断它们与内源性
bcma、baffr和taci受体的相互作用。作为拮抗剂的变体sbcma蛋白可以用于治疗与经改变的通过bcma、baffr、taci和/或其他通过与april和/或baff相结合而被激活的受体的信号传导途径相关联的状况，特别是肿瘤疗法/化学疗法、免疫调节疾病和/或纤维变性疾病。
[0159]
在一个实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗、减少或预防表达april的肿瘤的转移或侵入的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0160]
在一个实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗、减少或预防表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的转移或侵入的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为b-细胞恶性疾病。在一些实施方案中，在本文中所公开的b-细胞恶性疾病选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤、弥漫型大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、结外边缘区b-细胞淋巴瘤-粘膜相关性淋巴样组织(malt)淋巴瘤、结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、多毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤(眼睛的淋巴瘤)。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0161]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达april的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为b-细胞恶性疾病。在一些实施方案中，在本文中所公开的b-细胞恶性疾病选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤、弥漫型大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、结外边缘区b-细胞淋巴瘤-粘膜相关性淋巴样组织(malt)淋巴瘤、结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、多毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤(眼睛的淋巴瘤)。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0162]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为b-细胞恶性疾病。在一些实施方案中，在本文中所公开的b-细胞恶性疾病选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤、弥漫型大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、结外边缘区b-细胞淋巴瘤-粘膜相关性淋巴样组织(malt)淋巴瘤、结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、多毛细胞白血病、原
发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤(眼睛的淋巴瘤)。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0163]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达april的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0164]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0165]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达april的纤维变性的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0166]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的纤维变性的受试者中抑制april的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0167]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中抑制b-细胞生长、免疫球蛋白产生或两者的方法，其中所述变体sbcma蛋白与baff相结合，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0168]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在具有表达bcma、baffr、taci和/或其他通过与baff相结合而被激活的受体的b细胞增生或自身免疫疾病的受试者中抑制baff的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0169]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗表达至少一种从由bcma、baffr、taci和其他通过与baff相结合而被激活的受体组成的组中选择的受体的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0170]
在一个进一步的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗表达baff和/或april的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0171]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗表达bcma、baffr和/或taci的纤维变性
的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0172]
在一个另外的实施方案中，变体sbcma蛋白(作为分离的蛋白质或者作为本文中的融合蛋白的sbcma结构域)可以用于在受试者中治疗表达baff和/或april的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种在本文中所公开的所述变体sbcma蛋白。
[0173]
在一些实施方案中，变体sbcma蛋白相比于野生型sbcma而言包括氨基酸置换、缺失或插入或者其任何组合，并且相比于野生型sbcma而言增加其与april、baff或两者的结合活性。
[0174]
本公开内容提供了相比于亲本sbcma而言在一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)位置处包含至少一个氨基酸置换的变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，变体sbcma与亲本sbcma具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本sbcma结构域为人野生型sbcma。在一些实施方案中，亲本sbcma结构域具有seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体sbcma与seq id no:1具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，如在本文中所谈及的，变体sbcma可以相比于野生型sbcma而言具有n-末端和/或c-末端截短，只要经截短的变体sbcma保持生物学活性(例如，与april和/或baff的结合)，如通过在本文中所概括的结合测定法之一所测量的。为了清楚起见，本发明的变体bcma相比于seq id no:1而言具有至少一个氨基酸置换并且因此不是seq id no:1。
[0175]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有比野生型sbcma多肽/结构域更强的对于tgf家族成员(即，april和/或baff)的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体sbcma具有为野生型sbcma的至少1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍或更大的对于april和/或baff的结合亲和力。
[0176]
在某些实施方案中，所述变体sbcma对于april和/或baff的结合亲和力相比于野生型sbcma而言增加了至少大约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。在另一些实施方案中，本发明的变体sbcma蛋白对于与april和/或baff的结合具有小于大约1
×
10-8
m、1
×
10-9
m、1
×
10-10
m、1
×
10-12
m或1
×
10-15
m的kd值。在另外一些实施方案中，sbcma变体在与april和/或baff的结合(在体内、在体外或两者)中抑制野生型sbcma或与之竞争。
[0177]
1.特定的变体sbcma蛋白
[0178]
本发明提供了组合物，其包含相比于seq id no:1而言包含至少一个氨基酸置换的变体sbcma，其中所述氨基酸置换在从由下列各项组成的组中选择的位置编号处：1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、16、19、20、22、23、25、26、29、31、32、35、36、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54，其中所述编号是按照eu索引的。
[0179]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
[0180]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置1处的甲硫氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然
出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自m1a、m1c、m1i、m1r、m1t和m1v。
[0181]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置2处的亮氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为l2c或l2s。
[0182]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置3处的谷氨酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为q3p或q3r。
[0183]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置4处的甲硫氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自m4e、m4i、m4t和m4v。
[0184]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置5处的丙氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为a5t。
[0185]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置6处的甘氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为g6e。
[0186]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置7处的谷氨酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨
酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为q7r。
[0187]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置9处的丝氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自s9a、s9f和s9p。
[0188]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置10处的谷氨酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自q10h、q10p和q10r。
[0189]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置11处的天冬酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为n11d或n11s。
[0190]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置12处的谷氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为e12k。
[0191]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置14处的苯丙氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为f14l。
[0192]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置16处的丝氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自s16g、s16n和s16r。
[0193]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置19处的组氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为h19l或h19y。
[0194]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置20处的丙氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为a20v或a20t。
[0195]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置22处的异亮氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为i22m或i22v。
[0196]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置23处的脯氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为p23s。
[0197]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置25处的谷氨酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为q25r。
[0198]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置26处的亮氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为l26f。
[0199]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置29处的丝氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨
酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为s29a。
[0200]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置31处的天冬酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为n31d或n31s。
[0201]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置32处的苏氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自t32a、t32i和t32p。
[0202]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置35处的亮氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为l35s或l35p。
[0203]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置36处的苏氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自t36a、t36i和t36p。
[0204]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置38处的谷氨酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为q38r。
[0205]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置39处的精氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为r39h。
[0206]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置42处的天冬酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自n42d、n42r和n42s。
[0207]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置43处的丙氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为a43t或a43v。
[0208]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置44处的丝氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自s44d、s44g、s44n和s44r。
[0209]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置45处的缬氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为v45a或v45m。
[0210]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置46处的苏氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为t46a或t46i。
[0211]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置47处的天冬酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自n47d、n47k、n47r和n47s。
[0212]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置48处的丝氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自s48l、s48p和s48t。
[0213]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置49处的缬氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为v49a或v49m。
[0214]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置50处的赖氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自k50e、k50g、k50r和k50t。
[0215]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置51处的甘氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为g51e。
[0216]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置52处的苏氨酸的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为t52a或t52m。
[0217]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置53处的天冬酰胺的氨基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换选自n53d、n53k和n53s。
[0218]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含在位置54处的丙氨酸的氨
基酸置换，其中位置编号从成熟区域开始。在一些实施方案中，所述置换是用下述19种天然出现的氨基酸中的任何其他氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，其中一些实施方案不使用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于位阻效应)。在一些实施方案中，所述氨基酸置换为a54v或a54t。
[0219]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36a、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0220]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：m1v、l2s、q3p、m4t、s9p、n11d、s16g、h19y、n31s、n31d、t32i、t36a、r39h、n47s、k50e和n53e。
[0221]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：s16g、h19y和t36a。
[0222]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：l2s/s9p/e12k/n31d/t36a/n42s/n53s、m1v/t32p/t36a/t46i/n53d/a54v、q3r/s16n/t36a/a43t、f14l/s16g/t36a/v45a/n47d、m1t/m4v/s9f/s16g/t32a/q38r、m1a/s9a/q38r、g6e/q25r/q38r、m1v/m4i/g6e/s9p/n11d/v49m/t52m/a54v、n11d/s16g/n31s、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、g6e/q7r/h19y/l35s、h19y/n42d/s48p/t52a、m1v/n31d/t32i/t36a、m1v/a5t/h19l/t36a、m1t/n31d/t32a/t36a/q38r/s44d/v49a/k50e、m1v/t36a/q38r/a43v、m1v/l2s/s9p/q10h/t36a/q38r/k50g、t36a/q38r/n53s、m1t/l2s/l35p/t36a/q38r/t46a/k50r、a5t/a20v/t36a/q38r、m1t/s16g/i22v/t36a/s44g/t46a/v49a、s16g/t36a、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、m1c/l2c/q3r/m4e/n11d/s16g/t36p、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、n11d/n31d/t32i/t36a/s44n/n47d/n53d、m1r/l2c/q3r、h19y/t36a/s44g、h19y/t32i/t36a/v49a、h19y/n31s/t36a/v45a、h19y/n31s/t36a、h19y/t36p/t52a、h19y/n31d/t52m、m1v/h19y/v45m、s16g/h19y/n47d、s16g/h19y/k50t、s16g/h19y/s44n/k50r、n11d/h19y/s48t、s9p/n11d/s16r/t32a/q38r/s44g/t46i/t52a/n53d/a54t、n11d/s16g/s44r、h19l/t32a/s44g/g51e/t52a、s16n/h19y/t36a/k50r、m1v/h19y/t36a/r39h/t46a、m1v/h19y/t36a、h19y/t36a/n42d/n47s/s48p、m1v/h19y/t36a/s44g/n47d、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、h19y/l35p/t36a/n42d/t46i/v49a、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、m1t/h19y/t36a、m1v/s16n/h19y/i22m/t36a、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、m1v/s9p/q10p/s16g/h19y/l26f/t36a/a43v/n53d、s16g/h19y/t36a/v49a/n53d、s16g/t36a/a43t/s44g/v45m、m4v/s9p/s16g/t36a/q38r、s9p/n11s/s16g/t36a/q38r、n11d/e12k/s16r/t36a/t52m、m4v/t32i/t36a/q38r/a43t/v45a/s48p、s9p/n11d/s16g/q25r、m1t/a5t/s9p/s16g/q25r/n31d/v49m、l2s/s9p/s16g/a20t/t32i/q38r/n42d/t46a/s48l、s16g/
q25r/t46a、g6e/s9a/s16g/q25r/n31d/n47s/t52m、h19y/q38r/t52m、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、s16g/h19y/t36a、s16g/h19y/t36a/n53d、s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/n11d/t36a、m1v/l2s/m4t/h19y/t36i/v45a/v49m、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/s9p/q10r/h19y/t36a/t46a/n47s、m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a、m1v/m4t/t36a/q38r/n53k、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、m1t/n31d/t32a/t36a/a38r/s44d/v49a/k50e、m1t/s9p/p23s/q38r/n42s/s48p/v49a/a54v、h19y/t36a/s44g、h19y/t36a和m4t/t36a/q38r/n42s/s44g/t46a/n47k/s48p/t52a。
[0223]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0224]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0225]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含氨基酸置换s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0226]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含氨基酸置换q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0227]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma包含氨基酸置换m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、l2c、q3p、q3r、m4e、m4i、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31s、t32a、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0228]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq id no:67具有至少90％序列同一性。
[0229]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq id no:68具有至少90％序列同一性。
[0230]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq id no:69具有至少90％序列同一性。
[0231]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq idno:49具有至少90％序列同一性。
[0232]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma与seq id no:74具有至少90％序列同一性。
[0233]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有seq id no:67的氨基酸序列。
[0234]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有seq id no:68的氨基酸序列。
[0235]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有seq id no:69的氨基酸序列。
[0236]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有seq id no:49的氨基酸序列。
[0237]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma具有seq id no:74的氨基酸序列。
[0238]
在表2中显示了克隆编号，相比于seq id no:1的氨基酸序列而言的氨基酸置换，和示例性变体sbcma蛋白的所分配的seq id no。
[0239]
表2：克隆编号，相比于seq id no:1的氨基酸序列而言的氨基酸置换，和示例性变体sbcma蛋白/结构域的所分配的seq id no
[0240]
[0241]
[0242][0243]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april或baff的结合亲和力。
[0244]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april和baff的结合亲和力。
[0245]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:80的氨基酸序列。
[0246]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:81的氨基酸序列。
[0247]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:82的氨基酸序列。
[0248]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:83
变体sbcma结构域。
[0257]
在一些实施方案中，本公开内容提供了上面所描述的变体sbcma-fc融合蛋白，其中所述fc结构域不包含铰链结构域并且所述变体sbcma结构域通过在本文中所描述的结构域连接体(例如，非铰链)与所述fc结构域相连接。
[0258]
在一些实施方案中，本公开内容提供了组合物，其包含sbcma变体-fc融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0259]
a)变体sbcma结构域，其相比于seq id no:1而言包含至少一个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换在从由下列各项组成的组中选择的位置编号处：1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、16、19、20、22、23、25、26、29、31、32、35、36、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54，其中所述编号是按照eu索引的；
[0260]
b)任选的连接体；和
[0261]
c)fc结构域。
[0262]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白从n-末端至c-末端包含：
[0263]
a)所述变体sbcma结构域；
[0264]
b)所述任选的连接体；和
[0265]
c)所述fc结构域。
[0266]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白从n-末端至c-末端包含：
[0267]
a)所述fc结构域；
[0268]
b)所述任选的连接体；和
[0269]
c)所述变体sbcma结构域。
[0270]
在一些实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白的变体sbcma结构域用于增加对于april和/或baff的结合亲和力。在各种实施方案中，在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白的(变体)fc结构域增加所述融合蛋白的半寿期。在许多实施方案中，融合蛋白用于治疗肿瘤/癌症、纤维变性和/或免疫调节疾病。
[0271]
所指定的蛋白质/蛋白质结构域的名称和相应的氨基酸序列分别列于表3中。
[0272]
表3.seq id编号、描述和相应的氨基酸序列
[0273][0274]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包括对于seq id no:1的氨基酸序列的置换、缺失或插入或者其任何组合，这(些)相比于野生型sbcma而言增加了其与april、baff或两者的结合活性。
[0275]
本公开内容提供了相比于seq id no:1的氨基酸序列而言在一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)位置处包含至少一个氨基酸置换的变体sbcma结构域。在一些实施方案中，所述变体sbcma结构域与亲本sbcma结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，亲本sbcma结构域具有seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体sbcma结构域与seq id no:1具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性。在一些实施方案中，如在本文中所谈及的，变体sbcma结构域可以相比于野生型sbcma而言具有n-末端和/或c-末端截短，只要经截短的变体sbcma保持生物学活性(例如，与april和/或baff的结合)，如通过在本文中所概括的结合测定法之一所测量的。为了清楚起见，本发明的变体bcma结构域具有至少一个氨基酸置换并且因此不是seq id no:1的氨基酸序列。
[0276]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域在一个位置、两个位置、三个位置、四个位置、五个位置、六个位置、七个位置、八个位置、九个位置或十个位置处具有氨基酸置换。
[0277]
在某些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域对于april和/或baff的亲和力相比于野生型sbcma而言增加了至少大约0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。在另一些实施方案中，本发明的变体bcma结构域具有小于大约1
×
10-8
m、1
×
10-9
m、1
×
10-10
m、1
×
10-12
m或1
×
10-15
m的对于april和/或baff的结合亲和力。在另外一些实施方案中，在本文中所描述的变体bcma结构域抑制野生型sbcma与april和/或baff相结合(在体内、在体外或两者)或与之竞争。
[0278]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域相比于seq id no:1而言包含至少一个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换在从由下列各项组成的组中选择的位置编号处：1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、16、19、20、22、23、25、26、29、31、32、35、36、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54，其中所述编号是按照eu索引的。
[0279]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
[0280]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36a、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0281]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：m1v、l2s、q3p、m4t、s9p、n11d、s16g、h19y、n31s、n31d、t32i、t36a、r39h、n47s、k50e和n53e。
[0282]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：s16g、h19y和t36a。
[0283]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：l2s/s9p/e12k/n31d/t36a/n42s/n53s、m1v/t32p/t36a/t46i/n53d/a54v、q3r/s16n/t36a/a43t、f14l/s16g/t36a/v45a/n47d、m1t/m4v/s9f/s16g/t32a/q38r、m1a/s9a/q38r、g6e/q25r/q38r、m1v/m4i/g6e/s9p/n11d/v49m/t52m/a54v、n11d/s16g/n31s、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、g6e/q7r/h19y/l35s、h19y/n42d/s48p/t52a、m1v/n31d/t32i/t36a、m1v/a5t/h19l/t36a、m1t/n31d/t32a/t36a/q38r/s44d/v49a/k50e、m1v/t36a/q38r/a43v、m1v/l2s/s9p/q10h/t36a/q38r/k50g、t36a/q38r/n53s、m1t/l2s/l35p/t36a/q38r/t46a/k50r、a5t/a20v/t36a/q38r、m1t/s16g/i22v/t36a/s44g/t46a/v49a、s16g/t36a、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、m1c/l2c/q3r/m4e/n11d/s16g/t36p、m1i/n11d/s16g/i22m/s29a/t36a/s44g/k50r、n11d/n31d/t32i/t36a/s44n/n47d/n53d、m1r/l2c/q3r、h19y/t36a/s44g、h19y/t32i/t36a/v49a、h19y/n31s/t36a/v45a、h19y/n31s/t36a、h19y/t36p/t52a、h19y/n31d/t52m、m1v/h19y/v45m、s16g/h19y/n47d、s16g/h19y/k50t、s16g/h19y/s44n/k50r、n11d/h19y/s48t、s9p/n11d/s16r/t32a/q38r/s44g/t46i/t52a/n53d/a54t、n11d/s16g/s44r、h19l/t32a/s44g/g51e/t52a、s16n/h19y/t36a/k50r、m1v/h19y/t36a/r39h/t46a、m1v/h19y/t36a、h19y/t36a/n42d/n47s/s48p、m1v/h19y/t36a/s44g/n47d、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、h19y/l35p/t36a/n42d/t46i/v49a、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/h19y/t36a/n42r/n53s、m1t/h19y/t36a、m1v/s16n/h19y/i22m/t36a、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、m1v/s9p/q10p/s16g/h19y/l26f/t36a/a43v/n53d、s16g/h19y/t36a/v49a/n53d、s16g/t36a/a43t/s44g/v45m、m4v/s9p/s16g/t36a/q38r、s9p/n11s/s16g/t36a/q38r、n11d/e12k/s16r/t36a/t52m、m4v/t32i/t36a/q38r/a43t/v45a/s48p、s9p/n11d/s16g/q25r、m1t/a5t/s9p/s16g/q25r/n31d/v49m、l2s/s9p/s16g/a20t/t32i/q38r/n42d/t46a/s48l、s16g/q25r/t46a、g6e/s9a/s16g/q25r/n31d/n47s/t52m、h19y/q38r/t52m、n11d/h19y/i22m/t32p/n47s/n53s、s16g/h19y/t36a、s16g/h19y/t36a/n53d、s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d、q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/n11d/t36a、m1v/l2s/m4t/h19y/t36i/v45a/v49m、m1v/l2s/m4t/n11d/h19y/t36a、m1v/l2s/m4t/s9p/q10r/h19y/t36a/t46a/n47s、m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a、m1v/m4t/t36a/q38r/n53k、m1t/n11d/h19y/t36a/n42s/v45a/n53s、m1t/n31d/t32a/t36a/a38r/s44d/v49a/k50e、m1t/s9p/p23s/q38r/n42s/s48p/v49a/a54v、h19y/t36a/s44g、h19y/t36a和m4t/t36a/q38r/n42s/s44g/t46a/n47k/s48p/t52a。
[0284]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含氨基酸置换s16g/h19y/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0285]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含氨基酸置换s16g/
h19y/t36a/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0286]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含氨基酸置换s9p/n11d/s16g/h19y/t36a/n47s/n53d，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3p、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、n31s、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0287]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含氨基酸置换q3p/s9p/h19y/n31s/t36a/r39h/n47r/k50e，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、m1v、l2c、l2s、q3r、m4e、m4i、m4t、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16g、s16n、s16r、h19l、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31d、t32a、t32i、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0288]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域包含氨基酸置换m1v/l2s/m4t/s16g/n31d/t32i/t36a，和至少一个从由下列各项组成的组中选择的进一步的氨基酸置换：m1a、m1c、m1i、m1r、m1t、l2c、q3p、q3r、m4e、m4i、m4v、a5t、g6e、q7r、s9a、s9f、s9p、q10h、q10p、q10r、n11d、n11s、e12k、f14l、s16n、s16r、h19l、h19y、a20v、a20t、i22m、i22v、p23s、q25r、l26f、s29a、n31s、t32a、t32p、l35s、l35p、t36i、t36p、q38r、r39h、n42d、n42r、n42s、a43t、a43v、s44d、s44g、s44n、s44r、v45a、v45m、t46a、t46i、n47d、n47k、n47r、n47s、s48l、s48p、s48t、v49a、v49m、k50e、k50g、k50r、k50t、g51e、t52a、t52m、n53d、n53k、n53s、a54v和a54t。
[0289]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:67具有至少90％序列同一性。
[0290]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:68具有至少90％序列同一性。
[0291]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:69具有至少90％序列同一性。
[0292]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:49具有至少90％序列同一性。
[0293]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域与seq id no:74具有至少90％序列同一性。
[0294]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域具有seq id no:67。
[0295]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域具有seq id no:68。
[0296]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域具有seq id no:69。
[0297]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域具有seq id no:49。
[0298]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域具有seq id no:74。
[0299]
在表2中显示了克隆编号，相比于seq id no:1的氨基酸序列而言的氨基酸置换，和示例性变体sbcma结构域的所分配的seq id no。
[0300]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april的结合亲和力。
[0301]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于baff的结合亲和力。
[0302]
在一些实施方案中，在本文中所描述的变体sbcma结构域展现出相比于seq id no:1而言增强的对于april和baff的结合亲和力。
[0303]
4.fc结构域
[0304]
如在本文中所讨论的，除了上面所描述的sbcma变体结构域外，本发明的融合蛋白还包含抗体的fc结构域，所述抗体通常基于igg类，其具有几个亚类，包括但不限于igg1、igg2和igg3。如在本文中所描述的，fc结构域任选地包含igg抗体的铰链结构域。
[0305]
人igg fc结构域在本发明中是特别有用的，并且可以源自来自人igg1、igg2或igg3的fc结构域。通常，igg1和igg2比igg3更经常地被使用。
[0306]
在本发明的融合蛋白中所包括的人igg蛋白的fc结构域可以赋予所述融合蛋白的半寿期的显著增加，并且可以提供额外的与ig分子的结合或相互作用。在一些实施方案中，相比于单体的变体sbcma多肽而言，sbcma变体-fc融合蛋白可以促进纯化、多聚化、结合和中和其他分子。
[0307]
需要时，fc结构域也可以包含fc变体以改变功能。然而，按照许多实施方案，fc变体通常需要保持形成二聚体的能力以及结合fcrn的能力。因此，虽然本文中的实施方案中的许多依赖于人igg1结构域的使用，但是可以制备fc变体以增加或取消在其他igg结构域中的功能。因此，例如，可以使用降低或消除在igg1或igg2中的效应子功能的切除变体，和/或可以使用赋予更紧密的与fcrn受体的结合的fcrn变体，如本领域技术人员将会意识到的。
[0308]
在一些实施方案中，fc结构域为人igg fc结构域或变体人igg fc结构域。
[0309]
在另一个实施方案中，fc结构域为人igg1 fc结构域。
[0310]
在一个进一步的实施方案中，fc结构域包含人igg1的铰链-ch2-ch3。
[0311]
在另一个实施方案中，fc结构域包含人igg1的ch2-ch3。
[0312]
在一些实施方案中，fc结构域可以为来自除了igg1以外的其他igg(例如，人igg2或igg3)的fc结构域。通常，igg2比igg3更经常地被使用。
[0313]
在一个另外的实施方案中，fc结构域为变体人igg fc结构域。然而，本文中的变体fc结构域仍然保持与另一个fc结构域形成二聚体的能力，如通过使用已知方法所测量的，
以及与fcrn相结合的能力，因为这显著地有助于增加本文中的融合蛋白的血清半寿期。
[0314]
所述变体igg fc结构域可以相比于亲本人igg fc结构域而言包括添加、缺失、置换或其任何组合。
[0315]
在一些实施方案中，本发明的变体人igg fc结构域可以与相应的亲本人igg fc结构域具有至少大约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性(通过使用上面所讨论的同一性算法，其中一个实施方案采用本领域中已知的blast算法，使用默认参数)。
[0316]
在一些实施方案中，本发明的变体人igg fc结构域可以相比于亲本人igg fc结构域具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸序列修饰。
[0317]
在一些实施方案中，在本文中所描述的fc结构域为人igg fc结构域或变体人igg fc结构域。
[0318]
在一些实施方案中，在本文中所描述的fc结构域包含人igg1的铰链-ch2-ch3。
[0319]
在一些实施方案中，在本文中所描述的fc结构域为变体人igg fc结构域。
[0320]
5.连接体
[0321]
本发明的融合蛋白可以包含任选的连接体以将所述sbcma结构域联结至所述fc结构域。
[0322]
如在本文中所使用的，“连接体”或“连接体肽”具有足够以这样的方式连接两个分子的长度，即它们相互采取正确的构象，从而它们保持所希望的活性。在一个实施方案中，所述连接体的长度为大约1至20个氨基酸，优选地长度为大约1至10个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为4至10个氨基酸的连接体。有用的连接体包括iegrmd或甘氨酸-丝氨酸多聚物，包括例如(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和(gggs)n(其中n为至少1(通常3至4)的整数)，甘氨酸-丙氨酸多聚物，丙氨酸-丝氨酸多聚物，和其他柔韧的连接体。备选地，各种各样的非蛋白质聚合物(包括但不限于聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)可以用作连接体。
[0323]
在一些实施方案中，所述连接体为“结构域连接体”，其用于将任何两个在本文中所概括的结构域连接在一起，例如将变体sbcma结构域与fc结构域相连接。如上面所讨论的，许多合适的连接体可以用于允许所述两个结构域的重组附接，其中具有对于允许每个结构域保持其生物学功能来说足够的长度和柔韧性。如在本文中所讨论的，特别有用的结构域连接体为与igg1的铰链结构域相连结的iegrmd连接体。
[0324]
在各种实施方案中，两个结构域(例如，所述sbcma变体结构域和所述fc结构域)通常通过使用在本文中所描述的结构域连接体相连接。在许多实施方案中，两个结构域通过使用柔韧的连接体以这样的方式相附接，即所述两个结构域可以独立地起作用。柔韧的连接可以通过使用传统的连接体和/或铰链连接体以各种各样的方式来实现。
[0325]
在一些实施方案中，在本文中所描述的连接体为iegrmd(seq id no:87)。
[0326]
在一些实施方案中，在本文中所描述的连接体为ggggs(seq id no:88)。
[0327]
在一些实施方案中，使用人igg抗体的铰链结构域。在一些情况下，铰链结构域也可以包含氨基酸置换。
[0328]
在一些实施方案中，结构域连接体为铰链结构域和柔韧连接体的组合，例如igg1
铰链与iegrmd连接体。
[0329]
在一个实施方案中，连接体的长度为大约1至50个氨基酸，优选地长度为大约1至30个氨基酸，和更优选地大约4至10个氨基酸。
[0330]
6.本发明的特别的实施方案
[0331]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白展示出与seq id no:80的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0332]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白展示出与seq id no:81的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0333]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白展示出与seq id no:82的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0334]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白展示出与seq id no:83的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0335]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白展示出与seq id no:84的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0336]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:80中所示的氨基酸序列。
[0337]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:81中所示的氨基酸序列。
[0338]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:82中所示的氨基酸序列。
[0339]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:83中所示的氨基酸序列。
[0340]
在一些实施方案中，sbcma变体-fc融合蛋白具有seq id no:84中所示的氨基酸序列。
[0341]
e.核酸
[0342]
本公开内容还提供了组合物，其包含编码变体sbcma和/或sbcma变体-fc融合蛋白的核酸。这样的核酸编码在本文中所记述的变体sbcma和/或sbcma变体-fc融合蛋白中的任一个。
[0343]
核酸可以是经分离的和/或经纯化的。在各种实施方案中，核酸(作为dna或rna)实质上没有其他天然出现的核酸序列。在一些实施方案中，核酸是至少大约50％或至少大约90％纯的。在许多实施方案中，核酸是“重组的”，即其侧翼为一个或多个它通常不与之在天然出现的染色体上相关联的核苷酸。
[0344]
在一些实施方案中，组合物包含编码在本文中所描述的任何变体sbcma的核酸。
[0345]
在一些实施方案中，组合物包含编码在本文中所描述的任何sbcma变体-fc融合蛋白的核酸。
[0346]
在一些实施方案中，核酸编码包括信号序列的bcma变体-fc融合蛋白。如在本领域中已知的，信号序列编码短肽，其当被连接时，指导蛋白质(或肽)通过分泌途径，经常导致该蛋白质从细胞中分泌。如本领域技术人员将会意识到的，可以按照适合于宿主细胞来选择用于表达所述融合蛋白的合适的信号序列。也就是说，当本发明的融合蛋白待在哺乳动
物宿主细胞例如cho细胞中表达时，例如可以使用来自cho细胞的信号肽。
[0347]
在一些实施方案中，组合物包含编码在本文中所描述的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0348]
在一些实施方案中，组合物包含编码展现出与seq id no:80的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0349]
在一些实施方案中，组合物包含编码展现出与seq id no:81的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0350]
在一些实施方案中，组合物包含编码展现出与seq id no:82的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0351]
在一些实施方案中，组合物包含编码展现出与seq id no:83的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0352]
在一些实施方案中，组合物包含编码展现出与seq id no:84的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0353]
在一些实施方案中，组合物包含编码具有seq id no:80的氨基酸序列的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0354]
在一些实施方案中，组合物包含编码具有seq id no:81的氨基酸序列的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0355]
在一些实施方案中，组合物包含编码具有seq id no:82的氨基酸序列的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0356]
在一些实施方案中，组合物包含编码具有seq id no:83的氨基酸序列的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0357]
在一些实施方案中，组合物包含编码具有seq id no:84的氨基酸序列的bcma-fc融合蛋白的核酸。
[0358]
在一些实施方案中，编码bcma变体-fc融合蛋白的核酸包括经密码子优化的版本或变体。
[0359]
在该情景下的“经密码子优化的”是相关于特定的宿主生物和其通常偏爱的氨基酸密码子来进行的；即，宿主生产生物，例如曲霉属(aspergillus)物种，可以通过使用曲霉属偏爱的密码子而产生相比于酵母生产生物而言更高的翻译和/或分泌。
[0360]
密码子优化可以与任一种sbcma(变体)-fc融合蛋白一起进行使用，其可以在所使用的宿主细胞中产生更高的表达。
[0361]
sbcma(变体)-fc融合蛋白通常可以通过编码所述融合蛋白序列的核酸序列来制备，其中使用众所周知的技术，包括亲本基因的位点定向诱变和合成基因重组技术。
[0362]
表达核酸可以由其自身的调控序列或者由本领域中已知的其他调控序列来进行调控。在各种实施方案中，通过掺入特定的调控序列来调控表达以产生所希望的表达效应，如本领域中所理解的。
[0363]
1.调控序列
[0364]
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个调控序列的编码变体sbcma或sbcma变体-fc融合蛋白的多核苷酸，所述调控序列指导所述编码序列在合适的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下进行表达。调控序列可以包括启动子。启动子包含介调蛋白质(例如，在本文中所描述的变体蛋白和融合蛋白)的表达水平的转录控制序
列。启动子可以是任何在宿主细胞中显示出转录活性的多核苷酸，包括突变型的、截短的和杂合的启动子，并且可以获得自对于所述宿主细胞来说同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。
[0365]
f.表达载体
[0366]
本文中还提供了表达载体，用于在体外或在体内表达一种或多种变体sbcma和sbcma变体-fc融合蛋白，组成性地或者在一个或多个调控元件之下。在一些实施方案中，表达载体包含编码变体sbcma或sbcma变体-fc融合蛋白的多核苷酸，启动子，以及转录和翻译终止信号。可以将各种核苷酸和控制序列连结在一起以产生重组表达载体，其可以包含一个或多个方便的限制位点以允许编码所述fc融合蛋白的多核苷酸在此类位点处的插入或替换。备选地，所述多核苷酸可以通过将所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入到合适的用于表达的载体中来进行表达。在创建表达载体之中，所述编码序列位于所述载体中，从而所述编码序列与合适的用于表达的控制序列可操作地相连接。
[0367]
重组表达载体可以是任何可以方便地经历重组dna程序并且可以引起所述多核苷酸表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将会典型地依赖于所述载体与待向其中引入所述载体的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性的或闭合环状的质粒。
[0368]
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的工具。备选地，载体可以是这样的载体，其当被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并且与它已经整合入其中的染色体一起进行复制。进一步地，可以使用单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，其共同包含待被引入到宿主细胞的基因组中的总dna，或者转座子。所考虑的载体包括整合性和非整合性载体两者。
[0369]
g.宿主细胞和生产株
[0370]
如本领域技术人员将会理解的，存在广泛多样的用于重组产生在本文中所描述的变体sbcma蛋白和sbcma变体-fc融合蛋白的生产宿主生物，包括但不限于细菌细胞、哺乳动物细胞和真菌细胞(包括酵母)。
[0371]
可以通过使用各种各样的本领域中可得的技术来将本发明的核酸引入到合适的宿主细胞中，例如转铁蛋白聚阳离子-介导的dna转移、用裸的或经包囊的核酸进行的转染、脂质体-介导的dna转移、包被有dna的胶乳珠粒的细胞内输送、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、基因枪、磷酸钙-介导的转染等。
[0372]
h.制备融合蛋白的方法
[0373]
本发明还涉及制备变体sbcma的方法，其包括：(a)在适合于所述变体sbcma表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)任选地，回收所述变体sbcma。
[0374]
本发明还涉及制备sbcma变体-fc融合蛋白的方法，其包括：(a)在适合于所述sbcma变体-fc融合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)任选地，回收所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0375]
i.治疗方法
[0376]
1.可接受治疗的受试者
[0377]
各种实施方案涉及治疗方法，其中许多包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的一种或多种在本文中所描述的变体sbcma蛋白。
[0378]
各种实施方案涉及治疗方法，其中许多包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的一种或多种在本文中所描述的sbcma变体-fc融合蛋白。
[0379]
在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗一种或多种b-细胞恶性肿瘤的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种b-细胞恶性肿瘤选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤、弥漫型大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、结外边缘区b-细胞淋巴瘤-粘膜相关性淋巴样组织(malt)淋巴瘤、结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、多毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤(眼睛的淋巴瘤)。在一些实施方案中，所述受试者为人受试者。
[0380]
在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗一种或多种b-细胞恶性肿瘤的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种b-细胞恶性肿瘤选自由下列各项组成的组：多发性骨髓瘤、弥漫型大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、结外边缘区b-细胞淋巴瘤-粘膜相关性淋巴样组织(malt)淋巴瘤、结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、多毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤(眼睛的淋巴瘤)。在一些实施方案中，所述受试者为人受试者。
[0381]
许多实施方案涉及在受试者中治疗、减少或预防表达april的肿瘤的转移或侵入的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0382]
许多实施方案涉及在受试者中治疗、减少或预防表达april的肿瘤的转移或侵入的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0383]
许多实施方案涉及在受试者中治疗、减少或预防表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的转移或侵入的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0384]
许多实施方案涉及在受试者中治疗、减少或预防表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的转移或侵入的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本
文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0385]
一些实施方案涉及在具有表达april的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0386]
一些实施方案涉及在具有表达april的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0387]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0388]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的肿瘤的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为上面所公开的b-细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，在本文中所公开的肿瘤为血液学癌症。在一些实施方案中，在本文中所公开的血液学癌症为多发性骨髓瘤。
[0389]
一些实施方案涉及在具有表达april的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0390]
一些实施方案涉及在具有表达april的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0391]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0392]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的自身免疫疾病的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0393]
一些实施方案涉及在具有表达april的纤维变性的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0394]
一些实施方案涉及在具有表达april的纤维变性的受试者中抑制april的活性的
方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0395]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的纤维变性的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0396]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、taci和/或其他通过与april相结合而被激活的受体的纤维变性的受试者中抑制april的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0397]
一些实施方案涉及在受试者中抑制b-细胞生长、免疫球蛋白产生或者两者的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白，并且其中所述变体sbcma蛋白与baff相结合。
[0398]
一些实施方案涉及在受试者中抑制b-细胞生长、免疫球蛋白产生或者两者的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白，并且其中所述sbcma结构域与baff相结合。
[0399]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、baffr、taci和/或其他通过与baff相结合而被激活的受体的b细胞增生或自身免疫疾病的受试者中抑制baff的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0400]
一些实施方案涉及在具有表达bcma、baffr、taci和/或其他通过与baff相结合而被激活的受体的b细胞增生或自身免疫疾病的受试者中抑制baff的活性的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0401]
一些实施方案涉及在受试者中治疗自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病表达至少一种从由bcma、baffr、taci和其他通过与baff相结合而被激活的受体组成的组中选择的受体，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0402]
一些实施方案涉及在受试者中治疗自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病表达至少一种从由bcma、baffr、taci和其他通过与baff相结合而被激活的受体组成的组中选择的受体，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0403]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达baff和/或april的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0404]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达baff和/或april的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0405]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达bcma、baffr和/或taci的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0406]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达bcma、baffr和/或taci的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0407]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达baff和/或april的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述变体sbcma蛋白。
[0408]
一些实施方案涉及在受试者中治疗表达baff和/或april的纤维变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的一种或多种上面所描述的所述sbcma变体-fc融合蛋白。
[0409]
2.治疗性施用
[0410]
在某些实施方案中，可以全身性地或通过本领域中已知的任何其他施用途径向个体施用在治疗上有效的具有一种或多种变体sbcma蛋白的组合物或制剂。
[0411]
在某些实施方案中，可以全身性地或通过本领域中已知的任何其他施用途径向个体施用在治疗上有效的具有一种或多种sbcma变体-fc融合蛋白的组合物或制剂。
[0412]
3.按剂量给药
[0413]
在一些实施方案中，本发明的治疗性实体的有效剂量(例如，用于治疗癌症或免疫调节病症)取决于许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理学状态、患者是人还是动物、其他所施用的药剂和治疗是预防性的还是治疗性的。可以用滴定法测量治疗用量以优化安全性和效力。
vi.实施例
[0414]
a.实施例1：酵母展示的sbcma文库的合成
[0415]
通过使用nhei和bamhi限制位点来将编码人bcma细胞外结构域(氨基酸met1-ala54)的dna克隆到pct酵母展示质粒中。进行序列编号以匹配在sasaki等人中所使用的那种，以促进与用野生型蛋白质的他们的工作的比较。通过使用bcma细胞外结构域dna作为模板来创建易错文库，并且通过使用低保真度taq聚合酶(invitrogen)和核苷酸类似物8-氧代-dgtp和dptp(trilink biotech)来引入突变。进行六个分开的pcr反应，其中改变类似物的浓度和循环的数目以获得一系列的突变频率；五个循环(200μm)、十个循环(2、20或200μm)和20个循环(2或20μm)。在核苷酸类似物不存在下使用正向和反向引物(每个与pct质粒具有50bp同源性)扩增来自这些反应的产物。通过使用凝胶电泳来纯化经扩增的dna，并且用nhei和bamhi消化pct质粒。将经纯化的突变型cdna和经线性化的质粒以5:1的重量比电穿孔到eby100酵母中，在那里它们通过同源重组进行体内装配。通过稀释平板移植估计文库大小为2
×
108。
[0416]
b.实施例2：文库筛选
[0417]
通过使用荧光激活细胞分选术(facs)来从文库中分离展示出高亲和力bcma突变体的酵母。对于第1轮facs，进行平衡结合分选，其中在室温下在具有0.1％ bsa的磷酸盐缓冲盐水(pbsa)中将酵母与2nm april(peprotech)一起温育24小时。在与april一起温育后，使酵母形成粒状沉淀，进行洗涤，并且在4℃下重悬浮于具有抗-c-myc fitc抗体(abcam)和抗-ha af647(invitrogen)的1:100混合物的pbsa中1小时。然后，使用pbsa，对酵母进行洗
涤、形成粒状沉淀和重悬浮，随后为facs分析。
[0418]
对于第2-6轮facs，进行动力学离解速率分选，其中在室温下将酵母与2nm april一起温育3小时，在这之后洗涤细胞两次以去除过量的未结合的april，并且将其重悬浮于包含～50倍摩尔过量bcma的pbsa中以使解开事件是不可逆的。解开步骤的长度如下：分选2)48小时；分选3、4和5)72小时；分选6)84小时，其中所有解开反应都在室温下进行。在解离反应的最后一个小时期间，将细胞与抗-c-myc fitc抗体(abcam)和抗-ha af647(invitrogen)的1:100混合物在4℃下混合1小时。使酵母形成粒状沉淀，进行洗涤，并且重悬浮于0.1％ bsa中。使用vantage se流式细胞仪(stanford facs core facility)和cellquest软件(becton dickinson)通过facs来分选经标记的酵母。如此地进行分选，以致于选择1
–
3％的具有最高“april结合/c-myc表达”比的克隆，从而使该文库富含具有最高的与april的结合亲和力的克隆。在分选1中，筛选了108个细胞，并且随后的轮次分析了最少十倍数目的在先前分选轮次中所收集的克隆数目以确保文库多样性的充分取样。使所选择的克隆进行繁殖并且经历进一步的facs轮次。在分选3、4、5和6后，将质粒dna通过使用zymoprep试剂盒(zymo research corp.)来进行回收，转化到dh5a超感受态细胞中，并且通过使用质粒小量制备试剂盒(qiagen)来进行分离。通过mclab来进行测序。
[0419]
酵母展示的分选产物的分析通过使用对于文库分选所描述的相同的试剂盒和实验方案来进行。在facs calibur(bd biosciences)上分析样品，并且通过使用flowjo软件(treestar inc.)来分析数据。
[0420]
c.实施例3：结合亲和力测定法
[0421]
在标准的组织培养条件下培养细胞。收获细胞并且弃去上清液，然后以3
×
105个细胞/孔分配到染色平板上。将所述平板在4℃下以300g离心5分钟。将各种浓度的sbcma突变体和阴性对照稀释在包含2％ fbs的facs缓冲液中，添加100μl/孔。将细胞在4℃下温育1小时，并且用200μl facs缓冲液洗涤两次，和以300g离心5分钟。在每次洗涤之前和之后，弃去上清液。用具有抗人igg-alexa 488(#a28175，thermofisher，waltham，ma)的1:1000稀释剂以100μl/孔重悬浮细胞。将平板在4℃下温育1小时。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，并且以300g离心5分钟。弃去上清液，并且将细胞重悬浮于100μl冰冷的pbs中。将细胞保持在黑暗中，并且在facs cantoii(bd biosciences，san jose，ca)上进行facs分析。通过使用flowjo软件来测定双重阳性群体的几何均值(结合亲和力的量度)。为了测定结合反应的kd(在平衡时与半数受体位点相结合的配体浓度)，将结合亲和力对配体浓度进行作图，并且在graphpad prism中使用单一位点-特异性结合(one site
–
specific binding)来分析所述图以得到kd值。
[0422]
d.实施例4：结果
[0423]
在图1中显示了wt-bcma与april相结合的结合动力学。关于wt-bcma与april相结合的结合测定法显示出32pm的kd。
[0424]
在图2中显示了关于bcma酵母展示文库的各种分选条件和门。
[0425]
图3显示了对变体sbcma克隆进行测序以确定相比于野生型sbcma而言的突变。
[0426]
在图4中显示了关于各种变体sbcma克隆与april的结合曲线和结合结果。
[0427]
在图5中显示了关于各种变体sbcma克隆与baff的结合曲线和结合结果。
[0428]
e.实施例5：体内肿瘤效力研究
[0429]
分析了以1mg/kg和10mg/kg进行施用的sbcma变体-fc融合蛋白(以下“变体sbcma-fc”)的抗肿瘤活性，并且将其与以1mg/kg和10mg/kg进行施用的野生型sbcma-fc融合蛋白(以下“野生型sbcma-fc”)的抗肿瘤活性进行比较。将mm1.r多发性骨髓瘤细胞皮下注射到nsg免疫受损的小鼠中。用载料对照、1mg/kg变体sbcma-fc、10mg/kg变体sbcma-fc、1mg/kg野生型sbcma-fc和10mg/kg野生型sbcma-fc对动物进行治疗。在整个实验过程中，在对照和处理组之间比较肿瘤生长。在对照和处理组之中比较所收获的mm1.r多发性骨髓瘤肿瘤的最终肿瘤重量。图8显示了肿瘤生长曲线(图8a)和终末肿瘤重量(图8b)的结果。该研究显示了相比于用载料进行治疗的动物而言，在用1mg/kg变体sbcma-fc、10mg/kg变体sbcma-fc和10mg/kg野生型sbcma-fc进行治疗的动物中显著增强的抗肿瘤活性。特别地，用1mg/kg变体sbcma-fc进行治疗的动物显示出相比于用1mg/kg野生型sbcma-fc进行治疗的小鼠而言显著改善的抗肿瘤活性。
[0430]
提供了上面所阐述的实施例以向本领域普通技术人员给出如何实施和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，而并不意欲限制发明人视为其发明之事物的范围。对于本领域技术人员来说明显的对于上面所描述的用于实施本发明的方式的修饰意欲在下面的权利要求书的范围之内。所有在说明书中提及的专利和出版物指明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有在本公开内容中所引用的参考文献均通过提及而以相同程度合并，如同每篇参考文献独个地通过提及而以其整体合并。
[0431]
所有标题和章节名称仅为了清楚和引证目的而使用，而不应被认为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将会意识到根据在本文中所描述的本发明的精神和范围视情况将来自不同标题和章节的各种方面相组合的有用性。
[0432]
所有在本文中所引用的参考文献特此通过提及而以相同程度以其整体和用于所有目的合并入本文，如同每个独个的出版物或者专利或专利申请特别地和独个地被指出通过提及而以其整体合并以用于所有目的。
[0433]
如对于本领域技术人员来说将会是显然的，可以对本技术进行许多修饰和变化，而不背离其精神和范围。在本文中所描述的特定的实施方案和实施例仅作为实例来提供。