可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的重组血球凝集素蛋白及其用途

1.本发明涉及一种可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的重组血球凝集素(hemagglutinin，ha)蛋白及其用途，具体来讲，涉及一种用于生产可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的ha蛋白的重组载体、利用所述重组载体进行转基因的转基因体、利用所述重组载体的可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的ha蛋白的生产方法、利用所述方法生产的可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的ha蛋白以及所述流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗用途。


背景技术：

2.最近，提出了以较低的成本从植物中生产物重组蛋白的可能性，为此人们也在进行各种尝试。尤其是，正在开展用于对各种医用蛋白的生产可能性等进行确认的研究活动。在从植物中生产重组蛋白的情况下具有多种优点，其中之一在于几乎没有如大肠杆菌等可能存在于微生物中的内毒素等毒素存在且没有可能会感染人体的病原体存在。此外，还没有如阮毒素等有害蛋白存在，因此与动物细胞或微生物相比可以生产更加安全的重组蛋白。在制造单价方面与动物细胞相比相当低廉，而且根据培育植物的方法，在大规模生产时与如大肠杆菌等微生物相比更加经济。为了实现如上所述的可能性，需要开发出几种必要的技术。其中最为重要的第一种技术，就是需要开发出可以在植物中诱导基因的高度表达的表达载体。在植物中，可以通过多种方法诱导基因的表达。包括将重组基因融合(integration)到植物的基因组的方法、融合到叶绿体的基因组的方法，利用土壤杆菌(agrobacterium)暂时性地表达基因的方法等多种方法。将重组基因融合到细胞核基因组(nuclear genome)或叶绿体基因组中的方法，通常可以通过确保转基因体的过程在从植物中生产蛋白。与此相反，在通过将土壤杆菌渗透到植物组织中诱导基因的暂时性表达并借此生产蛋白的情况下，因为不包括转基因体的制造过程，因此其蛋白生产周期较短，而且大体上与利用转基因体的蛋白生产相比其蛋白生产水准明显较高的优点。此外，作为对植物所具有的其他基因的表达抑制机制，可以通过对基因沉默抑制因子进行共侵染(co-infiltration)的方式进行抑制，从而将蛋白表达诱导到更高的水准。但是，在每次需要暂时性表达时，都需要执行在分别制备导入了包括目标基因的二元载体的土壤杆菌培养物以及导入了表达p38基因沉默抑制因子的二元载体的土壤杆菌培养物之后将其以适当的比例进行混合并执行共侵染的过程。尤其是，在对两种类型的土壤杆菌进行培养的情况下，在时间以及经济方面会受到限制。
3.流感病毒(influenza virus)是一种传染性极强的病毒，作为属于正粘病毒科(family orthomyxoviridae)的rna病毒，会在呼吸系统中诱发炎症，而且可以通过感染者的咳嗽或唾液直接传播到空气中，还可以通过流感患者的接触物等间接地传染给其他人。潜伏期大约为24～30小时，病毒的血清型分为a型、b型以及c型。其中，b型以及c型只观察到人类感染的情况，而a型观察到人类、马、猪、其他哺乳类以及其他多种类型的家禽和野生鸟
类感染的情况。因此，需要开发出一种可以预防感染如上所述的传染性极强的流感病毒的疫苗。
4.虽然作为疫苗的重组蛋白抗原在生产以及使用方面的稳定性优秀，但是与基于活体病毒的疫苗相比具有免疫原性较低且生产成本通常较高的问题。因此，为了利用所述稳定性优秀的重组蛋白提升作为疫苗的功效，必须开发出一种可以诱导多种免疫反应，而且可以诱导较高的免疫反应的重组蛋白疫苗的递送技术。此外，如果可以同时递送多种类型的抗原而非单一类型的抗原，将会成为更加有效的疫苗。实际上，最近倾向于将多种类型的抗原开发成一个注射剂。为了提升抗原的免疫原性而采用的最有效的方法为使用强效的佐剂(adjuvant)。在佐剂的功效较高的情况下，即使是利用少量的抗原也可以有效地诱导免疫反应并借此降低疫苗的价格，因此对于基于蛋白的疫苗开发来讲，强效佐剂的开发显得非常重要。此外，因为可以根据佐剂的类型诱导不同的免疫反应，因此根据抗原的类型使用适当的佐剂也显得非常重要。目前，已经开发出了如氢氧化铝(alumminium hydroxide)等注射用佐剂并在人体中使用，还作为口服疫苗使用如霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit，ctb)等。作为如家畜等动物用途，已经开发出了更多类型的佐剂使用。而作为试验用途，在小鼠中广泛使用弗氏完全佐剂(freund complete adjuvant)。但是，直至目前为止还并没有明确查明所属物质如何在人类、家畜以及试验动物中提升抗原的免疫原性。
5.目前正在开发多种类型的佐剂，而且因为疫苗的递送方法多种多样，因此根据如上所述的不同的递送方法，需要多种类型的佐剂。最近，正在大量开展将细菌作为口服疫苗递送体以及佐剂使用的研究。尤其是，乳球菌(lactoco ccus)是一种获得美国食药局(food and drug administration，fda)的“一般公认安全(generally recognized as safe，gras)状态”的细菌，认为对人体安全并将其作为口服佐剂以及抗原递送剂进行开发。已经有报告指出，因为细菌自身的抗原性非常高，因此会对细菌所递送的抗原呈现出非常高的免疫反应。
6.血球凝集素(hemagglutinin，ha)的全长(full length)蛋白是一种具有跨膜结构域(transmembrane domain)的膜结合形态(membrane-bound form)，很难在细胞中高水平生产。与此相反，如果排除ha的跨膜结构域(transmemb rane domain)而只表达胞外域(ectodomain)，因为其在细胞中是以可溶性形态(soluble form)形成而可以实现高效生产。但是，如果仅将ha的胞外域制作成可溶性形态，则无法有效地形成当原来的全长ha存在于流感病毒表面时所具有的三聚体形态(trimeric form)。因此，拟开发出一种为了作为疫苗目的使用而从植物中表达以及生产ha的胞外域的重组蛋白时可以诱导其形成三聚体(trimer)的技术。此外，为了使得通过如上所述的方式生产的蛋白具有结合到肽聚糖(peptidoglycan)的能力，从而与可结合到乳球菌或壳聚糖粒子等的表面的基因结合并借此以多种方法对抗原进行递送，研究出了ha胞外域重组蛋白。构建了用于在植物中对通过如上所述的方式制作的ha的重组基因进行高度表达的二元载体(binary vector)。在被流感病毒感染的小鼠中利用所述在植物中高表达的ha重组蛋白进行处理的结果，可以确认其治疗效果，进而在对具有gras状态的乳球菌进行加热并利用三氯乙酸(trichloroacetic acid)进行处理而去除细菌的水溶性蛋白以及核酸之后，通过将已知可以大幅提升所述ha重组蛋白抗原以及免疫反应的ctb涂覆到所述乳球菌死菌体而作为注射用疫苗对感染了流感病毒的小鼠进行处理的结果，可以确认其治疗效果有所提升。进而，在将水溶性h5n6的ha
三聚体或涂覆到乳球菌死菌体表面的h5n6的ha三聚体作为注射用疫苗对感染了流感病毒的鸡进行处理的结果，可以确认其高免疫效果。在将ctb、可溶性h5n6的ha三聚体以及可溶性h9n2的ha三聚体分别涂覆到乳球菌死菌体之后对其进行混合而制造出免疫组合物并对血球凝集进行分析的结果，包括ctb的组的血球凝聚有所提升，可以确认c tb可以提升免疫原性。在将涂覆h5n6的ha三聚体的乳球菌以及涂覆h9n2的ha三聚体的乳球菌以1:1的比例进行混合而制造出疫苗组合物之后，利用所述疫苗组合物对小鼠进行免疫注射的结果，可以确认其免疫原性有所提升。在将h5n6的ha三聚体以及h9n2的ha三聚体以1:1进行混合之后将其涂覆到乳球菌中，并将其制造成疫苗组合物之后对小鼠进行免疫注射的结果，可以确认其免疫原性有所提升。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明旨在解决如上所述的问题，本发明的目的在于提供一种用于生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的重组载体，包括：(i)对缺失源自于流感病毒的ha(hemagglutinin)中的跨膜蛋白部分的蛋白进行编码的基因；以及，(ii)对coronin 1的三聚体基序(trimeric motif)部位的蛋白进行编码的基因。
9.本发明的另一目的在于提供一种用于生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的重组载体，在所述重组载体中追加插入有对lysm结构域的蛋白进行编码的基因。
10.本发明的又一目的在于提供一种包括下述步骤的从植物中生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法：
11.(a)制作所述重组载体的步骤；
12.(b)通过将所述重组载体导入到细胞中而制造转基因体的步骤；
13.(c)对所述转基因体进行培养的步骤；
14.(d)将对所述转基因体进行培养的培养物浸润到植物中的步骤；以及，
15.(e)通过对所述植物进行粉碎而获取可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的步骤。
16.本发明的另一目的在于提供一种通过所述方法生产的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白。
17.本发明的又一目的在于提供一种包括所述可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫苗组合物。
18.本发明的另一目的在于提供一种包括涂覆有所述可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的细菌或壳聚糖的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫苗组合物。
19.本发明的又一目的在于提供一种在所述疫苗组合物中追加包括霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit)的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫苗组合物。
20.本发明的另一目的在于提供一种包括所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫
苗组合物。
21.本发明的又一目的在于提供一种包括利用所述不同形态的疫苗组合物向所需要的个体进行给药的步骤的流感病毒感染疾病的预防或治疗方法。
22.技术方案
23.为了解决如上所述的课题，本发明提供一种用于生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha(hemagglutinin)蛋白的重组载体，包括：(i)对缺失源自于流感病毒的ha中的跨膜蛋白部分的蛋白进行编码的基因；以及，(ii)对coronin 1的三聚体基序(trimeric motif)部位的蛋白进行编码的基因。
24.在本发明的较佳一实施例中，所述流感病毒可以是从由流感a病毒h5n6、h7n9以及h9n2构成的组中选择的某一个以上。
25.在本发明的较佳另一实施例中，所述缺失源自于流感病毒的ha中的跨膜蛋白部分的蛋白可以包括序列编号2的氨基酸序列或序列编号18的氨基酸序列。
26.在本发明的较佳又一实施例中，对所述缺失源自于流感病毒的ha中的跨膜蛋白部分的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号1的碱基序列或序列编号17的碱基序列。
27.在本发明的较佳另一实施例中，所述coronin 1的三聚体基序部位的蛋白可以包括序列编号4的氨基酸序列。
28.在本发明的较佳又一实施例中，对所述coronin 1的三聚体基序部位的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号3的碱基序列。
29.在本发明的较佳另一实施例中，可以向所述重组载体追加插入对lysm结构域的蛋白进行编码的基因。
30.在本发明的较佳又一实施例中，所述lysm结构域的蛋白可以包括序列编号14的碱基序列。
31.在本发明的较佳另一实施例中，对所述lysm结构域的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号13的碱基序列。
32.在本发明的较佳又一实施例中，所述重组载体还可以追加包括从由源自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35s启动子、源自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的19s rna启动子、mac启动子(mac promoter)、植物的肌动蛋白启动子以及泛素蛋白启动子构成的组中选择的某一个启动子。
33.本发明还提供利用所述重组载体进行转基因的转基因体。
34.在本发明的较佳一实施例中，所述转基因体可以是原核生物或真核生物。
35.此外，本发明提供一种包括下述步骤的从植物中生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法以及通过所述方法生产的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白。
36.进而，本发明提供一种包括所述可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫苗组合物。
37.在本发明的较佳一实施例中，所述可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以被涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面。
38.在本发明的较佳另一实施例中，所述在细胞壁中包括肽聚糖的细菌可以是一般公认安全(generally recognized as safe，gras)状态的细菌。
39.在本发明的较佳又一实施例中，所述疫苗组合物还可以追加包括霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit)。
40.在本发明的较佳另一实施例中，所述疫苗组合物可以是注射剂形态。
41.此外，本发明提供一种包括所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防或治疗用疫苗组合物。
42.在本发明的较佳一实施例中，所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以是源自于从由h5n6、h7n9以及h9n2构成的组中选择的某一个以上的流感病毒的ha蛋白。
43.在本发明的较佳另一实施例中，所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以被涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面。
44.在本发明的较佳又一实施例中，所述在细胞壁中包括肽聚糖的细菌可以是一般公认安全(generally recognized as safe，gras)状态的细菌。
45.在本发明的较佳另一实施例中，所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以通过下述(i)至(iii)中的某一个方法涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面：
46.(i)在对所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白进行混合之后，涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面；
47.(ii)在将所述可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白分别涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面之后进行混合；或，
48.(iii)通过所述(i)以及(ii)的两种方法，将不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面。
49.在本发明的较佳又一实施例中，所述疫苗组合物还可以追加包括霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit)。
50.进而，本发明提供一种包括利用所述不同形态的疫苗组合物向所需要的个体进行给药的步骤的流感病毒感染疾病的预防或治疗方法。
51.发明的效果
52.本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白包括缺失源自于高病原性流感a病毒h5n6的ha中的跨膜蛋白的胞外域(ecotodomain)部分的蛋白、小鼠的coronin a的三聚体基序(trimeric motif)以及包括乳酸乳球菌的lysm肽聚糖-结合结构域的蛋白的细胞壁结合结构域即lysm结构域，可以从植物中大量制造，而且可以通过形成三聚体而提升免疫性，还可以通过结合或涂覆到如乳球菌等细菌或壳聚糖粒子中而有效地对抗原进行递送。在被流感病毒感染的小鼠中利用所述在植物中高表达的ha重组蛋白进行处理的结果，呈现出了治疗效果，此外，在将已知可以大幅提升所述ha重组蛋白抗原以及免疫反应的ctb涂覆到以通过对具有gras状态的乳球菌进行加热并利用三氯乙酸(trichloroacetic acid)进行处理而去除细菌的水溶性蛋白以及核酸的方法制造出的死菌体中并作用注射用疫苗对感染了流感病毒的小鼠进行处理的结果，呈现出了优秀的治疗效果。进而，将适用本发明的可溶性h5n6的ha三聚体、可溶性h9n2的ha三聚体或将所述物质涂覆到乳球菌死菌体的表面之后作为注射用疫苗对感染了流感病毒的鸡进行处理的结果，呈现出了高免疫效果。利用在将ctb(cholera toxin b subunit)、水溶性h5n6的ha三聚体以及水溶性h9n2的
ha三聚体分别涂覆到乳球菌死菌体之后对其进行混合而制造出免疫组合物对血球凝集进行分析的结果，包括ctb的组的血球凝聚有所提升，借此可以确认ctb具有提升免疫原性的效果。利用在将涂覆h5n6的ha三聚体的乳球菌死菌体以及涂覆h9n2的ha三聚体的乳球菌死菌体以1:1的比例进行混合而制造出的疫苗组合物对小鼠进行免疫注射的结果，可以确认其免疫原性有所提升。利用在将h5n6的ha三聚体以及h9n2的ha三聚体以1:1进行混合之后将其涂覆到乳球菌死菌体中而制造出的疫苗组合物对小鼠进行免疫注射的结果，同样可以确认其免疫原性有所提升。因此，通过将不同的多种类型的抗原分别涂覆到乳球菌死菌体之后进行混合、或在将不同的多种类型的抗原同时混合之后涂覆到乳球菌死菌体、或同时使用所述两种方法，可以同时对多种抗原进行递送并借此有效地提升其免疫原性。
附图说明
53.图1a以及图1b图示了对为了生产适用本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白而使用的重组载体的构成的模式图。
54.图2a图示了通过sds/page对在本式烟草(nicotiana benthamiana)中表达的蛋白进行分离之后利用抗-his抗体执行蛋白质印迹分析的结果。
55.图2b图示了通过sds/page对在本式烟草中表达的蛋白进行分离之后利用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)进行染色的结果。
56.图3a以及图3b图示了利用凝胶过滤(gel filtration)柱层析对mh5n6以及th5n6分别形成单体(monomer)以及三聚体(trimer)进行确认的结果，具体来讲，图3a图示了通过凝胶过滤柱层析进行分馏(fraction)的结果，图3b图示了通过sds/page展开相当于各个峰值的分馏物之后利用抗-his抗体执行蛋白质印迹分析的结果。
57.图3c以及图3d图示了利用凝胶过滤(gel filtration)柱层析对mh9n2以及th9n2分别形成单体(monomer)以及三聚体(trimer)进行确认的结果，具体来讲，图3c图示了通过凝胶过滤柱层析进行分馏(fraction)的结果，图3d图示了通过sds/page展开相当于各个峰值的分馏物之后利用抗-his抗体执行蛋白质印迹分析的结果。
58.图4a以及图4b图示了在lysm与乳酸乳球菌的结合中对基于mcor1的三聚体效果进行确认的结果，具体来讲，图4a图示了在将gfp-lysm以及gfp-mcor-lysm分别结合到乳球菌之后通过sds/page将其展开并执行蛋白质印迹分析以及利用考马斯亮蓝进行染色的结果，图4b图示了在荧光显微镜下对gfp-lysm以及gfp-mcor-lysm分别结合到利用tca进行处理的乳球菌中的程度进行观察的结果。
59.图5图示了将利用从本式烟草(nicotiana benthamiana)的叶片细胞制造的h5n6的ha单体(mh5n6)以及三聚体(th5n6)结合到利用tca进行处理的乳球菌之后通过sds/page展开并利用考马斯亮蓝进行染色的结果。
60.图6a图示了用于对可溶性tha以及涂覆到乳球菌表面的tha在小鼠中的免疫原性反应进行确认的给药时间表。
61.图6b图示了利用elisa对可溶性tha以及涂覆到乳球菌表面的tha在小鼠中的免疫原性反应进行测定的结果。
62.图7a以及图7b图示了可溶性tha以及涂覆到乳球菌表面的tha阻碍血球凝集的程度进行分析的结果。
63.图8a图示了以鸡为对象将pbs、乳球菌死菌体、可溶性h5n6的ha三聚体以及涂覆到乳球菌表面的h5n6的三聚体作为抗原执行抗体诱导试验的结果。
64.图8b图示了以鸡为对象将pbs、乳球菌死菌体、可溶性h9n2的ha三聚体以及涂覆到乳球菌表面的h9n2的三聚体作为抗原执行抗体诱导试验的结果。
65.图9图示了将分别涂覆有ctb(cholera toxin b subunit)、可溶性h5n6的ha三聚体以及可溶性h9n2的ha三聚体的乳球菌进行混合并对其免疫原性进行确认的结果。
66.图10图示了通过利用将涂覆有h5n6的ha三聚体的乳球菌以及涂覆有h9n2的ha三聚体的乳球菌以1:1的比例混合而制造出的疫苗组合物对小鼠进行免疫注射之后，对两种类型的两个抗原的强效免疫原性进行确认的结果。
67.图11图示了通过利用将h5n6的ha三聚体以及h9n2的ha三聚体以1:1的比例混合之后涂覆到乳球菌而制造出的疫苗组合物对小鼠进行免疫注射之后，对两种类型的两个抗原的强效免疫原性进行确认的结果。
具体实施方式
68.接下来，将对本发明进行详细的说明。
69.如上所述，源自于流感病毒的ha(hemagglutinin)的全长(full length)蛋白为具有跨膜结构域(transmembrane domain)的膜结合形态(membrane-bo und form)，很难在细胞中实现高水准的生产。因此，为了提升生产水准，在通过排除ha的跨膜结构域(transmembrane domain)并只表达胞外域(ectodo main)而在细胞中制作成可溶性形态(soluble form)时，可以实现高效率的生产。但是，如果仅将ha的胞外域制作成可溶性形态，则无法有效地形成当原来的全长ha存在于流感病毒表面时所具有的三聚体形态(trimeric form)。因此，本发明人拟开发出一种为了作为免疫原性得到提升的疫苗使用而从植物中表达以及生产ha的胞外域的重组蛋白时可以诱导其形成三聚体(trimer)的技术。此外，为了使得通过如上所述的方式生产的蛋白具有结合到肽聚糖(pepti doglycan)的能力，拟开发出一种可以与可结合到乳球菌或壳聚糖粒子等的表面的基因结合并借此以多种方法对抗原进行递送的ha胞外域重组蛋白。因此，通过设计出只对可以大量生产的源自于流感病毒的ha中除跨膜结构域(trans membrane domain)之外的胞外域进行表达的ha、可形成三聚体结构的小鼠的coronin a的三聚体基序(trimeric motif)以及可以通过结合到乳球菌或壳聚糖粒子等的表面而有效地对抗原进行传递的包括乳酸乳球菌的lysm肽聚糖-结合结构域的蛋白并在一个载体中进行表达，构建了可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白以及可以在植物中对所述蛋白进行大量表达的二元载体(binary vector)。
70.因此，本发明的第一方面涉及一种用于生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha(hemagglutinin)蛋白的重组载体，包括：(i)对缺失源自于流感病毒的ha(hemagglutinin)中的跨膜蛋白部分的蛋白进行编码的基因；以及，(ii)对coronin 1的三聚体基序(trimeric motif)部位的蛋白进行编码的基因。
71.在本发明的重组载体中，所述流感病毒不受限制地包括可以感染人类、狗、猪、马、家禽类、野生鸟类以及海豹等的多种类型的流感病毒，可以包括目前已知的a型、b型、c型流感病毒以及传染性鲑鱼贫血病毒(isavirus)或索戈托病毒(thogotovirus)。
72.a型流感病毒是造成季节性流感以及大流行性流感流行的原因。野生水生鸟类是
大量a型流感的天然宿主。有时，病毒会被传染到其他物种，从而在家禽中导致毁灭性的集体发病，或者导致人类的流感大流行。a型病毒是三种流感类型中最致命的人类病原菌，会诱发各种严重的疾病。a型流感病毒可以根据对这些病毒的抗体反应细分为不同的血清型。在人类中确认到的血清型如下所述(按照已知的人类大流行疾病死亡人数排序)：h1n1(1918年西班牙流感的原因)，h2n2(1957年亚洲流感的原因)，h3n2(1968年香港流感的原因)，h5n1(2007-2008年流感季的大流行威胁)，h7n7(潜在大流行疾病威胁)，h1n2(人类以及猪的地方病)，h9n2，h7n2，h7n3以及h10n7。
73.b型流感病毒是季节性流感的原因，包括一种类型的b型流感病毒。b型流感几乎只会感染人类，而且比a型流感少见。已知容易受到b型流感病毒感染的唯一的其他动物为海豹。因为这种类型的流感的变异速度与a型相比慢2倍至3倍，因此其基因多样性较低，而且只有一种b型流感血清型。因为如上所述的抗原多样性的不足，通常来讲在较小的年龄就可以获得对b型流感的一定程度的免疫力，但是因为b型流感的变异程度而难以实现持续性的免疫。
74.c型流感病毒会感染人类以及猪，而且可以诱发严重的疾病以及局部传染病，但是比其他类型少见，通常来讲会在儿童群体中诱发轻微的疾病。
75.本发明的a型流感病毒可以是例如从由h5n6、h7n9以及h9n2构成的组中选择的某一个，但是并不限定于此。
76.在本发明的具体一实施例中，利用源自于a型流感病毒h5n6以及h9n2的ha蛋白制造出了可形成三聚体的重组ha蛋白。具体来讲，为了提升ha的生产性，分别选择性地使用了只对h5n6或h9n2的ha中除跨膜结构域(tran smembrane domain)之外的胞外域进行编码的氨基酸序列，即包括h5n6的ha(genbank：ajd09950.1)的从第17个至第531个位置的氨基酸残基的氨基酸序列以及包括h9n2的ha(genbank：afm47146.1)的第19个至第524个位置的氨基酸残基的氨基酸序列。适用本发明的重组载体为了制造出可形成三聚体的重组ha蛋白，可以选择性地使用由h5n6的ha(genbank：ajd09950.1)的第17个至第531个位置的氨基酸残基构成的区域的各种氨基酸序列，同理，也可以选择性地使用由h9n2的ha(genbank：afm47147.1)的第19至第524个位置的氨基酸残基构成的区域的各种氨基酸序列。
77.在本发明的重组载体中，所述缺失源自于流感病毒的ha(hemagglutinin)中的跨膜蛋白部分的蛋白可以包括序列编号2的氨基酸序列或序列编号18的氨基酸序列，但是并不限定于此。
78.对所述缺失源自于流感病毒的ha中的跨膜蛋白部分的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号1的碱基序列或序列编号17的碱基序列，具体来讲，所述基因可以包括具有与序列编号1的碱基序列或序列编号17的碱基序列相比的70％以上、较佳地为80％以上、更较佳地为90％以上、最较佳地为95％以上的序列同源性的碱基序列。
79.多核苷酸的“序列同源性％”可以通过对两个最佳排列的序列与比较区域进行比较的方式确认，比较区域中的多核苷酸序列的一部分与两个序列的最佳排列的参考序列(不包括追加或删除)相比，可以包括追加或删除(即间隙)。
80.在本发明的重组载体中，所述coronin 1可以是源自于小鼠的coronin 1(mcor 1)(genbank：edl17419.1)，其三聚体基序(trimeric motif)部位的蛋白可以包括序列编号4的氨基酸序列。在本发明的重组载体中，所述coronin 1(mcor 1)可以连接到源自于流感病
毒的ha的胞外域的c-端，从而即使是在只对ha的胞外域进行表达的情况下也可以形成三聚体。
81.对所述coronin 1(mcor 1)的三聚体基序部位的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号3的碱基序列。具体来讲，所述基因可以包括具有与序列编号3的碱基序列相比的70％以上、较佳地为80％以上、更较佳地为90％以上、最较佳地为95％以上的序列同源性的碱基序列。
82.本发明的重组载体还可以追加包括对lysm结构域的蛋白进行编码的基因。
83.在本发明的重组载体中，所述lysm结构域的蛋白可以包括序列编号14的氨基酸序列，对所述lysm结构域的蛋白进行编码的基因可以包括序列编号13的碱基序列，具体来讲，所述基因可以包括具有与序列编号13的碱基序列相比的70％以上、较佳地为80％以上、更较佳地为90％以上、最较佳地为95％以上的序列同源性的碱基序列。
84.为了在适用本发明的缺失源自于流感病毒的ha中的跨膜蛋白部分的蛋白以及包括coronin 1(mcor 1)的三聚体基序部位的蛋白的重组ha蛋白中提升各种免疫效果并有效地对抗原进行递送，利用具有6个氨基酸残基的连接肽，将可以结合到如乳球菌等细菌或壳聚糖粒子的包括乳酸乳球菌的lysm肽聚糖-结合结构域的蛋白的细胞壁结合结构域即lysm结构域(genbank：wp_011834353)的第220个至第320个氨基酸残基(共计101个氨基酸残基)融合到coronin 1(mcor1)的三聚体基序的c-端。接下来，为了重组蛋白的分离提纯而对具有6个his残基的his标记进行融合，并为了er滞留而对hdel基序进行融合，从而完成了结构tha(图1a)。作为对照组，构建了没有mcor1的三聚体基序的结构mha进行比较(图1b)。
85.将通过如上所述的方式构建的ha的重组基因导入到植物体表达载体即ptex1中，从而制造出植物表达载体(分别为ptex-tha以及ptex-mha)。接下来，在将所制造出的表达载体导入到土壤杆菌(agrobacterium)之后，通过浸润到植物体中而诱导暂时性表达。所表达的重组ha蛋白，可以通过利用his标记的ni
2 -nta亲和柱进行分离，或利用lysm结构域通过与乳球菌的结合进行分离。
86.为了对在导入所述基因的本式烟草(nicotiana benthamiana)的叶片提取物中的蛋白表达进行确认，利用抗-his抗体执行蛋白质印迹分析。如图2a所示，ha-lysm-his-hdel在大约80kda的位置上观察到蛋白。所述结果大于计算上的蛋白位置，估计这是因为ha蛋白的n-糖基化(n-glycosylation)。此外，通过图2b可以确认，tha的结果略大于mha。
87.接下来，为了对所述蛋白的三聚体形成进行确认而将单体形态即mha以及三聚体形态即tha进行混合并执行凝胶过滤。其结果，如图3a所示，出现了两个峰值(peak)，而且利用抗-his抗体对相当于各个峰值的分馏物(fraction)执行蛋白质印迹分析的结果，如图3b所示，在与三聚体对应的峰值观察到tha蛋白，而在与单体对应的峰值观察到mha蛋白。
88.在本发明的具体一实施例中，为了对所述重组蛋白的lysm与乳球菌的结合进行确认，作为对照组蛋白使用gfp制造出his标记(tagging)的gfp-mcor1-lysm(gfp-mcor1-lysm)结构以及his标记的gfp-lysm(gfp-lysm)结构并将其导入到大肠杆菌的表达载体即prset-a中，从而构建出可以在大肠杆菌中进行表达的表达载体。在大肠杆菌中对所述蛋白gfp-mcor1-lysm以及gfp-lysm进行表达、分离以及提纯，接下来在荧光显微镜下对结合到乳球菌的程度进行观察。其结果，如图4所示，可以确认gfp-mcor1-lysm的gfp表达高于gfp-lysm。
89.在本发明的具体另一实施例中，关于通过lysm的ha与乳球菌表面的结合，对通过mcor1的三聚体化(trimerization)效果进行确认。为此，对表达单体形态的mha(mh5n6)以及三聚体形态的tha(th5n6)的本式烟草的叶片组织进行粉碎而获取总提取物，接下来在通过将其与利用tca进行处理的乳球菌混合而结合诱导之后，在其中对乳球菌进行微粒化并回收，然后利用sds/page展开并利用考马斯亮蓝进行染色。其结果，如图5所示，tha(th5n6)会形成三聚体结构的ha，但mha(mh5n6)不会形成三聚体结构的ha，而且伴随着ha量的增加，形成三聚体结构的tha(th5n6)结合到乳球菌中的量也会随之增加，但是mha几乎没有结合到乳球菌中。
90.本发明的重组载体还可以追加包括从由源自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35s启动子、源自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的19s rna启动子、mac启动子(mac promoter)、植物的肌动蛋白启动子以及泛素蛋白启动子构成的组中选择的某一个启动子，较佳地可以包括mac启动子(mac promoter)，更较佳地可以包括mact启动子(mact promoter)，但是并不限定于此。
91.所述mact启动子可以是将mac启动子碱基序列的3'端碱基即a取代成t的启动子，所述mact启动子可以包括序列编号15的碱基序列，具体来讲，所述基因可以包括具有与序列编号15的碱基序列相比的70％以上、较佳地为80％以上、更较佳地为90％以上、最较佳地为95％以上的序列编号同源性的碱基序列。
92.本发明重组载体还可以追加包括rd29b-t终止部位，所述rd29b-t终止部位基因可以包括序列编号16的碱基序列，具体来讲，所述基因可以包括具有与序列编号16的碱基序列相比的70％以上、较佳地为80％以上、更较佳地为90％以上、最较佳地为95％以上的序列同源性的碱基序列。
93.在本发明的重组载体中，可以通过在对重组蛋白进行编码的基因的n-以及c-端分别插入bip(chaperone binding protein)的信号序列(signal sequence)以及内质网滞留信号(er retention signal)即hdel而诱导在er(内质网)中的高浓度滞留。因此，本发明的重组载体还可以追加包括对bip进行编码的基因和/或对hdel(his-asp-glu-leu)肽进行编码的基因，对所述bip进行编码的基因可以包括序列编号9的碱基序列，而hdel(his-asp-glu-leu)可以包括序列编号10的碱基序列。
94.在本发明中，术语“重组”是指细胞对不同的核酸进行复制，或对所述核酸进行表达，或对通过肽、不同的肽或不同的核酸编码的蛋白进行表达的细胞。重组细胞可以以正义或反义形态中的某一个对在所述细胞的天然形态中没有被发现的基因或基因片段进行表达。此外，重组细胞可以对在天然状态的细胞中发现的基因进行表达，但是所述基因是经过修饰的、通过人工方式重新导入到细胞内的基因。
95.术语“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。通常来讲，可以使用可在宿主体内完成复制以及稳定化的任意的质粒以及载体。所述表达载体的重要特性在于，具有复制原点、启动子、标记基因以及翻译调节元素(translation control element)。所述重组表达蛋白以及包括适当的转录/翻译调节信号的表达载体可以通过本行业所公知的方法构建。所述方法包括体外重组dna技术、dna合成技术以及体内重组技术等。
96.作为本发明的重组载体的较佳实例，可以以当存在于适当的宿主时可以将其自身
的一部分即所谓的t-区域转移到植物细胞的ti-质粒载体为例。目前，不同类型的ti-质粒载体用于将杂交dna序列转移到植物细胞或可通过将杂交dna适当地插入到植物的基因组而生成新植物的原生质体。作为ti-质粒载体的极佳形态，可以以在ep 0 120 516 b1以及美国专利第4,940,838号中公开的所谓的二元(binary)载体为例。作为可用于将在本发明中设计的对可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白进行编码的结构导入到植物宿主中的其他适当的载体，可以从源自于如双链植物病毒(例如camv)以及单链病毒、双生病毒等的病毒载体，例如不全植物病毒载体中选择。如上所述的载体的使用，尤其有利于难以适当地对植物宿主进行转基因的情况。
97.本发明的第二方面涉及一种利用所述重组载体进行转基因的转基因体。
98.本发明的转基因体可以是原核生物或真核生物，作为其实例，可以使用如酵母(saccharomyce cerevisiae)、真菌等大肠杆菌、昆虫细胞、人类细胞(例如cho细胞株(chinese hamster ovary)、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、3t3、rin以及mdck细胞株)以及植物细胞等，较佳地可以是土壤杆菌(agrobacterium)。对于昆虫细胞以及人类细胞等，可以使用表达各种类型的细胞所需要的表达载体，表达对可形成三聚体的重组ha蛋白进行编码的基因。
99.作为将本发明的重组载体地送到宿主细胞内的方法，在宿主细胞为原核细胞的情况下，可以通过cacl2法、hanahan法以及电穿孔法等实施。此外，在宿主细胞为真核细胞的情况下，可以通过如显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、deae-葡聚糖处理法以及基因枪轰击法等将载体注入到宿主细胞内。
100.本发明的第三方面涉及一种包括下述步骤的从植物中生产可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法：
101.(a)制作所述重组载体的步骤；
102.(b)通过将所述重组载体导入到细胞中而制造转基因体的步骤；
103.(c)对所述转基因体进行培养的步骤；
104.(d)将对所述转基因体进行培养的培养物浸润到植物中的步骤；以及，
105.(e)通过对所述植物进行粉碎而获取可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha(hemagglutinin)蛋白的步骤。
106.在生产本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法中，因为所述(a)以及(b)如上所述，因此将省略与其相关的详细记载。
107.在生产本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法中，所述步骤(c)可以为了生产本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白而适当地选择使用本发明所公知的任意方法。
108.在生产本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法中，所述步骤(d)可以通过例如化学化学电池法、真空或注射器浸润法以将对转基因体进行培养的培养物浸润到植物中的方式执行，较佳地可以使用注射器浸润法进行浸润，但是并不限定于此。
109.在生产本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的方法中，所述步骤(d)的植物可以从包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、土豆、小麦、红豆、燕麦以及高粱的粮食作物类；包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、香瓜、南瓜、大葱、
洋葱以及胡萝卜的蔬菜作物类；包括人参、烟、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生以及油菜的特种作物类；包括苹果树、梨树、枣树、桃树、葡萄树、橘子树、柿子树、李子树、杏树以及香蕉树的果树类；包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合以及郁金香的花卉类中选择。
110.本发明的第四方面涉及一种包括通过如上所述的生产方法生产出的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白以及包括所述蛋白的免疫原性得到提升的流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗用疫苗组合物。
111.在本发明的疫苗组合物中，所述可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以被涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面。所述在细胞壁中包括肽聚糖的细菌可以是一般公认安全(generally recognized as safe，gras)状态的细菌，例如，包括乳球菌(lactococcus)、乳杆菌(lactobacillus)以及链球菌(streptococcus)等，但是并不限定于此。
112.在本发明的具体一实施例中，拟通过在乳酸乳球菌的表面以多种方式涂覆一种或不同的两种以上的重组ha蛋白而有效地对抗原进行递送。
113.为此，本发明的可形成三聚体的不同的两种类型以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以通过下述(i)至(iii)中的某一个方法涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面：
114.(i)在对所述可形成三聚体的不同的两种类型以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白进行混合之后，涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面；
115.(ii)在将所述可形成三聚体的不同的两种类型以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白分别涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面之后进行混合；或，
116.(iii)通过所述(i)以及(ii)的两种方法，将不同的两种类型以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白涂覆到在细胞壁中包括肽聚糖的细菌或壳聚糖的表面。
117.例如，本发明的疫苗组合物可以在分别将可形成三聚体的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白涂覆到乳球菌之后将各个涂覆有不同的ha重组蛋白的乳球菌以相同的比例进行混合(例如，在对涂覆有两种不同的ha重组蛋白的乳球菌进行混合时，可以以1:1进行混合)或以任意适当的比例进行混合，从而制造出单体疫苗组合物。此外，也可以在将不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白以相同的比例或任意适当的比例进行混合之后涂覆到乳球菌表面，从而制造出单一疫苗组合物。借此，可以制造出可同时有效地对两种以上的抗原进行递送的单一疫苗组合物。此外，可以在涂覆有不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白的乳球菌死菌体中追加混合涂覆有其他不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白的乳球菌死菌体，从而制造出对多种抗原进行递送的疫苗组合物。
118.因此，本发明的疫苗组合物中所包括的不同的两种以上的源自于流感病毒的重组ha蛋白可以源自于从由目前已知的a型、b型、c型流感病毒和传染性鲑鱼贫血病毒(isavirus)以及索戈托病毒(thogotovirus)构成的组中选择的一种或两种以上。所述a型流感病毒可以是例如从由h5n6、h7n9以及h9n2构成的组中选择的某一个或两个以上，但是并不限定于此。
119.本发明的疫苗组合物还可以追加包括霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit)。借此，可以提升本发明的重组ha蛋白的免疫原性，从而更加有效地诱导免疫反
应。
120.本发明的疫苗组合物可以是注射剂形态，但是并不限定于此。
121.在本发明的疫苗组合物中，流感病毒感染疾病包括因为a型、b型或c型流感病毒感染造成的急性呼吸系统疾病或因此而导致的临床症状以及并发症。流感病毒感染造成的急性呼吸系统疾病所导致的临床症状，包括如发烧(约38～40℃)、干咳、咽喉疼痛等呼吸系统症状以及如头痛、肌肉痛、疲惫感、虚弱感、食欲不振等全身症状。最常见的并发症为继发性呼吸系统疾病，如鼻窦炎以及中耳炎等上呼吸系统感染，除此之外还有如脑炎、脊髓炎、吉兰-巴雷综合症等神经系统疾病和横贯性脊髓炎、心肌炎、肌炎以及气胸等。
122.本发明中的术语“预防”、“改善”和/或“治疗”是指可以对疾病或病症的发病进行抑制或延缓的所有行为，可以使得疾病或病症状态好转或向有利方向发展的所有行为，可以对疾病或症状的进展进行延缓、中断或逆转的所有行为。
123.本发明的疫苗组合物可以由抗原、药剂学上可容许的载体、适当的佐剂以及其他一般的物质构成，以免疫有效量进行给药。在本发明中，术语“免疫有效量”是指足以诱导免疫反应但不会引起副作用以及严重或过度的免疫反应的程度的量，正确的给药浓度会根据需要给药的特定免疫原发生变化，而且为了对免疫反应的发生进行检查而由相关从业人员通过公知的方法确定。此外，给药形态以及路径、需求者的年龄、健康以及体重、症状的特性以及程度、当前治疗方法类型以及治疗次数等发生变化。
124.载体可以包括相关领域所公知的稳定剂、稀释剂以及缓冲液。作为适当的稳定剂，可以包括如山梨糖醇、乳糖、甘露醇、淀粉、糖、葡聚糖以及葡萄糖等碳水化合物；如白蛋白或酪蛋白等蛋白。作为适当的稀释剂，包括盐、汉克斯平衡盐(hanks balanced salt)以及林格氏液等。作为适当的缓冲液，包括碱金属磷酸盐、碱金属碳酸盐以及碱土金属碳酸盐等。此外，本发明的疫苗组合物还可以追加包括从由溶剂、佐剂(adjuvant)以及赋形剂构成的组中选择的一种以上。作为所述溶剂，包括生理食盐水或蒸馏水，作为免疫增强剂，包括如弗氏不完全或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油以及矿物油等，作为赋形剂，包括如磷酸铝、氢氧化铝或硫酸铝钾，但是并不限定于，还可以包括具有相关领域之一般知识的技术人员所公知的在制造疫苗时所使用的物质。
125.本发明的疫苗组合物可以通过公知的给药路径进行给药。在所述方法中可以包括经口、经皮、肌肉、腹膜、静脉、皮下以及鼻腔路径，但是并不限定于此，可以通过可将活性物质递送到靶标细胞的任意的装置进行给药。
126.本发明的疫苗组合物可以诱导体液性免疫反应或选择性地诱导细胞-介导的免疫反应和/或所述两种免疫反应的组合。
127.本发明的第五方面涉及一种包括利用所述不同形态的疫苗组合物向所需要的个体进行给药的步骤的流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗方法。
128.在本发明的流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗方法中，“个体”是指已经感染或可能感染流感病毒的包括人类在内的所有动物。例如，包括如人类、狗、猫、猪、马、鸡、鸭、鹅、火鸡以及海豹等，但是并不限定于此。通过利用本发明的疫苗组合物向所需要的个体进行给药，可以有效地对因为a型、b型或c型流感病毒感染造成的急性呼吸系统疾病或因此而导致的临床症状以及并发症进行预防或治疗。例如，可以利用本发明的疫苗组合物对被各种流感病毒亚型或变异型的流感病毒感染的人类进行治疗。此外，可以利用本发明的组合
物对被各种流感病毒亚型或变异型的禽流感病毒感染的鸡或猪进行治疗。本发明的组合物可以与现有的流感病毒感染疾病治疗剂和/或霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit)联合给药。
129.术语“联合给药(administered in combination)”是指将本发明的疫苗组合物与现有的流感病毒感染疾病治疗剂和/或霍乱毒素b亚基一起向所需要的个体进行给药。将各个成分一起给药进行是指为了达成所需要的效果而将各个成分同时(simultaneous)、分别(separate)或依次(sequential)给药。
130.在本发明的流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗方法中，所述疫苗组合物可以借助于经口、非经口、吸入喷雾方式通过局部、直肠、鼻腔、口腔、引道或植入储库进行给药。在本技术中使用的术语“非经口”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、脊髓腔内、肝内、病灶内以及颅内注射，但是并不限定于此。尤其是，所述组合物可以通过经口方式向腹腔内或静脉内进行给药。
131.在本发明的流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗方法中，所述疫苗组合物的给药执行两次以上为宜。例如，可以在第一次免疫接种(initial vaccination)之后以1～10周为间隔执行1～4次的追加接种(booster injections)，这可以根据相应动物的类型由从业人员适当地变形实施。
132.本发明的第六方面涉及一种在制造流感病毒感染疾病的预防、改善或治疗用药剂时的本发明的可形成三聚体的源自于流感病毒的重组ha蛋白的用途。
133.接下来，为了帮助理解本发明而提供较佳的实施例。但是，下述说明只是为了帮助理解本发明而提供，本发明的内容并不因为下述实施例而受到限定。
134.本发明的实施方式
135.实施例1
136.可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组基因的设计
137.为了诱导h5n6或h9n2的ha在er内腔(lumen)中以可溶性形态表达，获取了没有跨膜结构域以及er靶标前导序列h5n6的ha(genbank：aj d09950.1)的氨基酸位置17～531以及h9n2的ha(genbank：afm47147.1)的氨基酸位置19～524。通过向所述ha的5'-端融合从拟南芥蛋白即bip获得的er靶标信号而进行了er靶标化。此外，利用连接肽将从乳酸乳球菌(lact ococcus lactis)的acma到乳球菌结合结构域即lysm的三个重复序列中的第一个重复序列融合到ha的c-端。此外，为了实现ha提纯以及在er中高度滞留，将hisx6标记以及er滞留基序(retention motif)即hdel依次融合到lysm的c-端，从而构建出mha(图1a)。为了诱导通过如上所述的方式制造的ha重组蛋白的三聚体形成，将从名为小鼠mcoronin1的蛋白诱导形成同源三聚体的基序添加到ha与lysm之间，从而构建出tha(图1b)。为了表达而使用了mact，并将rd29b的末端作为转录终止子使用。已经确认其可以呈现出较高的转录效率。在试验中使用的碱基序列如下述表1所示。
138.表1
139.140.141.142.[0143][0144]
实施例2
[0145]
可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组基因的表达以及确认
[0146]
将mha以及tha使用真空浸润法(vacuum infiltration)在4～5周龄的烟草植物即本式烟草(nicotiana benthamiana)植物叶片中通过暂时性表达对其表达进行诱导。在浸润之后的第三天、第五天以及第七天(dpi)分别收集经过浸润的叶片，并在液氮中完全粉碎之后溶解到3倍体积的缓冲液中。在通过sds-page展开经过浸润的叶片提取物中的总可溶性蛋白之后，对其执行蛋白质印迹(western blot)分析。如图2a所示，ha重组蛋白在与通过抗-his抗体预测出的大小对应的位置即约85kda(mh5n6)以及90kda(th5n6)位置上呈现出了清晰的条带。此外，如图2b所示，在将相同的膜利用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，cbb)进行染色并对其条带进行确认时可以观察到了相同的结果。通过根据色带强度对所述重组蛋白的表达水准进行判断，可以估计出在经过浸润的叶片中为100μg/g鲜重(fresh weight)。
[0147]
实施例3
[0148]
可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组基因的三聚体结构形成确认
[0149]
病毒表面上的ha蛋白以同源三聚体存在，因此可以呈现出较高的稳定性以及免疫原性。另一方面，重组ha具有根据表达系统表达为凝聚体或单体的倾向。为了模仿与存在于病毒表面时相同的ha的三聚体，将卷曲螺旋(coiled coil)结构且形成同源三聚体的基序即小鼠冠蛋白1-1a(mcor1，genbank：edl17419.1，32个氨基酸)以如图1b所示的方式添加到
ha的c-端。通过将所述基因导入到本式烟草(n.benthamiana)并诱导其表达，接下来分别从5dpi的叶片组织获取了总可溶性蛋白(total soluble protein)，并利用ni
2 -nta亲和柱层析进行提纯。将分离提纯的mha以及tha以bsa标准曲线为基础进行定量化。为了确认ha是否可以通过mcor1形成三聚体，向约10μg的mha以及10μg的tha添加pbs并混合至整体溶剂达到1ml，接下来利用尺寸排除色谱法(size exclusion chromatography，sec)进行分析。如图3a以及图3c所示，mha以及tha混合物在280nm吸收光谱中呈现出了两个峰值。将包括所述两个峰值的分馏物使用抗-his抗体通过蛋白质印迹进行分析，其结果分别如图3b以及图3d所示。如图3a以及图3c的sec分析结果和图3b以及图3d的蛋白质印迹分析分析结果所示，包括mcor1的tha(即，th5n6以及th9n2)与没有mcor1的mha(即，mh5n6以及mh9n2)相比较早溶出。借此可以确认，mcor1可以诱导ha的三聚体形成。
[0150]
实施例4
[0151]
可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组基因的肽聚糖结合能力确认
[0152]
acma作为乳酸乳球菌(lactococcus lactis)的噬菌体(phage)即mg1363的主要的自溶素(autolysin)，会在c-端三次重复出现被称之为lysm的结构域，所述lysm的三次重复部分具有结合到乳球菌的细胞壁成分即肽聚糖的能力。为了呈现出对肽聚糖的最佳活性，需要三个重复区间。但是，因为在同时包括三个重复区间时结构域的长度会变得过长，因此仅将一个lysm融合到gfp的c-端进行确认。其结果，如图4a以及图4b所示，gfp-lysm无法有效地结合到乳球菌中。因此，通过追加为了形成ha的三聚体而使用的小鼠冠蛋白1a(mcor-1a)的三聚体形成基序而构建gfp-mcor1-lysm并诱导其形成与ha中的三聚体相同的三聚体之后，确认其是否会结合到乳聚糖。其结果，如图4a以及图4b所示，可以在乳球菌中观察到与gfp-lysm相比显著增加的gf p信号。借此可以确认，mcor1a的三聚体形成基序可以诱导gfp的三聚体形成，而因为通过如上所述的方式形成的gfp三聚体具有三个jysm基序，因此可以使得gfp有效地结合到乳球菌中。如上所述的结果表明，tha可以有效地结合到乳球菌中。
[0153]
实施例5
[0154]
可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组基因的最大结合量确认
[0155]
ha的重组蛋白即mha以及tha在本式烟草中均高度表达。将经过浸润的叶片在液氮中完全粉碎并溶解到含有0.5％曲拉通x-100、1mm edta以及25％甘油的10倍体积的bps缓冲液中。从叶片获取总可溶性蛋白，并将相当于叶片的200mg至2g的总可溶性蛋白的量与在37℃下进行1小时的tca前处理的乳酸乳球菌(l.lactics)一起进行培养，接下来利用pbs缓冲液进行三次洗涤。在各个样本中对乳球菌进行沉淀并将其投入到sds缓冲液中进行加热之后与不同量的bsa一起利用sds-page展开，接下来利用考马斯亮蓝进行染色并对ha进行确认。其结果，如图5所示，伴随着ha的量的增加，具有三聚体基序即mcor1的tha结合到乳酸乳球菌的量随之增加，但mha几乎没有结合到乳球菌中。估计三聚体即tha的最大结合量约为1.7μg/1ml l.lactics(od＝1)(图5)。
[0156]
实施例6
[0157]
乳球菌死菌体的制造以及将可形成三聚体的源自于流感病毒表面蛋白的血球凝
集素(ha)重组蛋白涂覆到所述死菌体的方法
[0158]
将乳球菌(韩国微生物保藏中心；kccm no.43146)在od
600
下培养至1.0之后将培养液通过离心分离对细胞进行粒化(pelleting)之后回收，接下来利用相同体积的10％三氯乙酸(tca)重新悬浮并在100℃下进行10分钟的处理。为了去除tca而将细胞通过离心分离进行粒化之后，利用pbs进行三次洗涤并对颗粒进行重新悬浮，从而制造出乳球菌死菌体。添加不同量的利用缓冲液(pbs ph＝7.5，1mm edta，triton x-100，混合物以及25％甘油)制成的总可溶性蛋白提取液并在37℃下进行1小时的培养。通过在12,000rpm下进行5分钟的离心分离而对乳球菌死菌体进行粒化，接下来利用蛋白提取用pb s缓冲液进行三次洗涤。
[0159]
实施例7
[0160]
利用小鼠确认可形成三聚体的抗原的免疫原性
[0161]
利用分别通过实施例2以及实施例6制造出的重组碳hn6、涂覆到乳球菌死菌体的th5n6、th9n2以及涂覆到乳球菌死菌体的th9n2疫苗，以2周为间隔分两次向6周龄的c57bl/6磁性小鼠(orientbio，韩国)进行腹腔内注射。作为对照组，利用pbs以及乳球菌死菌体进行给药。按照如下述表2所示的组成以混合或不混合佐剂的状态添加所述重组疫苗制造出试验疫苗。
[0162]
表2
[0163][0164]
为了对通过所述给药的试验疫苗诱导的体液性免疫反应进行分析，在免疫前即第0周以及进行两次疫苗给药之后的两周即第四周对小鼠的血清进行分离，通过elisa法对抗原特异性的抗体形成进行分析而确定了抗体滴度。通过如下所述的方法对整体igg抗体滴度进行确认。
[0165]
具体来讲，将经过提纯的所述重组抗原以50ng/孔的浓度涂覆到96孔微孔板中，接下来为了防止非特异性结合而添加200μl的包括3％脱脂牛奶(skim milk)的pbst缓冲液(nacl 137mm，kcl 2.7mm，na2hpo
4 10mm，kh2p o
4 1.8mm，tween 20 1％)并进行2小时的反应。对所述微孔板进行洗涤并向各个孔依次添加利用包括3％脱脂牛奶的pbst溶液稀释的血清之后在室温下利用微孔板振荡器(microplate shaker)进行1小时的反应。接下来，在利用200μl pbst缓冲液进行三次洗涤之后作为二次抗体投入抗-小鼠igghrp(horse r adish heroxidase，kpl，美国，bethyl.)并在相同的条件下进行2小时的反应。对所述经过反应的微孔板进行洗涤并添加显色试剂tmb(3,3',5,5'-tetramethyl b enzidine)以及过氧物酶基质(peroxidase substrate，kpl，美国)，接下来在常温下进行10分钟的反应之后利用0.18m h2so4终止液停止显色反应，然后利用elisa酶标仪对450nm下的od进行测定。将抗体滴度定义为呈现出相当于阴性对照组od值的2倍od值的抗体稀释倍数的倒数。其结果，如图6b所示，以没有佐剂的状态涂覆到乳球菌表面的tha呈现出了与包括佐剂时相同的抗体诱导效果。这表明涂覆到乳球菌中的抗原即使是在没有佐剂的状态下也可以强效诱导免疫，而且乳球菌死菌体可以在腹腔内以及机内给药时作为强效佐剂，而这可以作为具有成本效益的预防接种方式。
[0166]
实施例8
[0167]
源自于流感病毒表面蛋白的血球凝集素(ha)重组蛋白涂覆到乳球菌表面的形态与水溶性三聚体的血球凝集阻碍程度比较
[0168]
使用pbs作为对照组，利用以2的倍数对th9n2(h9n2的ha三聚体)、th5n6(h5n6的ha三聚体)、乳球菌死菌体、lact.-th9n2(涂覆到乳球菌表面的h9n2的ha三聚体)、lact.-th5n6(涂覆到乳球菌表面的h5n6的ha三聚体)进行稀释的抗原执行血球凝集抑制试验(hemagglutination inhibition ass ays)，从而对血球凝集进行分析。在u形底微孔板(u-bottom microplate)中从第一个到最后一个孔之前为止添加25μl的稀释缓冲液。将经过前处理的样本，在第一个孔中添加25μl的稀释缓冲液之后直至最后一个孔之前为止依次增加25μl进行二进稀释。此时，为了对样本的非特异性反应进行确认，在最后一个孔中添加25μl的经过前处理的样本。将以8ha单位(unit)稀释的各个抗原从第一个到孔到最后一个孔之前为止各添加25μl之后进行密封，接下来在室温下进行45分钟的培养。将25μl的1％鸡血细胞添加到各个孔中并在室温下进行1小时的反应之后读数。如图7a以及图7b所示，在血球凝集抑制试验中，涂覆有抗原的乳球菌，即在乳球菌表面涂覆有h9n2的ha三聚体的lact.-th9n2以及涂覆有h5n6的ha三聚体的lact.-th5n6的活性明显较高。
[0169]
实施例9
[0170]
以家禽类为对象确认涂覆到乳球菌表面的三聚体的抗原性
[0171]
将6周龄的鸡(namduck，大韩民国)每组分成5只，并分别将pbs、乳球菌死菌体、可溶性h5n6的ha三聚体以及涂覆到乳球菌表面的h5n6的ha三聚体作为抗原通过1次肌肉注射进行给药，然后对抗体的形成进行确认。
[0172]
同样，将h9n2的ha作为抗原按照与上述相同的方法注射到鸡的肌肉之后对抗体的形成进行确认。在本实施例中使用的疫苗的组成如下述表3所示。此时，作为对照组注射h9n2病毒1
×
107eid50，并对抗体的形成进行确认。
[0173]
表3
[0174][0175]
为了对通过所述给药的试验疫苗诱导的体液性免疫反应进行分析，在免疫第二周、第三周以及第四周分别对鸡的血清进行分离，接下来通过elisa法对抗原特异性的抗体形成进行分析而确定了抗体滴度。通过如下所述的方法对整体igg抗体滴度进行确认。
[0176]
具体来讲，将经过提纯的所述重组抗原以100ng/孔的浓度涂覆到96孔微孔板之后，为了防止非特异性结合而添加1％牛血清白蛋白(bovine serum albu min)并进行1小时的反应。对所述微孔板进行洗涤之后向各个孔依次添加稀释的血清并在37℃下进行2小时的反应，接下来作为二次抗体添加抗-小鼠iggh rp(horse radish heroxidase，kpl，美国)并在相同的条件下进行1小时的反应。对所述经过反应的微孔板进行洗涤并添加显色试剂tmb(3,3',5,5'-tetramet hyl benzidine)以及过氧物酶基质(peroxidase substrate，kpl，美国)，接下来在常温下进行10分钟的反应之后利用终止液停止显色反应，然后利用elisa酶标仪对450nm下的od进行测定。将抗体滴度定义为呈现出相当于阴性对照组od值的2倍od值的抗体稀释倍数的倒数。如图8a以及图8b所示，在鸡的身体中，涂覆到乳球菌表面的抗体与以可溶性形态注射时相比诱导了更加强效的免疫反应。尤其是，2μg的涂覆到乳球菌表面的h9n2的ha三聚体与注射h9n2病毒1
×
107eid50时相比具有非常强效的免疫效果。
[0177]
实施例10
[0178]
将ctb(cholera toxin b subunit)、可溶性h5n6的ha三聚体以及可溶性h9n2的ha三聚体分别涂覆到乳球菌死菌体之后的免疫诱导确认
[0179]
在将ctb(cholera toxin b subunit)、可溶性h5n6的ha三聚体以及可溶性h9n2的ha三聚体分别涂覆到乳球菌死菌体之后，在小鼠(系统名称：balb/c；动物规格：5周龄，磁性，20g；动物购买单位：samtako，大韩民国；使用个体矢量：3只/组)中通过抗原腹腔注射对其免疫原性进行确认。将涂覆有ctb(1μg)的ilact作为对照组，并制造出ilact-th5n6(0.1μg) ilact-th9n2(0.1μg)、ilact-th5n6(0.5μg) ilact-th9n2(0.5μg),ctb(1μg) ilact-th5n6(0.1μg) ilact-th9n2(0.1μg)或ctb(1μg) ilact-th5n6(0.5μg) ilact-th9n2(0.5μg)作为疫苗组合物并以2周为间隔进行两次腹腔注射，接下来在2周之后采集血液并通过elisa对血液中存在的抗体进行确认。此时，在elisa板中分别涂覆20ng的h5n6以及h9n2抗原。其结果，如图9所示，在将ctb与tha抗原同时注射到腹腔时可以呈现出提升ha的免疫原
性的效果。
[0180]
实施例11
[0181]
在分别将h5n6的ha以及h9n2的ha分别涂覆到乳球菌并对乳球菌进行混合之后确认免疫诱导能力
[0182]
在分别将不同的两种类型的ha涂覆到乳球菌表面之后对其进行混合并注射到小鼠体内，并对各个抗原的免疫原性功效进行确认。为此，通过将0.1μg、0.5μg或1.0μg的h5n6的tha涂覆到乳球菌表面而准备ilact-tha
h5n6
，同样通过将0.1μg、0.5μg或1.0μg的h9n2的tha涂覆到乳球菌表面而准备ilact-tha
h9n2
之后，按照不同的浓度1:1混合而制造出疫苗组合物(ilact-tha
h5n6
ilact-tha
h9n2
)。通过利用所制造出的组合物以2周为间隔向小鼠进行腹腔注射而诱导免疫反应，并在第二次注射2周之后采集血液对抗体的量进行测定。在elisa板中分别涂覆50ng的tha
h5n6
以及tha
h9n2
两种类型的抗原之后，按照与实施例7中的记载相同的方法对结合到各个抗原的抗体的量进行测定。其结果，如图10所示，可以确认对两种抗原的强效的免疫原性。
[0183]
实施例12
[0184]
在将h5n6的ha以及h9n2的ha两种类型同时涂覆到乳球菌之后确认其免疫诱导能力
[0185]
将浓度为0.1μg、0.5μg或1.0μg的两种类型的抗原即h5n6的tha(tha
h5n6
)以及h9n2的tha(tha
h9n2
)以1:1混合并涂覆到乳球菌表面[ilact(tha
h5n6
tha
h9n2
)]之后，以2周为间隔向小鼠进行腹腔注射，接下来在第二次免疫注射2周之后采集血液并通过elisa对抗体的形成进行确认。在elisa中，将涂覆50ng的所使用的抗原之后将血液按照适当的比例进行稀释，并按照与实施例7中的记载相同的方法对抗体的量进行测定。如图11所示，按照本发明的实施例制造出的疫苗组合物对两种抗原都可以诱导强效的免疫反应。借此，可以确认乳球菌可以同时传递两种类型的抗原(tha
h5n6
以及tha
h9n2
)。