构建原位原发食管癌动物模型的方法与流程

1.本发明属于肿瘤动物模型领域。


背景技术：

2.食管癌在中国的发病率高达13.9/10万人，远高于世界平均水平。同时，中晚期食管癌五年生存率只有10％-20％，使之成为严重影响我国国民身体健康的恶性肿瘤。小鼠食管类器官培养以及肿瘤模型的建立，为研究食管癌发生发展以及探索各种治疗手段提供了可能的技术平台。
3.传统的细胞培养技术，或称细胞系培养，往往细胞种类单一，在细胞永生化的过程中，遗传信息发生偏移，丢失或者增加了某些特定染色体片段。正常组织或者肿瘤都有强烈的异质性，种类单一的细胞系与体内状态差异极大，而且对于某些药物的抗性，基因的影响都不能反应病人的真实情况。体外3d培养条件下使用组织细胞培养类器官(organoid)，这种类器官可在体外表现出与体内细胞相似的细胞组成以及生理功能。科学家已成功在体外3d培养条件下使用成熟人源组织细胞培养出肝脏、小肠等组织类器官。这一技术可以用于组织发育，肿瘤发生，药物测试等相关领域。
4.目前，关于食管肿瘤还没有原发原位的模型，现有的模型也不能很好的反应基因在肿瘤发生发展过程中的影响。
5.表1食管癌动物模型
6.[0007][0008]
皮下移植模型，需要在免疫缺陷鼠皮下移植大量的肿瘤细胞系，细胞系本身就很难表征病人肿瘤特征，皮下肿瘤更是不能反应食管组织生态。来源于病人的pdx模型除了移植在皮下的弊端以外，由于病人本身的差异，标本取材的差异，导致该模型的成功率很大程度上取决于标本本身，而且重度免疫缺陷鼠的饲养成本太高，难度很大。原位移植模型由于小鼠食管纤细，手术难度非常大，监测肿瘤形成需要特殊设备，但是该模型可以模拟食管肿瘤的生态环境。基因鼠模型的背景非常明晰，成瘤的位置也完全有可能在食管原位，但是该模型成本非常高，基因鼠制备繁殖周期太长。致癌物质诱导模型是最古老的一种食管癌模型，很大程度上取决于小鼠的基因背景，该模型其实很难模拟病人的肿瘤形成情况。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种更接近食管癌生物学特性、且制备周期短的原位原发食管癌模型。
[0010]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0011]
一种构建原位原发食管癌动物模型的方法，包括如下步骤：
[0012]
1)人或动物食管细胞原代培养；
[0013]
2)将原代细胞培养成类器官；
[0014]
3)对步骤2)所得类器官进行基因编辑；
[0015]
4)将基因编辑成功的类器官注射到动物食管组织内；
[0016]
步骤3)所述基因编辑是指突变抑癌基因，和/或高表达原癌基因。
[0017]
如前述的方法，步骤1)之前还包括小鼠食管原代细胞的分离步骤：
[0018]
a.使用终浓度0.25％trypsin和0.1mg/ml dnase i消化食管；
[0019]
b.使用含有10％fbs的dmem培养基中和trypsin，筛网过滤获得单个细胞，培养基洗涤、离心以终止酶消化反应；
[0020]
优选地，步骤b所述培养基是dmem/f12培养基。
[0021]
如前述的方法，步骤2)包括如下步骤：
[0022]
将小鼠食管原代细胞与蛋白浓度为8-12mg/ml的matrigel混合，待matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
[0023]
所述培养基是dmem/f12，加如下细胞因子中的12～13种得到：
[0024]
细胞因子可选的浓度范围细胞因子可选的浓度范围b2750倍稀释egf50～100ng/mlr-spondin 1250～1000ng/mlfgf-10500～1000ng/mly-2763210～50umglutamax100倍稀释gastrin1～5nmn-acetylcysteine1～2mmnoggin100～1000ng/mla83-01200～500nmnicotinamide10～50mmwnt-3a50～100ng/mln2100～400倍稀释
ꢀꢀ
[0025]
其中gastrin、n2和y-27632不可缺少；
[0026]
所述glutamax为gibco产品；
[0027]
所述n2为gibco产品：n-2supplement；
[0028]
所述b27为gibco产品：b27supplement serum free。
[0029]
如前述的方法，所述类器官培养基的添加剂为：
[0030]
细胞因子可选的浓度范围细胞因子可选的浓度范围b2750倍稀释egf50ng/mlr-spondin 1250ng/mlfgf-10500ng/mly-2763210umglutamax100倍稀释gastrin1nmn-acetylcysteine1mmnoggin100ng/mla83-01200nmnicotinamide10mmwnt-3a50ng/mln2100倍稀释
ꢀꢀ
[0031]
如前述的方法，所述酶解的温度是37℃；
[0032]
和/或，所述酶解的时间为5～10min。
[0033]
如前述的方法，所述食管癌是食管鳞癌；
[0034]
步骤3)的基因编辑具体是：
[0035]
突变trp53、pten和smad4基因；高表达cmyc和kras
g12d
(使kras蛋白第12位氨基酸由g突变位d的基因)基因。
[0036]
如前述的方法，所述食管癌是食管腺癌；
[0037]
步骤3)的基因编辑具体是：
[0038]
突变trp53和kmt2d基因，高表达cmyc和kras
g12d
基因。
[0039]
如前述的方法，步骤3)的基因编辑还包括对类器官转入荧光标记基因。
[0040]
如前述的方法，步骤1)和4)所述动物是小鼠。
[0041]
前述的方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中应用。
[0042]
本发明的有益效果在于：
[0043]
本发明的肿瘤模型构建周期较基因工程动物模型大大缩短，且不会导致动物成瘤前死亡，造模成功率高达100％。
[0044]
本发明构建的原位原发的小鼠食管肿瘤模型，可模拟在人体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程，能动态地表征了肿瘤发生发展地过程，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。
[0045]
总之，本发明的方法可高效率地制备得到更接近食管癌特征、符合临床研究需求的食管癌模型；该模型可以在探究食管癌发生发展机制、寻找和优化新的食管癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。
[0046]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0047]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0048]
图13d培养食管类器官示意图。
[0049]
图2食管类器官光镜图。
[0050]
图3食管类器官传代。
[0051]
图4食管类器官基因编辑荧光检测。
[0052]
图5小鼠类器官基因编辑t7e1检测。
[0053]
图6小鼠食管手术后随时间观察成瘤情况。
[0054]
图7类器官移植形成的小鼠食管腺癌。
[0055]
图8小鼠类器官移植形成的食管鳞癌。
[0056]
图9小鼠类器官在缺失某种细胞因子之后的克隆形成统计；图中部分因子使用缩写：nac指n-acetvlcysteine；nico指nicotinamide；y27632指y-27632；r-spondin指r-spondin 1；wnt3a指wnt-3a。
[0057]
图10小鼠类器官在缺失某种细胞因子之后的直径统计；图中部分因子使用缩写：nac指n-acetylcysteine；nico指nicotinamide；y27632指y-27632；r-spondin指r-spondin 1；wnt3a指wnt-3a。
具体实施方式
[0058]
本发明中的部分英文缩写解释如下：
[0059]
dmem：是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养，购买自gibco公司。
[0060]
dmem/f12：是f12培养基和dmem培养基按照1：1结合，称为dmem/f12培养基。综合了f12含有较丰富的成分和dmem含有较高浓度养分的优点。购买自gibco公司。
[0061]
matrigel：从富含胞外基质蛋白的ehs小鼠肿瘤中分离出，其主要成分由层粘连蛋白，iv型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。购买自bd公司。
[0062]
b27，即b27补充剂，市售产品，可用于配制培养基。b27补充剂以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(t3)、dl-α-生育酚(维生素e)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。购自life technologies公司。n-acetylcysteine：n-乙酰半胱氨酸，购买自sigma公司。
[0063]
egf：表皮生长因子，市售产品，购买自r&d公司。
[0064]
noggin，细胞生长蛋白成分，市售产品，购买自peprotech公司。
[0065]
r-spondin 1：人细胞生长编码蛋白，市售产品，购买自peprotech公司。
[0066]
a83-01：tgf-β抑制剂，购买自tocris bioscience公司。
[0067]
fgf10：成纤维细胞生长因子，购买自peprotech公司。
[0068]
nicotinamide，烟酰胺，购买自sigma公司。
[0069]
y-27632：rock特异性通路阻断剂。购买自abmole bioscience公司。
[0070]
wnt3a：wnt激动剂，细胞中激活tcf/lef-介导的转录的因子，购买自peprotech公司。
[0071]
glutamax：市售细胞培养添加剂，购自：gibco公司。
[0072]
n2：n2补充剂以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μg/ml人转铁蛋白。
[0073]
gastrin：胃泌素，购买自sigma公司。
[0074]
tryple：用于解离贴壁哺乳动物细胞的重组消化酶，购买自gibco公司。
[0075]
实施例1本发明的类器官培养方法
[0076]
包括获取新鲜的食管组织细胞，胰酶消化为单细胞；体外3d培养条件培养食管组织类器官，示意图见图1，所得类器官效果如图2。
[0077]
所需试剂：
[0078]
1.小鼠食管类器官培养基(成分见表2)
[0079]
2.tryple(gibco)
[0080]
3. 0.25％trypsin-edta(gibco)
[0081]
4.dnasei(5mg/ml)
[0082]
5.matrigel(cording)
[0083]
6.75％乙醇
[0084]
7.dpbs basic(gobo)
[0085]
8.1x ack
[0086]
9.dmem(gibco) 10％fbs
[0087]
表2小鼠食管类器官培养基成分(用dmem/f12配制)：
[0088][0089][0090]
所需器械：
[0091]
1.剪刀镊子
[0092]
2.六孔板
[0093]
3. 50ml bd管
[0094]
4. 48孔板
[0095]
5.冰盒
[0096]
6.吸水纸
[0097]
7. 70um细胞筛
[0098]
方法：
[0099]
1.安乐死小鼠，用75％乙醇反复喷淋小鼠尸体。
[0100]
2.将小鼠放置吸水纸上，打开腹腔和胸腔，并于颈部剪断气管和食管。用镊子拉扯胃，取出食管。
[0101]
3.在预冷的pbs中反复漂洗食管组织，并用镊子去除食管组织上明显的血污。
[0102]
4.用剪刀剪碎食管组织。
[0103]
5.用15ml trypsin在50mlbd管中重悬食管组织，加入10ul dnase i，于37度水浴锅中消化1小时，期间每十分钟取出上下颠倒。
[0104]
6.用等体积的dmem 10％fbs中和trypsin。
[0105]
7.将第六步中的组织悬液通过70um的滤网。
[0106]
8. 1500rpm 10mins离心。
[0107]
9.去上清，用5ml ack于冰上重悬细胞，静置3mins。
[0108]
10. 1500rpm 5mins离心。
[0109]
11.去上清，加120ulmatrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，30ul/孔。
[0110]
12.于37度孵箱中凝固15mins。
[0111]
13.每孔加150ul培养基，并在周围加上pbs，防止蒸干。
[0112]
14.每天观察，培养基变黄再更换新的培养基或者传代。
[0113]
注意事项：
[0114]
1.用镊子拉扯胃时要小心，充分游离食管后才能取出，否则食管会在贲门处断裂。
[0115]
2.第5步消化时间不宜过长，胰酶对细胞伤害很大。
[0116]
3.第9步如果看不到明显的红细胞，则可以省去。
[0117]
4.第11步去上清时去不干净，第12步凝固时间不足，都会导致凝胶强度不够。
[0118]
5.第11步matrigel要提前20min在4度冰箱融化，整个操作在冰上进行。
[0119]
实施例2类器官传代
[0120]
所需试剂：
[0121]
1.小鼠食管类器官培养基(同表2)
[0122]
2.tryple(gibco)
[0123]
3.matrigel(corning)
[0124]
4.dpbs basic(gibco)
[0125]
所需器械：
[0126]
1. 50ml bd管
[0127]
2. 15ml bd管
[0128]
3. 48孔板
[0129]
4.冰盒
[0130]
5. 70um细胞筛
[0131]
方法：
[0132]
1.吸去organoid上的培养基，每孔加1mltryple。
[0133]
2.用1ml枪尖捣碎基质胶，全部吸取到bd管中，补充tryple到15ml。
[0134]
3. 37度水浴锅温育15mins。
[0135]
4.用10ml移液管反复吹打organoid，再用70um细胞筛过滤至新的bd管中。
[0136]
5. 1500rpm 10mins离心。
[0137]
6.去上清，加120ul matrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，30ul/孔。
[0138]
7.于37度孵箱中凝固15mins。
[0139]
8.每孔加150ul培养基，并在周围加上pbs，防止蒸干。
[0140]
9.每天观察，培养基变黄再更换新的培养基或者传代。
[0141]
注意事项：
[0142]
1.传代应根据目的不同有所区分，若用于扩增organoid，应该尽量密集，有利于organoid生长，若用于organoid拍照，染色，则应该尽量稀疏，有利于organoid分化。
[0143]
2. 15mlbd管和50mlbd管的选用，应该取决于organoid的数量，如果数量较多，则应该使用50mlbd管，数量较少用15mlbd管。
[0144]
3.传代时应使用70um滤网过滤，去除较大的organoid，这类organoid会占据新基质胶中很大的空间，影响新organoid生长。
[0145]
传代效果如图3所示。
[0146]
实施例3基因编辑
[0147]
所需试剂：
[0148]
1.小鼠食管类器官培养基(同表2)
[0149]
2.tryple(gibco)
[0150]
3.matrigel(corning)
[0151]
4.plenti-virus(携带cas9基因的载体，以及表达sgrna的载体，所述sgrna靶向
trp53，kmt2d，smad4和pten基因，使trp53基因发生移码突变，使kmt2d基因发生移码突变，使smad4基因发生移码突变，使pten基因发生移码突变。)
[0152]
5.retro-virus(携带cmyc，kras
g12d
原癌基因，以及d-luciferase荧光素
[0153]
酶报告基因，使得cmyc和kras
g12d
原癌基因高表达)
[0154]
6.polybrane(4mg/ml)
[0155]
7.dpbs basic(gibco)
[0156]
所需器械：
[0157]
1. 50ml bd管
[0158]
2. 15ml bd管
[0159]
3. 48孔板
[0160]
4. 24孔板
[0161]
5.冰盒
[0162]
6.70um细胞筛
[0163]
方法：
[0164]
1.吸去organoid上的培养基，每孔加1mltryple。
[0165]
2.用1ml枪尖捣碎基质胶，全部吸取到bd管中，补充tryple到15ml。
[0166]
3. 37度水浴锅温育15mins。
[0167]
4.用10ml移液管反复吹打organoid，再用70um细胞筛过滤至新的bd管中。
[0168]
5. 1500rpm 10mins离心。
[0169]
6.用virus重悬细胞organoid，polybrane 1∶1000，加到24孔板中。
[0170]
7. 2000rpm 32度离心1小时。
[0171]
8. 37度孵箱孵育4小时。
[0172]
9.将organoid收至15ml小bd管中。
[0173]
10.1500rpm 10mins离心。
[0174]
11.去上清，加120ul matrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，30ul/孔。
[0175]
12.于37度孵箱中凝固15mins。
[0176]
13.每孔加150ul培养基，并在周围加上pbs，防止蒸干。
[0177]
14. 48小时观察荧光。
[0178]
注意事项：
[0179]
1.感染前应保证细胞尽量多，因为有相当多细胞因感染死亡。
[0180]
2.感染时最好用0.22um滤膜过滤病毒，避免污染。或者800rpm离心，去除包病毒时的293t细胞。
[0181]
3.感染结束后应该尽量密集的种植organoid，以便organoid生长。
[0182]
鉴定结果：
[0183]
类器官基因编辑的荧光鉴定如图4所示，基因编辑的t7e1酶切鉴定如图5所示。
[0184]
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
[0185]
实验例1一种食管腺癌模型的构建
[0186]
使用实施例1～3的方法依次进行类器官培养、传代、基因编辑，并将所得基因编辑的类器官移植到小鼠食管，通过活体成像技术监测肿瘤的大小和位置(如图6)，移植45天
后，牺牲小鼠，对食管组织进行直接观察和he染色观察。
[0187]
在trp53、smad4、pten突变，cmyc、kras
g12d
高表达实验组中，5只小鼠在45天左右全部形成食管鳞癌，成功率100％。图7为食管腺癌的外观图以及he染色图，可见小鼠食管与胃连接处形成严重的增生，病理结果显示形成大量核异型腺上皮恶性增生。
[0188]
在trp53、kmt2d突变，cmyc、kras
g12d
高表达实验组中，5只小鼠在44天左右全部形成食管腺癌，成功率100％。图8为食管鳞癌的外观图及he染色图，可见小鼠食管与胃连接处形成结节，病理结果显示鳞状上皮恶性增生并伴随大量角质化。
[0189]
实验例2类器官培养基组分筛选实验
[0190]
小鼠类器官培养时培养基中添加的细胞因子有12种，其中不乏n2，b27等成分复杂的细胞因子，细胞因子成本高昂，极大地提高了小鼠食管类器官在肿瘤形成测试时的成本。在这里发明人逐一去除其中一种细胞因子，在相同体积的基质胶中种以相同数量的第一代食管类器官单细胞(2ul基质胶中种3000个细胞)，以完全培养基为对照，根据小鼠食管类器官形成的数量以及直径，来评价每种细胞因子的作用，本次实验共设有3个技术重复，3个生物学重复。
[0191]
根据图9所示，在完全培养基中，2ul基质胶，3000个细胞可以形成平均80个类器官，去除任何一种细胞因子都会影响类器官的形成效率，其中去除n2会导致类器官只能在相同条件下形成40个，y-27632也会导致相似的结果。但是去除a83-01之后，小鼠食管类器官形成的效率并没有产生较大差异，综上a83-01从类器官形成效率来看，并不是关键细胞因子，其余的各种细胞因子都会或多或少的产生负面影响，其中n2和y-27632是培养小鼠食管类器官不可缺少的细胞因子。
[0192]
根据图10所示，我们在2ul基质胶中，统计了用3000个食管类器官细胞，在缺失了各种类器官培养用细胞因子之后，形成类器官的大小的情况。如图所示，在完全培养基中，类器官大小大概在55μm左右，在缺失了b27或者egf之后，食管类器官大小显著减小，预示着食管类器官分化能力变差，在缺失了n2和nico之后，食管类器官向着尺寸更大方向发展，但是在缺失了n2之后，会导致类器官的形成数量减少。
[0193]
综上所述，在不同的诉求下(追求类器官的形成效率或者单个类器官的尺寸)，可以酌情减少各种细胞因子，进一步压缩培养成本。
[0194]
总之，本发明的方法可高效率地制备得到更接近食管癌特征、符合临床研究需求的食管癌模型；该模型可以在探究食管癌发生发展机制、寻找和优化新的食管癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。