一种高活力纳豆芽孢杆菌筛选及其高密度培养方法

1.本发明属于饲用微生物技术领域，尤其涉及一种高活力纳豆芽孢杆菌筛选及其高密度培养方法。


背景技术：

2.饲用微生态制剂是一种新型的饲料添加剂，具有绿色、无污染且不产生耐药性等优点，可以长期用于饲料添加剂，是理想的抗生素替代品。纳豆芽孢杆菌无毒、无害，并且具有十分重要的益生作用和多种生理功能，经常被用于饲用微生态制剂的生产中。
3.纳豆芽孢杆菌由于可以形成芽孢，所以对严酷环境的耐受能力很强大，目前许多研究的目标在于提高单位体积发酵液活菌数量，对提高芽孢数量的研究较少。而芽孢是长期保存纳豆芽孢杆菌的有效载体，在提高纳豆芽孢杆菌活菌数的同时，提高其芽孢率具有更高的价值。当前大多数通过对发酵工艺过程进行优化而提高其芽孢率，通过诱变的方法提高芽孢率的研究较少。
4.因此，现有技术的问题是：难以通过诱变技术获得高活力和高芽孢率的纳豆芽孢杆菌。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高活力纳豆芽孢杆菌筛选及其高密度培养方法，解决了现有技术中纳豆芽孢杆菌活菌数低、产芽孢率低、发酵成本较高的问题。
6.本发明是这样实现的，一种高活力纳豆芽孢杆菌筛选方法，包括以下步骤：
7.得到纳豆芽孢杆菌的菌悬液；设定诱变参数，对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变；初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌；检测初步筛选的高活性纳豆芽孢杆菌的传代稳定；得到所需的高活力和高芽孢率的纳豆芽孢杆菌。
8.作为本发明优选的，获取-80℃保存的原始纳豆芽孢杆菌，在斜面培养基上进行活化，得到活化的原始纳豆芽孢杆菌；
9.刮取适量的活化的原始纳豆芽孢杆菌菌体，用生理盐水将刮取的所述活化的原始纳豆芽孢杆菌菌体悬浮，得到菌体悬液；
10.用生理盐水将菌体悬液稀释至108cfu/ml，得到所述纳豆芽孢杆菌的菌悬液。
11.作为本发明优选的，所述斜面培养基配方为：酵母抽提物10g/l，葡萄糖20g/l，胰蛋白胨2g/l，琼脂20g/l。
12.作为本发明优选的，所述设定诱变参数，对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变的方法包括：
13.利用常压室温等离子体育种机对所述纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，所述常压室温等离子体育种机功率为115w，所述常压室温等离子体育种机的等离子体发射源与培养基之间的距离为2-4mm，气体流速为10l/min，诱变时间设置为122s。
14.作为本发明优选的，所述等离子体发射源倾斜预定的角度。
15.作为本发明优选的，所述初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌的方法包括：
16.培养：将经过常压室温等离子体育种机诱变后的菌悬液，利用生理盐水进行稀释涂布平板，37℃培养58h；
17.选取：测定菌落直径，挑选尺寸相差50％以内的若干菌落，并分开保存；
18.摇瓶复筛：将保存的菌落进行摇瓶复筛，测定发酵后的活菌数和芽孢数。
19.作为本发明优选的，挑选尺寸最大的菌落、尺寸依次递减的若干菌落和最小的菌落，并分开保存。
20.作为本发明优选的，所述摇瓶培养基配方为：碳源5g/l，酵母提取物10g/l，kh2po40.5g/l；
21.其中，碳源包括68％蔗糖和32％玉米淀粉。
22.作为本发明优选的，所述检测初步筛选的高活性纳豆芽孢杆菌的传代稳定的方法包括：
23.将纳豆芽孢杆菌在摇瓶中传代n次；
24.分别测定发酵液中的活菌数和芽孢数。
25.一种高活力纳豆芽孢杆菌高密度培养方法，包括以下步骤：
26.纳豆芽孢杆菌一级种子液培养：取纳豆芽孢杆菌平板单菌落，接种于一级种子培养基中，装液量30ml/250ml，37℃培养18小时，得到一级种子液；
27.纳豆芽孢杆菌二级种子液培养：将所述一级种子液接种于二级种子培养基中，装液量100ml/1000ml，接种量5％，37℃培养12小时，得到二级种子液；
28.纳豆芽孢杆菌液体发酵：发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量5％，搅拌速度100rpm，发酵6h后开始流加补料培养基(葡萄糖，115℃灭菌30min)，发酵20-24h，测定发酵液中活菌数为3.13
×
10
10
cfu/ml。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
30.本发明中，高活力纳豆芽孢杆菌筛选方法通过对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，得到具有高活性的纳豆芽孢杆菌，再从具有高活性的纳豆芽孢杆菌中筛选出传代稳定的高活力和高芽孢率纳豆芽孢杆菌。并且通过优选发酵培养基的碳氮源、无机盐成分和优化高密度发酵方法大幅提高了纳豆芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，适用于纳豆芽孢杆菌的规模化生产。
附图说明
31.图1是本发明实施例提供的高活力纳豆芽孢杆菌筛选方法的流程框图；
32.图2是本发明实施例提供的得到纳豆芽孢杆菌的菌悬液的方法流程框图；
33.图3是本发明实施例提供的初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌的方法流程框图；
34.图4是本发明实施例提供的检测初步筛选的高活性纳豆芽孢杆菌的传代稳定的方法流程框图；
35.图5是本发明实施例提供的高活力纳豆芽孢杆菌高密度培养方法的流程框图；
36.图6是本发明实施例提供初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌的图片。
具体实施方式
37.为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
38.下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。
39.实施例1
40.请参阅图1，本发明提供一种高活力纳豆芽孢杆菌筛选方法，包括以下步骤：
41.步骤s1、得到纳豆芽孢杆菌的菌悬液；
42.步骤s2、设定诱变参数，对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变；
43.步骤s3、初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌；
44.步骤s4、检测初步筛选的高活性纳豆芽孢杆菌的传代稳定；
45.步骤s5、得到所需的高活力和高芽孢率的纳豆芽孢杆菌。
46.通过该步骤，通过对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，得到具有高活性的纳豆芽孢杆菌，再从具有高活性的纳豆芽孢杆菌中筛选出传代稳定的高活力和高芽孢率纳豆芽孢杆菌。
47.具体的，请参阅图2，在步骤s1中，所述得到纳豆芽孢杆菌的菌悬液的方法包括：
48.步骤s11、获取-80℃保存的原始纳豆芽孢杆菌，在斜面培养基上进行活化，得到活化的原始纳豆芽孢杆菌；
49.步骤s12、刮取适量的活化的原始纳豆芽孢杆菌菌体，用生理盐水将刮取的所述活化的原始纳豆芽孢杆菌菌体悬浮，得到菌体悬液；
50.步骤s13、用生理盐水将菌体悬液稀释至108cfu/ml，得到所述纳豆芽孢杆菌的菌悬液。
51.示例性的，从-80℃冰箱中取出保存的纳豆芽孢杆菌，用接种环蘸取适量，在斜面培养基上进行活化，37℃培养24h后，再用接种环轻轻刮取适量菌体，用生理盐水将菌体悬浮，然后再用生理盐水将菌体悬液稀释至108cfu/ml。
52.其中，在本实施例中，斜面培养基配方为：酵母抽提物10g/l，葡萄糖20g/l，胰蛋白胨2g/l，琼脂20g/l。
53.进一步的，在步骤s2中，所述设定诱变参数，对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变的方法包括：
54.利用常压室温等离子体育种机对所述纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，所述常压室温等离子体育种机功率为115w，所述常压室温等离子体育种机的等离子体发射源与培养基之间的距离为2-4mm，气体流速为10l/min，诱变时间设置为122s。
55.示例性的，利用常压室温等离子体育种机(artp)对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，artp功率为115w，等离子体发射源与载样台之间的距离为2mm，气体流速为10l/min，诱变时间设置不同梯度参数分别为30s、45s、60s、90s、120s、150s，将处理的样品稀释涂平板，测定其活菌数，计算不同时间的致死率。
56.结果表明，随着时间的增加菌体的致死率不断上升，处理30s、45s、60s、90s、120s和150s，致死率分别为22.15％、40.32％、70.18％、90.50％、98.76％和100％。根据相关文献介绍，80％～90％的致死率有利于正突变菌株的产生。但是，发明人发现，对于本发明，当诱变时间为122s时，虽然致死率为达到99.2％，但是后续培养过程中，当培养时间大于58h
(通常一般培养24h)时，活菌数、芽孢数和芽孢率反而高于80％～90％致死率的变异菌株。
57.进一步的，所述等离子体发射源倾斜预定的角度，用于探索活菌数、芽孢数和芽孢率与等离子体发射源距离的关系。
58.进一步的，请参阅图3和图6，在步骤s3中，所述初步筛选高活性纳豆芽孢杆菌的方法包括：
59.步骤s31、培养：将经过常压室温等离子体育种机诱变后的菌悬液，利用生理盐水进行稀释涂布平板，37℃培养58h；
60.步骤s32、选取：测定菌落直径，挑选尺寸相差50％以内的若干菌落，并分开保存；
61.步骤s33、摇瓶复筛：将保存的菌落进行摇瓶复筛，测定发酵后的活菌数和芽孢数。
62.示例性的，将经过常压室温等离子体育种机诱变后的菌悬液，利用生理盐水进行稀释涂布平板，37℃培养58h，测定菌落直径，挑选菌落直径比较大的菌落na-a-3、na-a-35、na-a-73、na-a-116、na-a-224、na-a-301(图1)，并进行分开保存。
63.将初筛得到的六株菌进行摇瓶复筛，测定发酵后的活菌数和芽孢数。将保存的菌种分别接种于摇瓶培养基中37℃，220rmp/min，接入菌种的体积分数为1％，装液量50ml/(250ml三角瓶)，培养14h，各取两份0.1ml菌液，其中一份直接稀释涂布平板，另外一份在70℃水浴处理30min，进行稀释涂布平板，37℃培养58h，测定各个菌种的活菌数、芽孢数和芽孢率(表1)，诱变后的na-a-73的活菌数明显高于出发菌株及诱变筛选的其他菌株，且芽孢率较高。摇瓶复筛活菌数和芽孢数计数结果如下：
[0064][0065]
而现有技术中，培养时间通常为24小时。通过上方式，虽然培养的时间更长，但是在营养成分变动不大的情况下，使得活菌数、芽孢数和芽孢率更高。因此，提供了一种不同的培养方式。
[0066]
进一步的，挑选尺寸最大的菌落和尺寸最小的菌落，并分开保存，按照上述步骤进行培养。
[0067]
通过资料检索，在相同的培养环境和培养时间的培养下，尺寸最大的菌落中的活菌数、芽孢数和芽孢率应该最大，尺寸最小的菌落中的活菌数、芽孢数和芽孢率应该最小。尺寸最大的菌落(na-a-1)和尺寸最小的菌落(na-a-0)的摇瓶复筛活菌数和芽孢数计数结果如下：
[0068]
[0069]
通过该方式验证，na-a-73的活菌数、芽孢数和芽孢率更高。
[0070]
进一步的，参阅图4，在步骤s4中，所述检测初步筛选的高活性纳豆芽孢杆菌的传代稳定的方法包括：
[0071]
步骤s41、将纳豆芽孢杆菌在摇瓶中传代n次；
[0072]
步骤s42、分别测定发酵液中的活菌数和芽孢数。
[0073]
为确保筛选出的菌株有较好的遗传稳定性，将纳豆芽孢杆菌在摇瓶中传代6次，分别测定发酵液中的活菌数和芽孢数，结果如下表所示。结果表明，传代6次，纳豆芽孢杆菌的活菌数与芽孢数均呈现出良好的遗传稳定性。高活性纳豆芽孢杆菌na-a-73的传代稳定性如下：
[0074][0075]
结论：na-a-73具有高度传代稳定性。
[0076]
实施例2
[0077]
和实施例1不同的是：对纳豆芽孢杆菌液态摇瓶发酵培养基优化
[0078]
通过单因素实验，对碳源、氮源、无机盐进行发酵实验：
[0079]
碳源优化：以蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油等量替代摇瓶培养基中的葡萄糖，按摇瓶发酵方法进行培养，结果表明，在单一成分时，以蔗糖为碳源时细菌菌落总数最高，其次是葡萄糖、甘油、可溶性淀粉，玉米淀粉最低。但是，68％蔗糖 32％玉米淀粉时，虽然活菌数和芽孢数均有所降低，但降低的量并不明显。但是用玉米淀粉代替32％的蔗糖，降低了生产成本。碳源优化记录如下：
[0080][0081]
氮源优化：以酵母提取物、热榨黄豆饼粉、酵母膏、棉籽饼粉等量替代摇瓶培养基中的蛋白胨，按照实施例2中摇瓶发酵方法进行培养，结果表明，以酵母提取物为氮源时细菌菌落总数最高，其次是酵母膏、热榨黄豆饼粉，棉籽饼粉最低，因此选用酵母提取物做氮源。氮源优化记录如下：
[0082][0083]
无机盐优化：以kh2po4、k2hpo4、mnso4、feso4等量替代摇瓶培养基中的mgso4，按照实施例2中摇瓶发酵方法进行培养，结果表明，以kh2po4为无机盐时细菌菌落总数最高，其次是k2hpo4、mnso4，feso4最低，因此选用kh2po4做无机盐。无机盐优化记录如下：
[0084][0085][0086]
进一步的，请参阅图5，本发明还提供一种高活力纳豆芽孢杆菌高密度培养方法，包括以下步骤：
[0087]
步骤s61、纳豆芽孢杆菌一级种子液培养
[0088]
取纳豆芽孢杆菌平板单菌落，接种于一级种子培养基中(种子培养基为tsb培养基)，装液量30ml/250ml，32℃-37℃培养18小时，得到一级种子液。
[0089]
步骤s62、纳豆芽孢杆菌二级种子液培养
[0090]
将步骤1培养的纳豆芽孢杆菌一级种子液接种于二级种子培养基中种子培养基为tsb培养基)，装液量100ml/1000ml，接种量1％-5％，32℃-37℃培养12小时，得到二级种子液。
[0091]
步骤s63、纳豆芽孢杆菌液体发酵
[0092]
发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至32℃-37℃，接入二级种子液，接种量1％-5％，搅拌速度100rpm，发酵6h后开始流加补料培养基(葡萄糖，115℃灭菌30min)，发酵20-24h，测定发酵液中活菌数为3.13
×
10
10
cfu/ml。
[0093]
其中，培养的ph值为6.5-7.5。
[0094]
纳豆芽孢杆菌高密度发酵工艺优化
[0095]
(1)不同发酵培养基初始ph对纳豆芽孢杆菌高密度发酵活菌数的影响
[0096]
纳豆芽孢杆菌高密度发酵方法同实施例1，其中，发酵培养基初始ph分别调至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，发酵完成后，测定活菌数和芽孢数，结果显示，发酵培养基初始ph为7.0时发酵效率更快，发酵水平更高。高密度发酵初始ph优化实验如下：
[0097]
[0098]
(2)不同接种量对纳豆芽孢杆菌高密度发酵活菌数的影响
[0099]
纳豆芽孢杆菌高密度发酵方法同实施例1，其中，接种量分别为1％，3％，5％，7％，9％，发酵完成后，测定活菌数和芽孢数，结果显示，接种量为3％时发酵效率更快，发酵水平更高。高密度发酵接种量优化实验记录如下：
[0100][0101]
(3)不同发酵温度对纳豆芽孢杆菌高密度发酵活菌数的影响
[0102]
纳豆芽孢杆菌高密度发酵方法同实施例1，其中，把发酵温度分别设为30，32，35，37，40℃，发酵完成后，测定活菌数和芽孢数，结果显示，发酵温度为35℃时发酵效率更快，发酵水平更。高密度发酵培养温度优化实验记录如下：
[0103][0104]
优化后的发酵液中活菌数分别达到2.34
×
10
11
cfu/ml，与初始未优化(3.13
×
10
10
cfu/ml)相比，提高了将近1个数量级。
[0105]
本发明的工作原理：
[0106]
高活力纳豆芽孢杆菌筛选方法通过对纳豆芽孢杆菌的菌悬液进行诱变，得到具有高活性的纳豆芽孢杆菌，再从具有高活性的纳豆芽孢杆菌中筛选出传代稳定的高活力和高芽孢率纳豆芽孢杆菌。并且通过优选发酵培养基的碳氮源、无机盐成分和优化高密度发酵方法大幅提高了纳豆芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，适用于纳豆芽孢杆菌的规模化生产。
[0107]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0108]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。