东方伊萨酵母菌株及其应用

1.本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及东方伊萨酵母菌株及其应用。


背景技术：

2.随着果酒行业的兴起和消费习惯的转变，果酒包括葡萄酒、苹果酒、樱桃酒、桃酒、火龙果酒、猕猴桃酒等被越来越多的人饮用。猕猴桃是我国近10年一直保持较高增长速度的主要水果之一，其产量和面积均为世界首位，其常见的加工品猕猴桃果酒在市场认可度和附加值较高。在猕猴桃酒中，有机酸是影响猕猴桃酒质量一个非常重要的因素，其特有的酸味和口感是果酒的主要呈味物质，但猕猴桃果酒的有机酸往往过高，且常常伴随酒体粗糙失光、浑浊等不良现象。例如，海沃德猕猴桃汁中柠檬酸9.19g/l，占总酸含量的67.7％，苹果酸3.66g/l，酒石酸1.63g/l，酸含量过高。因此分析猕猴桃酒中有机酸成分、通过有效的技术使猕猴桃酒中有机酸含量适宜尤为重要，目前，生物降酸是现代果酒绿色酿造的重要发展方向，但关于微氧环境对东方伊萨酵母降酸菌株发酵特性以及有机酸代谢的影响研究较少。
3.目前，猕猴桃酒降酸方法应用最广泛的为化学降酸。其中，化学试剂降酸法其降酸剂及其用量是关键，不适用于猕猴桃酒降酸且不利于满足消费者追求天然、无化学添加的新消费需求，物理降酸因成本高昂，应用并不普遍，仅在少数酿酒业发达且能源充足的国家使用，因此利用生物降酸是现代果酒降酸研究和发展方向，但关于微氧环境对东方伊萨酵母降酸菌株发酵特性以及有机酸代谢的影响研究较少，酿造过程中常用的有乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵达到降酸目的，但主要针对苹果酸较高的酒体，且乳酸菌在低ph、高乙醇环境下生长和发酵缓慢，加之商业乳酸菌剂成本高，制约了乳酸菌的广泛应用，故如何筛选出具有降解柠檬酸能力和良好发酵性能的酵母菌株、有效降低果酒中的柠檬酸含量是果酒生产上的技术难题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供东方伊萨酵母菌株及其应用。
5.本发明提供了保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母。其为具有柠檬酸降解能力的东方伊萨酵母菌株。所述的东方伊萨酵母，是从宁夏贺兰山葡萄园采摘的葡萄经自然发酵后筛选、分离而获得的纯培养物。
6.本发明的东方伊萨酵母，保藏编号为cgmcc no.24252，分类命名：东方伊萨酵母issatchenkia orientalis)与酿酒酵母具有相近的生长能力，具有优良的发酵性能，能独立完成果酒发酵，具有多重环境耐受性。在有氧环境下能够更高效地完成发酵，且具有更高的酸降解率，产生更多的酯类物质，还能赋予猕猴桃果酒热带水果和柑橘类的香气特征。因此，该东方伊萨酵母菌株是一株非常优秀的具有降酸能力且可以高效发酵果酒的非酿酒酵母菌株。
7.本发明还提供了保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母在酿造果酒中的应
用。
8.本发明所述的应用中，所述果酒包括低柠檬酸果酒。所述低柠檬酸果酒包括：低柠檬酸猕猴桃酒、低柠檬酸葡萄酒、低柠檬酸苹果酒、低柠檬酸樱桃酒、低柠檬酸水蜜桃酒和/或低柠檬酸火龙果酒。
9.本发明还提供了酿造果酒的发酵剂，其包括保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母。
10.本发明还提供了所述发酵剂的制备方法，其包括培养保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母，收集菌体。
11.本发明所述的制备方法中，所述收集菌体后，还包括重悬菌体制备菌悬液的步骤；或者还包括将菌体与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉的步骤。
12.本发明提供了一种果酒，其原料包括：保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母和水果。
13.本发明所述的果酒中，所述水果包括：猕猴桃、葡萄、苹果、樱桃、水蜜桃和/或火龙果。
14.本发明所述的果酒中，所述果酒的酸度为10g/l～15g/l、酯类含量1g/l～3g/l、酒精度为7％vol～10％vol。
15.一些实施例中，所述果酒的总酸为13.71g/l；酯类物质主要为乙酸乙酯，含量约1.58g/l；酒精度为8.7％vol，醇类物质主要为β-苯乙醇，为果酒提供清甜的玫瑰花香。
16.本发明还提供了所述果酒的酿造方法，其包括以保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母为菌种进行发酵。一些实施例中，所述发酵按1
×
106cells/ml的接种量接入酵母菌种子液，分别在20℃下通氧(1.5l/min，24h)后静置发酵(1d)和不通氧静置条件下进行酒精发酵。
17.本发明提供的所述酿造方法，其还包括通氧的步骤，所述通氧的条件包括通氧泵通氧，1.5l/min。
18.本发明还提供的所述的酿造方法中，所述通氧后保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母的柠檬酸降解率为20％～25％。一些实施例中，东方伊萨酵母的柠檬酸降解率为22.9％。
19.本发明还提供了一种提高保藏编号为cgmcc no.24252的东方伊萨酵母在果酒酿造中降酸效果的方法，其包括酿造时通氧。一些实施例中，通氧1天实验组中ceca所得猕猴桃酒的总酸含量为14.96g/l，柠檬酸含量为8.14g/l，总酸降解率为5.56％，柠檬酸降解率为11.8％；不通氧(静置)实验组中ceca所得猕猴桃酒的总酸含量为15.21g/l，柠檬酸含量为8.37g/l，总酸降解率为3.98％，柠檬酸降解率为9.32％。东方伊萨酵母实验组的总酸和柠檬酸含量较ceca均有显著差异(p＜0.01)，通氧1d的实验组中东方伊萨酵母所得猕猴桃酒的总酸含量为13.41g/l，柠檬酸含量为7.12g/l，总酸降解率为15.34％，柠檬酸降解率为22.9％；不通氧(静置)实验组总酸含量为14.01g/l，柠檬酸含量为7.59g/l，总酸降解率为11.56％，柠檬酸降解率为17.77％。可见通氧可以提高果酒酿造中降酸的效果。
20.本发明利用通氧技术提高东方伊萨酵母在猕猴桃果酒酿造中的降酸效果。为了评价猕猴桃果酒的香气水平，品尝小组由10名葡萄酒专业的学生(5男，5女)组成，对成酒进行感官品鉴，感官分析前对品尝小组进行标准香气物质闻香培训感官分析试验采用随机区组
设计，要求品评员用标准香气特征中的3～4个特征词汇来描述葡萄酒的香气特征，并用“五点标度法”量化(1为弱；2为较弱；3为中等；4为较强；5为强)。香气特征的量化强度值(mf，％)为该特征词汇的使用频率(f，％)和强度平均值(i，％)的几何平均数，用如下公式计算：
21.感官分析得出的公式酒样中5种典型的香气特征。其中，酿酒酵母处理酒样中温带酸果类强于非酿酒酵母处理酒样，不通氧处理酒样中温带酸果类香气强于微通氧处理。与对照相比，东方伊萨酵母菌株微通氧处理显著(p＜0.05)降低了温带酸果类香气，提升了柑橘、热带水果和花香特征。
22.本发明筛选降酸酵母菌株，探究菌株的生物学特性和发酵性能，设置不同氧气环境优化猕猴桃酒酿造工艺，以期获得高效降解柠檬酸的菌株及降解猕猴桃果酒的最佳酿造工艺，旨在为猕猴桃果酒产业降酸的应用奠定理论基础。通过gc-ms对不同发酵工艺获得的猕猴桃果酒进行香气成分物质含量的测定，猕猴桃果酒中共检测到重要香气物质59种。猕猴桃酒的主要香气物质为酯类物质，共有23种；第二为醇类物质，为20种；酸类物质为7种；醛类3种。不同氧气环境下东方伊萨酵母菌株的pca1与pca2分别占了总方差的53.3％和24.93％，两个方差累计贡献78.56％。反映出东方伊萨酵母在不同氧气条件下发酵猕猴桃酒酒样间的香气差异。其中，东方伊萨酵母通氧发酵处理组的酯类香气和醇类香气丰富，而静置(未通氧)发酵处理组附近香气聚集物质较少。说明微通氧发酵猕猴桃酒不仅可以提高发酵速率，增强酵母降酸能力，还可改善酒体风味物质，提升果酒品质和口感。
23.本发明的目的为了改善我国猕猴酒有机酸含量过高的局面，解决国产高酸果酒的质量和风味问题，提供一种具有降酸能力且发酵性能良好的非酿酒酵母及其在猕猴桃酿造过程的高效应用。
24.本发明发现东方伊萨酵母菌株与酿酒酵母具有相近的生长能力，能够独立完成发酵。相对于其他非酿酒酵母发酵能力不足的特点，本发明菌株可以独立完成果酒发酵，不需要与酿酒酵母进行混合发酵。并且通氧作为较新颖的发酵工艺，可以更好地提升该酵母的性能。本发明突出创新点为微通氧提高酵母降酸率，东方伊萨酵母菌株在有氧环境下能更高效地完成发酵，且具有更高的酸降解率。将东方伊萨菌株用于猕猴桃果酒发酵，以商业化的酿酒酵母菌株ceca为对照，在相同发酵条件下，菌株ceca基本不具有降酸能力，而东方伊萨酵母在不通氧条件下的柠檬酸降解率为17.77％，通氧条件下柠檬酸降解率为22.9％，相比不通氧提高了22.4％，并且改善了猕猴桃果酒口感，赋予了猕猴桃果酒热带水果类和柑橘类的香气特征。而发酵香气方面，东方伊萨酵母发酵组酯类物质(酯类物质是果酒风味的关键物质)要显著高于酿酒酵母发酵组。因此，该菌株具有良好的生长能力和发酵性能，在猕猴桃果酒产业乃至其他各种果酒产业中具有较好的应用潜力与前景。
25.生物保藏说明
26.生物材料：gs1-1，分类命名：东方伊萨酵母issatchenkia orientalis，于2022年1月05日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24252。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
28.图1示东方伊萨酵母在wln培养基上的菌落特征；
29.图2示猕猴桃果酒发酵工艺流程简图；
30.图3示猕猴桃酒感官量化分析结果；
31.图4示不同氧气环境下猕猴桃酒主要香气成分载荷图及分布图。
具体实施方式
32.本发明提供了东方伊萨酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
33.下述实施例中的ypd培养基配方如下：
34.蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖2％(自然ph，121℃灭菌15min，固体培养基添加琼脂2％)。
35.下述实施例中的柠檬酸培养基配方如下：
36.蛋白胨2％，1％酵母浸粉，1％柠檬酸(自然ph，121℃灭菌15min)。
37.下述实施例中的wln培养基配方如下：
38.蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.4％，葡萄糖5.0％，琼脂2.0％；储液a：40ml/l，储液b：1ml/l，储液c：1ml/l，调ph值至6.2。无机盐类储液配置：储液a(磷酸二氢钾0.0550％，氯化钾0.0425％，氯化钙0.0125％，硫酸镁0.0125％，高压灭菌后4℃保存)；储液b(氯化铁0.0025％，硫酸锰0.00025％，高压灭菌后4℃保存)；储液c(溴甲酚绿22mg/l，溶于50％酒精，配制溶液所用器皿和双蒸水都需经121℃高压灭菌)。配制培养基时在无菌操作台内，按比例加入储液a和储液b及其他培养基组分，加双蒸水至目标体积，调节ph至6.2。121℃灭菌20min后冷却至65℃加入储液c，混合均匀，制备平板(每板15ml～20ml)。
39.下述实施例中的模拟葡萄汁配方如下：
40.ergo stock：12.5ml tween80，37.5ml95％乙醇，0.125g麦角固醇；
41.溶液a：375ml去离子水中加100g葡萄糖，4ml ergo stock，溶解后去离子水补充到500ml；
42.溶液b：250ml去离子水中加10g柠檬酸；
43.溶液c：250ml去离子水中加1.7gynb(无氨基酵母氮源)，2g水解酪蛋白，6mg肌醇，0.2g无水氯化钙，0.8g l-精氨酸，1g l-脯氨酸，0.1g色氨酸，1g磷酸铵；
44.将a、b、c溶液混合之后，用氢氧化钾调节ph至3.25，过滤除菌。
45.下述实施例中的对照菌株均为安琪酵母股份有限公司本土商业活性干酵母saccharomyces cerevisiae ceca。
46.本发明所述菌株26s d1/d2区序列(586bp)(seq id no.1)：
[0047][0048][0049]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050]
实施例1东方伊萨酵母(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.24252)的分离、纯化与鉴定
[0051]
采摘宁夏贺兰山葡萄园的葡萄果实，在自然发酵过程中取发酵液，在发酵液样品中加无菌水进行梯度稀释，并将稀释液涂布于wln培养基平板上，在温度30℃下培养4-5d，根据酵母在wln培养基上的菌落特征，进一步在wln培养基上纯化(参照图1)。在纯化后的wln培养基上挑取单菌落转接入ypd培养基中，于30℃，150rpm培养后采用甘油冷冻法保藏备用。同时，提取酵母dna，对rdna基因的26s d1/d2区进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，对pcr扩增产物(即rdna基因的26s d1/d2区)进行测序，测序结果与ncbi上的nuleotide collection(nr/nt)数据库进行序列比对，鉴定为东方伊萨酵母。
[0052]
东方伊萨酵母(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.24252)的26s rrna鉴定结果如下：
[0053]
26s d1/d2区序列(586bp)(seq id no.1)：
[0054]
[0055][0056]
与相关模式菌株东方伊萨酵母比对相似性为99.8％，鉴定为东方伊萨酵母issatchenkia orientalis。
[0057]
实施例2东方伊萨酵母降酸能力、发酵性能与商业酿酒酵母ceca比较实验
[0058]
2.1东方伊萨酵母降酸能力试验
[0059]
将冻存于甘油管中的伊萨属酵母菌株划线于ypd固体培养基进行纯化培养，在28℃下培养48h后挑取单个菌落与ypd液体培养基，在28℃，180rpm下培养24h制备菌悬液。将制备好的菌悬液以1
×
106cells/ml接种量接种于装有5ml柠檬酸培养基的试管中，于28℃，150rpm条件下培养6d，每组3个平行。总酸测定参照gb/t15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法测定，采用naoh滴定法测定总酸含量(以柠檬酸计)。根据培养前、后总酸质量浓度差计算总酸降解率，酿酒酵母ceca作为对照菌株。根据菌株总酸降解率的结果，筛选出具有最佳柠檬酸降解率的菌株。
[0060][0061]
式中，c1为培养前柠檬酸质量浓度；c2为培养后柠檬酸质量浓度。
[0062]
通过试验发现东方伊萨菌株降酸率达到65％，显著高于酿酒酵母ceca的降酸率。
[0063]
2.2东方伊萨酵母发酵性能试验
[0064]
将菌株按1
×
106cells/ml接种于模拟葡萄汁中，分别于25℃、150rpm和静置条件下发酵，每隔24h取样监测600nm下的吸光值和还原糖含量，分析试验菌株的发酵性能及降酸能力每组重复3次。发酵结束后测定酒精度、挥发酸等指标，结果见表1。利用最小显著差异法(least-significantdifference，lsd)进行差异显著性检验，p＜0.01表示差异极显著，p＜0.05表示差异显著。
[0065]
氧分子(o2)是酒精发酵过程中必不可少的营养因子，因为酵母细胞需要氧气才能产生固醇和不饱和脂肪酸，从而显着影响酵母发酵能力和活力。氧气的另一个有益作用是，它可以改变葡萄酒的化学和香气成分。为验证筛选菌株在不同氧环境下的发酵性能，以1
×
106cells/ml接种量将其接种于模拟葡萄汁triple m中，以商业化的酿酒酵母ceca作为对照菌株，在25℃下，150rpm和静置条件下恒温发酵。筛选菌株在摇瓶和静置条件下均可完成发酵，摇瓶条件下，发酵速率与ceca相近，生物量始终高于ceca。而静置条件下，发酵速率慢于对照组，生物量始终显著低于对照菌株(p＜0.01)。结果表明，在不同氧气环境下，酵母生长能力和发酵速率有明显差异，微氧可以提高发酵速率。
[0066]
表1：测试菌株在不同氧气环境下发酵的各项理化指标*
[0067][0068]
注：*理化指标的检测均按照gb/t 15038-2006，#p＜0.01。
[0069]
东方伊萨菌株和ceca在不同氧气环境下发酵模拟葡萄汁的各理化指标如表1所示，模拟葡萄汁初始总酸(以柠檬酸计)为12.374g/l，残糖至2g/l以下视为发酵结束。在不同氧气环境下两菌株均可完成发酵，挥发酸含量在0.07-0.28g/l之间，符合国标gb/t 15038-206，属于较低水平。其中，东方伊萨菌株在两种环境下均可降解柠檬酸，在有氧环境下该菌株柠檬酸降解率为24.2％，高于静置条件下发酵(11.6％)，二者酸含量差异极显著(p＜0.01)，而ceca的总酸不降反增，ph值与酸含量变化一致。
[0070]
实施例3东方伊萨酵母与商业酿酒酵母ceca在不同氧气环境下发酵猕猴桃酒试验比较
[0071]
下述实施例的工艺流程简图见图2。
[0072]
将来自陕西省眉县猕猴桃基地的海沃德猕猴桃去皮、打浆、榨汁，按照20μl/l添加so2，加入果胶酶(0.02ml/kg)，调整糖度至170g/l，分装入1l的玻璃发酵罐，每个瓶装500ml发酵液。按1
×
106cells/ml的接种量接入酵母菌种子液，分别在20℃下通氧(1.5l/min，24h)后静置发酵(1d)和不通氧静置条件下进行酒精发酵。期间每隔24h测定还原糖含量，发酵结束后，测定酒度、挥发酸、残糖和有机酸等理化指标。
[0073]
3.1两菌株猕猴桃酒发酵的各项理化指标
[0074]
猕猴桃酒初始总酸为15.84g/l，柠檬酸含量为9.23g/l，残糖至4g/l以下视为发酵结束。在不同氧气环境下，两菌株均可完成发酵，挥发酸含量在0.23-0.71g/l之间，非酿酒酵母发酵组前期通氧所得猕猴桃酒挥发酸(以乙酸计)高于静置发酵组，而对照酿酒酵母发酵组前期通氧所得猕猴桃酒挥发酸相比静置组略升高，发酵期间通氧通常会增加酒体挥发酸的含量，但各菌株之间存在差异，本发明所述东方伊萨菌株在微通氧条件下会降低挥发酸含量。发酵结束后，菌株ceca对照组总酸和柠檬酸含量略有减少，通氧1d实验组中ceca所得猕猴桃酒的总酸含量为14.96g/l，柠檬酸含量为8.14g/l，总酸降解率为5.56％，柠檬酸降解率为11.8％；不通氧(静置)实验组中ceca所得猕猴桃酒的总酸含量为15.21g/l，柠檬酸含量为8.37g/l，总酸降解率为3.98％，柠檬酸降解率为9.32％。东方伊萨酵母实验组的总酸和柠檬酸含量较ceca均有显著差异(p＜0.01)，通氧1d的实验组中东方伊萨酵母所得猕猴桃酒的总酸含量为13.41g/l，柠檬酸含量为7.12g/l，总酸降解率为15.34％，柠檬酸降解率为22.9％；不通氧(静置)实验组总酸含量为14.01g/l，柠檬酸含量为7.59g/l，总酸降解率为11.56％，柠檬酸降解率为17.77％。
[0075]
表2：菌株在不同氧气环境下猕猴桃酒发酵的理化指标*
[0076][0077]
注：*理化指标的检测均按照gb/t 15038-2006，#p＜0.01。
[0078]
3.2猕猴桃酒感官分析
[0079]
品尝小组由10名葡萄酒专业的学生(5男，5女)组成，对成酒进行感官品鉴，感官分析前对品尝小组进行标准香气物质闻香培训感官分析试验采用随机区组设计，要求品评员用标准香气特征中的3～4个特征词汇来描述葡萄酒的香气特征，并用“五点标度法”量化(1为弱；2为较弱；3为中等；4为较强；5为强)。香气特征的量化强度值(mf，％)为该特征词汇的使用频率(f，％)和强度平均值(i，％)的几何平均数，用如下公式计算：
[0080]
感官分析得出的公式酒样中5种典型的香气特征，结果见图3。其中，酿酒酵母处理酒样中温带酸果类强于非酿酒酵母处理酒样，不通氧处理酒样中温带酸果类香气强于微通氧处理。与对照相比，东方伊萨酵母菌株微通氧处理显著(p＜0.05)降低了温带酸果类香气，提升了柑橘、热带水果和花香特征。
[0081]
3.3猕猴桃酒挥发性物质
[0082]
通过gc-ms对不同发酵工艺获得的猕猴桃果酒进行香气成分物质含量的测定，结果见表3，猕猴桃果酒中共检测到重要香气物质59种。猕猴桃酒的主要香气物质为酯类物质，共有23种；第二为醇类物质，为20种；酸类物质为7种；醛类3种。不同氧气环境下东方伊萨酵母菌株的pca1与pca2分别占了总方差的53.3％和24.93％，两个方差累计贡献78.56％(见图4)。反映出东方伊萨酵母在不同氧气条件下发酵猕猴桃酒酒样间的香气差异。其中，东方伊萨酵母通氧发酵处理组的酯类香气和醇类香气丰富，而静置发酵处理组附近香气聚集物质较少。酸类物质主要分布在第二象限，围绕在静置发酵处理组。微通氧发酵猕猴桃酒不仅可以提高发酵速率，增强酵母降酸能力，还可改善酒体风味物质，提升果酒品质和口感。
[0083]
表3：两菌株发酵猕猴桃酒香气物质
[0084]
[0085]
[0086]
[0087][0088]
注：表格中含量为相对含量，标有*的物质在酒样中的浓度单位为mg/l。
[0089]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。