一种RSV重组抗原、其制备方法及应用与流程

一种rsv重组抗原、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种rsv重组抗原、其制备方法及应用。


背景技术：

2.呼吸道合胞病毒(rsv)是导致婴幼儿(2岁以下)和易感成人下呼吸道感染的最主要的病原体，可以引起严重的毛细支气管炎和间质性肺炎等，严重时可致婴幼儿死亡，并且也容易产生再次感染的情况。
3.rsv感染最重要的诊断方法是对病毒进行分离，分离出病毒即可确诊，目前主要采取病人鼻咽棉拭子或咯痰进行病毒分离培养。rsv不能在鸡胚内增殖，只能在人和猴细胞，诸如如hep-2、hela等细胞株中培养增殖，约培养2～3周才出现细胞界线不清、融合成多核巨细胞等的细胞病变，病毒通过出芽释放。然后用合胞病毒的免疫血清作中和试验或补体结合试验进行鉴定。尽管病毒分离是确诊的可靠依据，但病毒生长较慢，不能及时诊断。
4.近年来多采用临床快速诊断法，例如，采取患儿咽部脱落细胞及血清中igm抗体的间接法免疫荧光技术，elisa，碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(apaap)，生物素抗生物素elisa法等都能进行合胞病毒感染的快速诊断，用直接或间接免疫荧光法染色进行检查，检测rsv感染的阳性细胞，阳性符合率可达90％以上，但是，免疫抗原的灵敏度和特异性直接影响检验结果，而且，现有技术存在假阳性多发，以及与其他副粘科病毒产生交叉反应，灵敏度低等缺陷。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种rsv重组抗原，该重组抗原具有特异性好、灵敏度高的特点，从而能够克服现有技术所存在的假阳性等问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种rsv重组抗原，包含有呼吸道合胞病毒f蛋白从n-末端第34位到第1377位的1344个氨基酸以及g蛋白从n-末端第84位到第256位的173个氨基酸。
8.作为优选，所述rsv重组抗原，从n-末端到c-末端依次含有呼吸道合胞病毒g蛋白从n-末端第84位到第256位的173个氨基酸以及f蛋白从n-末端第34位到第1377位的1344个氨基酸。
9.作为优选，所述rsv重组抗原，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
10.本发明提供了一种重组表达载体，是将编码上述rsv重组抗原的基因序列重组到表达载体中获得。在上述重组表达载体中，所述表达载体的选择并不局限，可优选为pet28a质粒等。
11.本发明提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌转化有上述重组表达载体，其中，重组工程菌的宿主菌并不局限，可优选为大肠杆菌bl21(de3)。
12.本发明提供了一种上述rsv重组抗原的制备方法，具体步骤如下：
13.对f蛋白和g蛋白氨基酸序列进行分析，保留免疫原性较强的片段部分，对该部分
片段进行密码子优化，得到优化后的核苷酸序列；在优化后的核苷酸序列两端加入bamhⅰ和sacⅰ酶切位点，并进行合成；用bamhⅰ酶和sacⅰ酶分别对合成的核苷酸序列和表达载体双酶切，回收酶切产物；将回收的核苷酸序列和表达载体用t4连接酶进行连接，得到连接产物，即重组表达载体；将重组表达载体转化宿主菌，涂布于含抗生素的平板筛选阳性工程菌；将阳性重组工程菌株用iptg诱导蛋白表达；采用ni柱亲和层析法纯化，获得rsv重组抗原。
14.上述rsv重组抗原可应用于呼吸道合胞病毒抗体的检测。本领域技术人员可根据本发明公开内容和相关常识，利用上述rsv重组抗原制备检测试剂盒，并用于快速检测呼吸道合胞病毒。
15.在此基础上，本发明提供了一种rsv检测试剂盒，其诊断抗原为上述rsv重组抗原。
16.本发明的有益效果为：
17.本发明将呼吸道合胞病毒f蛋白和g蛋白的特定肽段作为诊断抗原，可避免与其他副粘科病毒产生交叉反应，大大提高了重组抗原的灵敏度，降低了假阳性概率。同时，本发明还提供了一种采用原核表达体系获取呼吸道合胞病毒的重组抗原的方法，优化其基因结构，成功建立了抗原的可溶性表达技术。在本发明所提供的操作条件下，可以获得占总表达蛋白40％-50％的重组抗原，且分离纯化只需要一次亲和层析，生产成本低，蛋白纯度高、易于大量生产，在生物、医药领域具有十分广阔的应用前景。
附图说明
18.图1为f蛋白疏水区预测图；
19.图2为g蛋白疏水区预测图；
20.图3为重组质粒双酶切鉴定图；其中，1是核酸mark，2、3是用bamhⅰ和sacⅰ双酶切后的核苷酸序列和载体；
21.图4为不同诱导温度蛋白表达电泳图；其中，1是37℃诱导表达图，2是30℃诱导表达图，3是25℃诱导表达图
22.图5为表达重组蛋白纯化图；其中，m是蛋白mark，1是上柱前样品，2为上柱之后样品，3为洗杂样品，4为60mm咪唑洗脱样品，5为100mm咪唑洗脱样品，6为500mm咪唑洗脱样品，7为1000mm咪唑洗脱样品。
具体实施方式
23.rsv是一种rna病毒，属于副粘病毒科。有圆形和丝状两种状态，有囊膜，囊膜表面有两种糖蛋白刺突：g蛋白和f蛋白，g蛋白和f蛋白是rsv病毒中显著的中和抗原。g蛋白能使rsv吸附于宿主细胞上导致感染开始；g蛋白的胞外区由两个变异很大的基序组成，二者中间是一个保守片段；变异区的氨基酸在不同毒株中变化很大；g蛋白还有帮助呼吸道合胞病毒逃避宿主免疫的功能，中间保守区也能阻止一些tlrs的激活。f蛋白被宿主蛋白酶切割成f1和f2两个片段后才具有活性；有功能的f蛋白在病毒的包膜上以融合前的构象形成稳定的三聚体，这个三聚体极有可能像新冠状病毒s蛋白一样参与受体的结合；f蛋白与其他副粘科病毒有很高的同源性，基因组的保守性很高。rsv存在a、b两个亚型，经单克隆抗体和基因序列分析，两型的抗原主要差异在g蛋白，不同亚型氨基酸同源性只有50％，而f蛋白氨基酸同源性则有89％。
24.为此，本发明的设计思路如下：
25.本发明以呼吸道合胞病毒g蛋白和f蛋白为基础，通过生物信息学软件对g蛋白(ncbi序列号yp-aar14269.1)和f蛋白(ncbi序列号yp-apw78903.1)氨基酸序列进行分析，将筛选得到的优势抗原表位按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位融合抗原；同时，进行密码子优化，合成该蛋白的核酸序列，构建高效原核表达载体，纯化高纯度的重组蛋白。
26.本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明所制备或者所述的融合蛋白，即为rsv重组抗原。此外，本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
27.菌种与质粒：宿主菌bl21(de3)，质粒pet28a，购自大连宝生物(takara)工程有限公司。分子生物学试剂：限制性内切酶bamhⅰ和sacⅰ，t4连接酶购自takara；质粒纯化试剂盒及dna片段琼脂糖凝胶回收试剂盒购自德国qiagen；iptg购自promega；其他试剂为进口或者国产分析纯试剂。基因合成和dna序列测序由上海生工公司完成。基因克隆方法：dna酶切、连接、电泳；质粒的提取纯化；蛋白的sds-page分析等一般的分子克隆方法按常规方法进行。其他试剂盒按说明书进行。
28.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
29.实施例1
30.rsv重组抗原的制备，步骤如下：
31.(1)rsv优势抗原表位的筛选
32.根据ncbi中已公布的rsv两种蛋白(g蛋白和f蛋白)的氨基酸序列，利用expasy、uniprot等在线分析工具得到蛋白的二级结构和三级结构域，结合bepipred linear epitope prediction 2.0分析结果，筛选出特异性线性抗原f蛋白(34aa-1377aa)、g蛋白(84aa-256aa)。f蛋白和g蛋白的bepipred linear epitope prediction 2.0分析结果分别如图1和图2所示。
33.其中，g蛋白(84aa-256aa)位于g蛋白从n-末端第84位到第256位的173个氨基酸，f蛋白(34aa-1377aa)位于f蛋白从n-末端第34位到第1377位的1344个氨基酸。
34.(2)目的基因插入表达载体
35.将编码上述优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联，其具体顺序为g蛋白(84aa-256aa)、f蛋白(34aa-1377aa)，构建含有2个多表位的融合抗原基因，如seq id no:2所示。经过稀有密码子在线软件对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌的稀有密码子。最后进行rsv特异性融合蛋白抗原核苷酸序列合成，核苷酸两端增加bamh和sacⅰ限制性内切位点。
36.seq id no:2：
37.taaacggcatagtttttatacatgttataacaagcagtgaagtgtgccctgataacaatattgtagtgaaatctaactttacaacaatgccaatattacaaaacggaggatacatatgggaattgattgagttgacacactgctctcaattaaatggtctaatggatgataattgtgaaatcaaattttctaaaagactaagtgactcagtaatgactgattatatgaatcaaatatctgatttacttgggcttgatctcaattcatgaattgtgtttagtctaattcaatagacatgtg
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38.利用bamhⅰ和sacⅰ对上述步骤合成的特异性核苷酸序列及表达载体pet28a进行双酶切，酶切反应体系为：bamhⅰ(1μl)、sacⅰ(1μl)、10
×
quickcut buffe(1μl)、特异性核苷酸(7μl)、37℃酶切2h，反应结束经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分离酶切片段，按照胶回收试剂盒的要求回收基因片段待用。将胶回收的特异性核苷酸序列和表达载体加入连接反应体系，连接反应体系为：特异性核苷酸(2μl)、线性化载体(2μl)、t4 dna ligase(1μl)、10
×
t4 dna ligase buffer(1μl)，16℃连接2h。连接后即为重组表达载体。
39.(3)重组表达载体的转化
40.取10μl重组表达载体加入到100μl大肠杆菌bl21(de3)中，轻轻混匀，置于冰上放置30min；在42℃条件下热休克90s，迅速放入冰上，冰浴3min；加入500μl lb液体培养基，在37℃、180rpm条件下温育1h；将转化菌液在常温、5000rpm条件下离心10min，吸去部分上清培养基，剩余约100μl混匀，涂布于含有抗生素的lb平板上，在37℃下培养过夜。
41.(4)双酶切验证重组质粒及测序
42.挑取阳性克隆接种于2ml含有卡那霉素的lb培养基中，在37℃、220rpm条件下过夜培养至菌液浊。按质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，取10μl回收样品进行双酶切。酶切完毕的样品进行1％琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。然后将初步验证正确的菌株摇菌，并将菌液送往公司测序，作进一步的鉴定，酶切鉴定图如图3所示，挑取的2个单克隆菌株全是阳性，质粒构建成功。
43.(5)重组载体表达及其表达条件筛选
44.用10μl枪头挑取平板上生长的单菌落接种于含有lb培养基的试管中，在37℃、220rpm条件下培养过夜，取200μl试管中生长的菌液至灭菌的含有2ml lb培养基的试管中，在37℃、220rpm条件下培养至od值约0.6，诱导表达。分别对iptg浓度、时间作对照设置实验组，确定最佳表达条件。收集菌落进行sds-page，鉴定目的蛋白在大肠杆菌bl21中表达情
况。
45.试验结果如表1所示：
46.表1
[0047][0048][0049]
由表1可知，该工程菌诱导表达最合适的iptg诱导浓度为0.4mm/l，诱导时间为4.5h。
[0050]
外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，容易形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别，这种非结晶、无定形的蛋白质聚集体被称为“包涵体”，包涵体不具备生物学活性。为了明确目的蛋白的产生形式是上清还是包涵体，采取如下步骤进行鉴定：
[0051]
将表达菌体进行超声破碎，超声功率为3w，工作时间为超声2秒，停3秒，总时间5分钟，整个超声过程中探头伸入离ep管液面0.5cm为佳，ep管置于冰浴中，菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。然后在4℃、10000rpm条件下离心2min，然后将上清取出，沉淀用相同体积的pbs重悬，上清和沉淀分别取样15μl，加入5μl的4
×
sds loading buffer，在水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，分别点样10μl，进行sds-page检测，根据试验结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，结果显示目的蛋白主要是上清表达。
[0052]
为了确定上清表达的最适温度，设置诱导表达温度25℃、30℃、37℃三组对照。试验结果如图4所示，结果表明，最适合上清表达的温度为25℃。
[0053]
(6)rsv重组抗原的纯化
[0054]
挑取单克隆菌株接种于10ml含卡那霉素的lb培养液中，在37℃、220r/min条件下，通气过夜培养，得到过夜培养物。取5ml过夜培养物接种于500ml含有卡那霉素的lb培养液，在1l的锥形瓶中，以0.4mm iptg诱导菌株表达，诱导温度30℃，220rpm，通气培养5h，然后收集菌液，在4℃、9000rpm条件下离心15min，收集沉淀，-20℃保存备用。将每2g菌体沉淀用30ml超声破碎液充分重悬，超声破碎液由50mm nah2po4·
2h2o和500mm nacl组成，ph＝7.6，然后进行超声破碎，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平，工作功率为5％，工作时间为超2秒，停3秒，总时间15min，烧杯置于冰浴中，最后将细菌破碎液以4℃、90000r/min的条件离心15min，收集上清，得到破碎细菌上清。取2ml镍nta琼脂糖凝胶ff预装柱，用30ml平衡缓冲液平衡，将破碎细菌上清用0.45微米微孔滤膜过滤，然后以0.5ml/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上，用30ml的超声破碎液洗去未吸附的样品，流速1ml/min，依浓度梯度分别用30ml的wash buffer(包括30mm咪唑、50mm nah2po4·
2h2o、500mm nacl，ph＝7.6)洗去未吸附的样品，流速2ml/min，然后用15ml elution buffer(包括60mm咪唑、50mm nah2po4·
2h2o、500mm nacl，ph＝7.6)以2ml/min流速将目的蛋白洗脱下来，再依次用含100mm咪唑、500mm咪唑、1000mm咪唑的elution buffer洗脱目的蛋白，获得rsv重组抗原，或称融合蛋白；如图5所示。目的蛋白洗脱下来后，可以用50ml的纯水冲洗柱子，然后用20％乙醇封闭柱子，以备下次使用。
[0055]
rsv重组抗原的氨基酸序列，如seq id no:1所示：
[0056]
seq id no:1：
[0057]
ptyfqsllmtyksmssseqiattnllkkiirraieisdvkvyailnklglkekdrvkpnnnsgdensvlttiikddilsavennqsytnsdknhsvnqnitikttllkklmcsmqhppswlihwfnlytklnniltqyrsnevkshgfilidnqtlsgfqfilnqygcivyhkylfngpylkndytnlisrqspliehmnlkkltitqslisryhkgelkleeptyfqsllmtyksmssseqiattnllkkiirraieisdvkvyailnklglkekdrvkpnnnsgdensvlttiikddilsavennqsytnsdknysvnqnisikttllkklmcsmqhppswlihwfnlytklnniltqyrsnevkshgfilidnqtlsgfqfilnqygcivyhkglkkittttynqfltwkdislsrlnvclitwisnclntlnkslglrcgfnnvvlsqlflygdcilklfhnegfyiikevegfimslilniteedqfrkrfynsmlnnitdaaikaqkdllsrvchtlldktvsdniingkwiillskflkliklagdnnlnnlselyflfrifghpmvderqamdavrincnetkfyllsslstlrgafiyriikgfvntynrwptlrnaivlplrwlnyyklntypslleitendliilsglrfyrefhlpkkvdlemiindkaisppkdliwtsfprnympshiqnyieheklkfsesdrsrrvleyylrdnkfnecdlyncvvnqsylnnsnhvvsltgkerelsvgrmfamqpgmfrqiqilaekmiaenilqffpesltrygdlelqkilelkagisnksnryndnynnyiskcsiitdlskfnqafryetscvcsdvldelhgvqslfswlhltiplvtiictyrhappfikdhvvnlnevdeqsglyryhmggiegwcqklwtieaislldlislkgkfsitalingdnqsidiskpvrliegqthaqadyllalnslkllykeyagighklkgtetyisrdmqfmsktiqhngvyypasikkvlrvgpwintilddfkvslesigsltqeleyrgesllcslifrniwlynqialqlrnhalcnnklyldilkvlkhlktffnldsidtalslymnlpmlfgggdpnllyrsfyrrtpdflteaivhsvfvlsyytghdlqdklqdlpddrlnkfltcvitfdknpnaefvtlmrdpqalgserqakitseinrlavtevlsiapnkifsksaqhyttteidlndimqnieptyphglrvvyeslpfykaekivnlisgtksitnilektsaidttdinratdmmrknitllirilpldcnkdkrellslenlsitelskyvrerswslsnivgvtspsimftmdikyttstiasgiiiekynvngltrgergptkpwvgsstqekktmpvynrqvltkkqrdqidllakldwvyasidnkdefmeelstgtlglsyekakklfpqylsvnylhrltvssrpcefpasipayrttnyhfdtspinhvltekyg
[0058]
实施例2
[0059]
rsv重组抗原的应用，如下所示：
[0060]
本发明试剂盒结构与现有技术中试剂盒的结构相同，均包括包被抗原的硝酸纤维素膜与荧光素标记的鼠抗人igg的释放垫以及其他常规试剂，其中，包被抗原为实施例1中纯化的融合蛋白。
[0061]
本发明试剂盒采用干式荧光层析技术及捕获法原理检测样本中呼吸道合胞病毒抗体的浓度。检测时，将样本加入到检测卡的加样孔中，样本中的呼吸道合胞病毒抗体和荧光标记鼠抗人igg发生免疫反应从而形成免疫结合物，免疫结合物层析至检测卡t线时，被t线的呼吸道合胞病毒重组抗原捕获，样本层析至c线时，人抗呼吸道合胞病毒igg抗体和荧光标记鼠抗人igg免疫结合物被c线的羊抗鼠igg捕获，作为质控线。t线处荧光信号强度与样品中呼吸道合胞病毒igg抗体浓度呈正相关。因此，采用适用的干式荧光仪器便可检测出样本中抗呼吸道合胞病毒igg抗体的相对浓度。
[0062]
对20例临床阳性患者的血清样本进行检测后，结果显示，20例均为阳性，灵敏度为100％。对200例健康对照血清样本进行检测，结果显示，全部为阴性，特异性为100％。
[0063]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。