一种RNA递送系统及其应用

一种rna递送系统及其应用
技术领域
1.本技术涉及生物医学技术领域，特别涉及一种rna递送系统及其应用。


背景技术：

2.rna干扰(rnai)疗法自从被发明以来，一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前途的策略，但在临床实践过程中遇到了许多问题，该疗法的发展进度远远落后于预期。
3.一般认为rna无法在细胞外长期稳定存在，因为rna会被细胞外富含的rnase降解成碎片，因此必须找到能够使rna稳定存在于细胞外，并且能够靶向性地进入特定组织的方法，才能将rnai疗法的效果凸显出来。
4.目前与sirna相关的专利很多，主要聚焦在以下几个方面：1、设计具有医学效果的sirna。2、对sirna进行化学修饰，提高sirna在生物体内的稳定性，提高产率。3、提高设计各种人工载体(如脂质纳米粒子、阳离子聚合物和质粒)，以提高sirna在体内传递的效率。其中第3方面的专利很多，其根本原因是研究人员们已经意识到目前缺乏合适的sirna传递系统，将sirna安全地、精确地、高效地输送到目标组织，该问题已经成为制约rnai疗法的核心问题。
5.公开号为cn108624590a的中国专利公开了一种能够抑制ddr2基因表达的sirna；公开号为cn108624591a的中国专利公开了一种能够沉默arpc4基因的sirna，并且对该sirna进行了α-磷-硒修饰；公开号为cn108546702a的中国专利公开了一种靶向长链非编码rna ddx11-as1的sirna。公开号为cn106177990a的中国专利公开了一种可以用于多种肿瘤治疗的sirna前体。这些专利均设计了特定的sirna并且来针对某些由基因变化引起的疾病。
6.公开号为cn108250267a的中国专利公开了一种多肽、多肽-sirna诱导共组装体，使用多肽作为sirna的载体。公开号为cn108117585a的中国专利公开了一种靶向导入sirna促进乳腺癌细胞凋亡的多肽，同样使用多肽作为sirna的载体。公开号为cn108096583a的中国专利公开了一种纳米粒子载体，该载体在包含化疗药物的同时还可以装载具有乳腺癌疗效的sirna。这些专利均为在sirna载体方面的发明创造，但是其技术方案具有一个共同特征，那就是载体和sirna均在体外预先组装，然后再引入宿主体内。事实上，目前绝大部分设计的传递技术均是如此。然而这类传递体系具有共同的问题，那就是这些人工合成的外源性传递体系很容易被宿主的循环系统清除，也有可能引起免疫原性反应，甚至可能对特定的细胞类型和组织有毒。
7.本发明的研究团队发现内源性细胞可以选择性地将mirnas封装到外泌体(exos ome)中，外泌体可以将mirna传递到受体细胞中，其分泌的mirna在相对较低的浓度下，即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫系统生物相容，并具有在体内保护和运输mirna跨越生物屏障的先天能力，因此成为克服与sirna传递相关的问题的潜在解决方案。例如，公开号为cn110699382a的中国专利就公开了一种递送sirna的外泌体的制备方法，公开了从血浆中分离外泌体，并将sirna通过电穿孔的方式封装到外泌体中的技术。
8.但是这类在体外分离或制备外泌体的技术，往往需要通过细胞培养获取大量的外泌体，再加上sirna封装的步骤，这使得大规模应用该产品的临床费用变得非常高，一般患者无法负担；更重要的是，外泌体复杂的生产/纯化过程，使其几乎不可能符合gmp标准。
9.到目前为止，以外泌体为有效成分的药物从未获得cfda批准，其核心问题就是无法保证外泌体产品的一致性，而这一问题直接导致此类产品无法获得药品生产许可证。如果能解决这一问题，则对推动rnai疗法意义非凡。
10.因此，开发一个安全、精确和高效的sirna传递系统是对提高rnai治疗效果，推进rnai疗法至关重要的一环。
11.此外，在先研究过程中，系统中的跨膜蛋白主要使用的是lamp2b，然而，lamp2b由于其结构限制，通常对于与其连接的结构大小有一定要求，故寻求一种其他的跨膜蛋白的非常必要。而且，仅仅使用lamp2b，可能会在某些时候存在来源不畅、成本高等问题，而且也为了寻找对于本技术而言更优的跨膜蛋白，因此，本发明人尝试了多种跨膜蛋白以及有类似功能的产品，最后发现cd63在多个方面或维度均有与lamp2b相似的效果，甚至优于lamp2b。该cd63通过两个跨膜域可以提高rna的表达效果，因此，对于本团队而言，也是一个非常惊喜的成果，该发现对于后期的进一步研究具有极其重要的意义，且还能增加跨膜蛋白的多样性选择，有利于后续研发和产品化。


技术实现要素：

12.有鉴于此，本技术实施例提供了一种rna递送系统及其应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
13.本技术的一个发明点为提供一种rna递送系统，该系统包括递送载体，所述递送载体携带有所需递送的rna片段和靶向基因，所述靶向基因插入编码cd63蛋白基因序列中，所述递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述rna片段的复合结构，所述复合结构能够进入并结合目标组织，以将所述rna片段送入目标组织，所述递送载体包括质粒和/或病毒。
14.进一步地，所述靶向基因包括编码rvg靶向肽、ge11靶向肽、ptp靶向肽、tcp-1靶向肽、msp靶向肽的基因。
15.进一步地，所述靶向基因插入至编码cd63蛋白基因序列的氮端第20～第60个中的任意两个相邻碱基之间，比如25-26、30-31、35-36、40-41、45-46、50-51、55-56、59-60等之间均可。
16.进一步地，所述靶向基因插入至编码cd63蛋白基因序列的氮端第20～第60个中相邻的两个相邻gg(鸟嘌呤)之间。
17.进一步地，所述靶向基因将所述编码cd63蛋白基因序列分割成两部分，形成编码cd63蛋白的氮端序列和编码cd63蛋白的碳端序列，所述靶向基因位于所述氮端序列和碳端序列之间；
18.优选地，所述氮端序列为含有seq1或与该seq1序列70％以上同源的序列；
19.所述碳端序列为含有seq2或与该seq2序列70％以上同源的序列；
20.seq1序列为：atggcggtggaaggaggaatgaagtgtgtcaagtttttgctctac gttctcctgctggccttctgcgcctgtgcagtgggattgatcgccattggtgtagcggttcag。
21.seq2序列为：gttgtcttgaagcaggccattacccatgagactactgctggct cgctgttgcctgtggtcatcattgcagtgggtgccttcctcttcctggtggcctttgtgggctgctgtggggcctgcaaggagaactactgtctcatgattacatttgccatcttcctgtctcttatcatgcttgtggaggtggctgtggccattgctggctatgtgtttagagaccaggtgaagtcagagtttaataaaagcttccagcagcagatgcagaattaccttaaagacaacaaaacagccactattttggacaaattgcagaaagaaaataactgctgtggagcttctaactacacagactgggaaaacatccccggcatggccaaggacagagtccccgattcttgctgcatcaacataactgtgggctgtgggaatgatttcaaggaatccactatccatacccagggctgcgtggagactatagcaatatggctaaggaagaacatactgctggtggctgcagcggccctgggcattgcttttgtggaggtcttgggaattatcttctcctgctgtctggtgaagagtattcgaagtggctatgaagtaatgtag。
22.上述的同源的序列均包括在原序列基础上增加一个或几个碱基、减少一个或几个碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列。
23.进一步地，所述形成编码cd63蛋白的氮端序列与所述靶向基因之间通过linker1连接；
24.优选地，所述linker1为agatctctagccacc或在该序列基础上增加、减少或替换其中任意1～4个碱基后得到的序列，如增加、减少或替换1个、2个、3个或4个。
25.进一步地，所述形成编码cd63蛋白的碳端序列与所述靶向基因之间通过linker2连接；
26.优选地，所述linker2为accggtggagctcgaatcagatct或在该序列基础上增加、减少或替换其中任意1～6个碱基后得到的序列，如增加、减少或替换1个、2个、3个、4个、5个或6个等。
27.进一步地，所述rna片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体rna序列，所述rna序列是具有医学意义的sirna、shrna或mirna序列。
28.进一步地，所述靶向基因能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述rna片段递送进入目标组织。
29.进一步地，所述递送载体还包括启动子，所述递送载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-rna片段、启动子-靶向基因、启动子-rna片段-靶向基因；每一个所述递送载体中至少包括一个rna片段和一个靶向基因，所述rna片段和靶向基因于相同的线路中或位于不同的线路中。
30.进一步地，所述递送载体还包括能够使所述基因线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列、loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
31.所述递送载体包括以下任意一种基因线路或几种基因线路的组合：5'-启动子-5'侧翼序列-rna片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-编码cd63蛋白的氮端序列-linker1-靶向基因-linker2-编码cd63蛋白的碳端序列、5'-启动子-编码cd63蛋白的氮端序列-linker1-靶向基因
‑‑
linker2-编码cd63蛋白的碳端序列-5'侧翼序列-rna片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
32.进一步地，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
33.所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
34.所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
35.所述补偿序列为所述rna片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基；
36.所述中间序列选自linker1、lingker2。
37.进一步地，在递送载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列相连；
38.其中，序列1为cagatc，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为tggatc。优选地，序列2是由10-50个碱基组成的序列，更为优选地，序列2是由20-40个碱基组成的序列。
39.进一步地，在递送载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
40.其中，序列4为cagatctggccgcactcgaggtagtgagtcgaccagtggatc。
41.进一步地，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
42.进一步地，所述rna序列的长度为15-25个核苷酸。
43.进一步地，所述rna序列选自以下任意一种或几种：egfr基因的sirna，kras基因的sirna，vegfr基因的sirna，mtor基因的sirna，tnf-α基因的sirna,integrin-α基因的sirna，b7基因的sirna，tgf-β1基因的sirna，h2-k基因的sirna，h2-d基因的sirna，h2-l基因的sirna，hla基因的sirna，gdf15基因的sirna，mirna-21的反义链，mirna-214的反义链，tnc基因的sirna，ptp1b基因的sirna，mhtt基因的sirna，lrrk2基因的sirna，α-synuclein基因的sirna，或与上述序列同源性大于80％的rna序列，或编码上述rna的核酸分子。
44.进一步地，所述rna片段包括rna序列本体和对rna序列本体进行核糖修饰得到的修饰rna序列。即rna片段既可以仅由至少一个rna序列本体组成，也可以仅由至少一个修饰rna序列组成，还可以由rna序列本体与修饰rna序列组成。优选地，所述核糖修饰为2’氟嘧啶修饰。
45.进一步地，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
46.进一步地，所述启动子与编码cd63蛋白的氮端序列之间设有中间序列片段，该中间序列片段的长度为60-150bp的序列，优选长度为80-120bp的序列，更优选长度为90-110bp(比如95、100、105等)的序列，此序列只对长度有一定要求，对具体的碱基排列无要求。
47.本技术的另一个发明点为提供一种以上任意一段所述的rna递送系统在药物中的应用。
48.进一步地，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
49.进一步地，所述药物为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
50.进一步地，上述各基因的sirna均为具有抑制该基因表达的功能的rna序列，具有抑制各基因表达的功能的rna序列数量繁多，在此无法一一列举，仅以下述部分效果较优的序列进行举例说明。
51.egfr基因的sirna包括uguugcuucucuuaauuccu、aaaugaucuucaaaagugccc、ucuuuaagaaggaaagaucau、aauauucguagcauuuaugga、uaaaaauccucacauauacuu、其他具有抑
制egfr基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
52.kras基因的sirna包括ugauuuaguauuauuuauggc、aauuuguucucuauaauggug、uaauuuguucucuauaauggu、uuauguuuucgaauuucucga、uguauuuacauaauuacacac、其他具有抑制kras基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
53.vegfr基因的sirna包括auuugaagaguuguauuagcc、uaauagacugguaacuuucau、acaacuauguacauaauagac、uuuaagacaagcuuuucucca、aacaaaagguuuuucauggac、其他具有抑制vegfr基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
54.mtor基因的sirna包括agauaguuggcaaaucugcca、acuauuucauccauauaaggu、aaaauguugucaaagaagggu、aaaaauguugucaaagaaggg、ugauuucuuccauuucuucuc、其他具有抑制mtor基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
55.tnf-α基因的sirna包括aaaacauaaucaaaagaaggc、uaaaaaacauaaucaaaagaa、aauaauaaauaaucacaagug、uuuucacggaaaacaugucug、aaacauaaucaaaagaaggca、其他具有抑制tnf-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
56.integrin-α基因的sirna包括auaaucaucuccauuaauguc、aaacaauuccuuuuuuaucuu、auuaaaacaggaaacuuugag、auaaugaaggauauacaacag、uucuuuauucauaaaagucuc、其他具有抑制integrin-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
57.b7基因的sirna、uuuucuuuggguaaucuucag、agaaaaauuccacuuuuucuu、auuucaaagucagauauacua、acaaaaauuccauuuacugag、auuauugaguuaaguauuccu、其他具有抑制b7基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
58.tgf-β1基因的sirna包括acggaaauaaccuagaugggc、ugaacuugucauagauuucgu、uugaagaacauauauaugcug、ucuaacuacaguaguguuccc、ucucagacucuggggccucag、其他具有抑制tgf-β1基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
59.h2-k基因的sirna包括aaaaacaaaucaaucaaacaa、ucaaaaaaacaaaucaaucaa、uaugagaagacauugucuguc、aacaaucaagguuacauucaa、acaaaaccucuaagcauucuc、其他具有抑制h2-k基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
60.h2-d基因的sirna包括aaucucggagagacauuucag、aauguuguguaaagagaacug、aacaucagacaauguugugua、uguuaacaaucaaggucacuu、aacaaaaaaaccucuaagcau、其他具有抑制h2-d基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
61.h2-l基因的sirna包括gauccgcucccaauacuccgg、aucugcgugauccgcucccaa、ucggagagacauuucagagcu、ucucggagagacauuucagag、aaucucggagagacauuucag、其他具有抑制h2-l基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
62.hla基因的sirna、aucuggauggugugagaaccg、ugucacugcuugcagccugag、ucacaaagggaagggcaggaa、uugcagaaacaaagucagggu、acacgaacacagacacaugca、其他具有抑制hla基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
63.gdf15基因的sirna包括uauaaauacagcuguuugggc、agacuuauauaaauacagcug、aauuaauaauaaauaacagac、aucugagagccauucaccguc、ugcaacuccagcuggggccgu、其他具有抑制gdf15基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
64.tnc基因的sirna包括uaugaaauguaaaaaaaggga、aaucauauccuuaaaauggaa、uaaucauauccuuaaaaugga、ugaaaaauccuuaguuuucau、agaaguaaaaaacuauugcga、其他具有抑
制tnc基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
65.ptp1b基因的sirna包括ugauauagucauuaucuucuu、uccauuuuuaucaaacuagcg、auuguuuaaauaaauauggag、aauuuuaauacauuauugguu、uuuauuauuguacuuuuugau、其他具有抑制ptp1b基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
66.mhtt基因的sirna包括uauguuuucacauauugucag、auuuaguagccaacuauagaa、auguuuuucaauaaaugugcc、uaugaauagcauucuuaucug、uauuuguuccucuuaauacaa、其他具有抑制mhtt基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
67.lrrk2基因的sirna包括auuaacaugaaaauaucacuu、uuaacaauaucauauaaucuu、aucuuuaaaauuuguuaacgc、uugauuuaagaaaauagucuc、uuugauaacaguauuuuucug、其他具有抑制lrrk2基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
68.α-synuclein基因的sirna包括auauauuaacaaauuucacaa、aaguauuauauauauuaacaa、auaacuuuauauuuuuguccu、uaacuaaaaaauuauuucgag、ucgaauauuauuuauugucag、其他具有抑制α-synuclein基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
69.需要说明的是，以上所述的“同源性大于80％的序列”可以为同源性为85％、88％、90％、95％、98％等。
70.所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
71.本技术的技术效果为：
72.本技术提供的rna递送系统以质粒和/或病毒作为载体，质粒及病毒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的rna序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子rna，通用性强。并且质粒及病毒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本技术提供的rna递送系统在体内自组装后能够与ago2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
73.特别的是，本技术中创新的在靶向标签中加入cd63跨膜蛋白，其能够与靶向各种组织的靶向肽/靶向蛋白完美契合形成融合蛋白，进而提高靶向准确率，提高基因线路的作用速率和效率，保证作用发挥的稳定性。
74.本技术提供的rna递送系统应用于药物中，即提供了一个药物递送平台，可以通过该平台形成更多rna类药物的研发基础，对rna类药物研发和使用具有极大的推动作用。
附图说明
75.图1显示为本技术一实施例中含有插入ptp靶向基因的cd63蛋白，其基因线路的表达水平检测结果示意图；其中，图1a为在pdac(胰腺导管腺癌)样本及正常样本中的sirna表达水平检测结果示意图；图1b为kras mrna表达水平检测结果示意图。
76.图2显示为本技术一实施例中含有插入rvg靶向基因的cd63蛋白，其基因线路的sirna表达水平检测结果示意图。
77.图3显示为本技术一实施例中碱基序列组件插入位置对于sirna表达的影响结果
示意图。
78.图4显示为本技术一实施例中linker序列改变对于sirna表达的影响结果示意图。
79.图5显示为本技术一实施例中基因线路的构建与表征图；其中，图5a为基因环路基本元件组装示意图，图5b为启动子及sirna表达元件茎环结构效果鉴定图，图5c为基因环路sirna表达效果体外鉴定图，图5d为基因环路所表达的sirna体外抑制基因表达效果鉴定图，图5e为基因环路体外抑制基因表达效果wb鉴定图，图5f为体外表达外泌体表面组装靶向肽pulldown验证结果图，图5g为基因环路体内sirna表达效果统计图，图5h为体外表达外泌体表面组装靶向肽pulldown验证结果图，图5i为基因环路串联si体外抑制基因表达效果鉴定图，图5j为基因环路组装外泌体对靶基因梯度抑制的效果图。
80.图6显示为本技术一实施例中含有插入rvg靶向基因且含有或不含有loop序列的情况下，对于sirna、蛋白或mrna表达的影响结果示意图；其中，图6a为egfr sirna表达含量检测结果，图6b为egfr蛋白表达含量检测结果，图6c为egfr mrna表达含量检测结果。
81.图7显示为本技术一实施例中rna序列长度对于蛋白或mrna表达的影响结果示意图；其中，图7a为序列长度为18、20、22时的egfr蛋白表达含量检测结果，图7b为序列长度为18、20、22时的egfr mrna表达含量检测结果。
82.图8显示为本技术一实施例中相邻的基因线路之间用于连接的序列4或序列4同源序列对于sirna表达的影响结果示意图；其中，图8a为连接序列为序列4时的egfr sirna表达含量检测结果，图8b为连接序列为同源序列4-1时的egfr sirna表达含量检测结果，图8c为连接序列为同源序列4-2时的egfr sirna表达含量检测结果。
具体实施方式
83.下面结合附图对本技术的具体实施方式进行描述。
84.首先，对本发明涉及到的专业名词、试验方法等进行解释说明。
85.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称he染色。he染色是组织学、病理学教学与科研中最基础、使用最广泛的技术方法之一。
86.苏木精染液为碱性，可以将组织的嗜碱性结构(如核糖体、细胞核及细胞质中的核糖核酸等)染成蓝紫色；伊红为酸性染料，可以将组织的嗜酸性结构(如细胞内及细胞间的蛋白质，包括路易体、酒精小体以及细胞质的大部分)染成粉红色，使整个细胞组织的形态清晰可见。
87.he染色的具体步骤包括：样本组织固定与切片；组织样本脱蜡；组织样本水化；组织切片苏木素染色、分化与反蓝；组织切片伊红染色与脱水；组织样本切片风干封片；最后在显微镜下观察并拍照。
88.masson染色使胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)或绿色(被亮绿所染)，肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染)，这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色，则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染，肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染，而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。由此说明了红细胞对阴离子染料的渗透性最小，肌纤维与胞质次之，而胶原纤维具有最大的渗透性。i型、iii型胶原呈绿色(gbm、tbm、系膜基质及肾间质呈绿色)，嗜复红蛋白、肾小管胞质、红细胞呈红色。
89.masson染色的具体步骤包括：
90.组织固定于bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋；切片脱蜡至水(二甲苯中脱蜡10min
×
3次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min
×
2次，用吸水纸吸干液体；95％乙醇5min
×
2次，用吸水纸吸干液体；流水2min，用吸水纸吸干水分)；weiger氏铁苏木素染5-10min；流水稍洗；0.5％盐酸酒精分化15s；流水冲洗3min；丽春红酸性品红液染8min；蒸馏水稍冲洗；1％磷钼酸水溶液处理约5min；不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5min；1％冰醋酸处理1min；95％乙醇脱水5min
×
2次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min
×
2次，用吸水纸吸干液体；二甲苯中透明5min
×
2次，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片。
91.western免疫印迹(western blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
92.western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。其步骤主要包括：提取蛋白、蛋白定量、制胶和电泳、转膜、免疫标记及显影。
93.免疫组化，应用抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
94.免疫组化的主要步骤包括：切片浸泡、过夜晾干、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡(100％、95％、90％、80％、75％、70％、50％，每次3min)、双蒸水、滴加3％过氧化氢溶液去除过氧化氢酶、水洗、抗原修复、滴加5％bsa、封闭1h、稀释一抗、pbs缓冲液清洗、孵二抗、pbs缓冲液清洗、显色液显色、水洗、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。
95.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
96.实施例1
97.实施例1：本技术的rna递送系统具有抑制肺癌细胞的作用
98.1、在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
99.所用的载体为质粒。
100.实验1：所用的rna为egfr sirna。
101.结果显示，本系统对egfr突变的肺癌具有显著的治疗效果。
102.2、所用的rna为kras sirna，其他与“1”中一样。
103.结果显示，本系统对kras突变的肺癌肿瘤具有显著的治疗效果。
104.实施例2：本技术的rna递送系统具有治疗肺纤维化的作用
105.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
106.所用的rna为tgf-β1sirna和/或mir-21antisense
107.结果显示，肺纤维化明显减少或去除，本技术中的系统具有明显的抑制肺纤维化的作用。
108.实施例3：本技术的rna递送系统具有抑制肾癌的作用
109.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
110.所用的rna为vegfr和/或mtor sirnas。
111.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制肾癌的作用。
112.实施例4：本技术的rna递送系统具有抑制胶质母细胞瘤的作用
113.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
114.所用的rna为egfr和/或tnc sirnas。
115.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制胶质母细胞瘤的作用。
116.实施例5：本技术的rna递送系统具有抑制肥胖症的作用
117.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
118.所用的rna为ptp1b sirna。
119.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制肥胖症的作用。
120.实施例6：本技术的rna递送系统具有抑制亨廷顿病的作用
121.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
122.所用的rna为mhtt sirna。
123.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制亨廷顿病的作用。
124.实施例7：本技术的rna递送系统具有抑制帕金森病的作用
125.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
126.所用的rna为lrrk2 sirna。
127.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制帕金森病的作用。
128.实施例8：本技术的rna递送系统具有抑制结肠炎的作用
129.在递送系统中，所用的启动子、编码cd63蛋白的氮端序列、linker1、靶向基因、
linker2、编码cd63蛋白的碳端序列、5'侧翼序列、rna片段、loop序列、补偿序列、3'侧翼序列等序列均为本技术所保护和提到的系列，这里不再赘述。
130.所用的rna为tnf-α,integrin-αand b7 sirnas。
131.结果显示，本技术中的系统具有明显的抑制结肠炎的作用。
132.实施例9：
133.一种rna递送系统，该系统包括递送载体，递送载体携带有所需递送的rna片段和靶向基因，靶向基因插入编码cd63蛋白基因序列中，递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在宿主器官组织中内源性地自发形成含有rna片段的复合结构，复合结构能够进入并结合目标组织，以将rna片段送入目标组织，递送载体包括质粒和/或病毒。
134.靶向基因包括编码rvg靶向肽、ge11靶向肽、ptp靶向肽、tcp-1靶向肽、msp靶向肽的基因。
135.ptp靶向基因插入cd63蛋白后的sirna表达水平以及kras mrna表达水平的检测结果如图1所示，rvg靶向基因插入cd63蛋白后的sirna表达水平检测结果如图2所示。
136.靶向基因插入至编码cd63蛋白基因序列的氮端第20～第60个中的任意两个相邻碱基之间，比如25-26、30-31、35-36、40-41、45-46、50-51、55-56、59-60等之间均可。
137.靶向基因插入至编码cd63蛋白基因序列的氮端第20～第60个中相邻的两个相邻gg(鸟嘌呤)之间。
138.碱基序列组件插入位置对于抗原表达的影响如图3所示。通过图3结果可以看出，在本实施例限定范围内，碱基序列组件的插入位置在cd63氮端第30～第45个中时(选择了32aa、34aa、36aa以及40aa进行检测)都能够有效产生表达，且效果相差不大，其中，sirna表达水平最优的为36aa。
139.靶向基因将所述编码cd63蛋白基因序列分割成两部分，形成编码cd63蛋白的氮端序列和编码cd63蛋白的碳端序列，靶向基因位于所述氮端序列和碳端序列之间；
140.氮端序列为含有seq1或与该seq1序列70％以上同源的序列；
141.碳端序列为含有seq2或与该seq2序列70％以上同源的序列；
142.seq1序列为：atggcggtggaaggaggaatgaagtgtgtcaagtttttgctctac gttctcctgctggccttctgcgcctgtgcagtgggattgatcgccattggtgtagcggttcag。
143.seq2序列为：gttgtcttgaagcaggccattacccatgagactactgctggct cgctgttgcctgtggtcatcattgcagtgggtgccttcctcttcctggtggcctttgtgggctgctgtggggcctgcaaggagaactactgtctcatgattacatttgccatcttcctgtctcttatcatgcttgtggaggtggctgtggccattgctggctatgtgtttagagaccaggtgaagtcagagtttaataaaagcttccagcagcagatgcagaattaccttaaagacaacaaaacagccactattttggacaaattgcagaaagaaaataactgctgtggagcttctaactacacagactgggaaaacatccccggcatggccaaggacagagtccccgattcttgctgcatcaacataactgtgggctgtgggaatgatttcaaggaatccactatccatacccagggctgcgtggagactatagcaatatggctaaggaagaacatactgctggtggctgcagcggccctgggcattgcttttgtggaggtcttgggaattatcttctcctgctgtctggtgaagagtattcgaagtggctatgaagtaatgtag。
144.上述的同源的序列均包括在原序列基础上增加一个或几个碱基、减少一个或几个碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列。
145.形成编码cd63蛋白的氮端序列与所述靶向基因之间通过linker1连接；
146.linker1为agatctctagccacc或在该序列基础上增加、减少或替换其中任意1～4个碱基后得到的序列，如增加、减少或替换1个、2个、3个或4个。
147.形成编码cd63蛋白的碳端序列与所述靶向基因之间通过linker2连接；
148.linker2为accggtggagctcgaatcagatct或在该序列基础上增加、减少或替换其中任意1～6个碱基后得到的序列，如增加、减少或替换1个、2个、3个、4个、5个或6个等。
149.linker序列改变对于sirna表达的影响结果如图4所示。
150.rna片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体rna序列，所述rna序列是具有医学意义的sirna、shrna或mirna序列。
151.靶向基因能够在宿主的器官组织中形成复合结构的靶向结构，靶向结构位于复合结构的表面，复合结构能够通过靶向结构寻找并结合目标组织，将rna片段递送进入目标组织。
152.递送载体还包括启动子，递送载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-rna片段、启动子-靶向基因、启动子-rna片段-靶向基因；每一个所述递送载体中至少包括一个rna片段和一个靶向基因，rna片段和靶向基因于相同的线路中或位于不同的线路中。
153.递送载体还包括能够使所述基因线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列、loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
154.递送载体包括以下任意一种基因线路或几种基因线路的组合：5'-启动子-5'侧翼序列-rna片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-编码cd63蛋白的氮端序列-linker1-靶向基因-linker2-编码cd63蛋白的碳端序列、5'-启动子-编码cd63蛋白的氮端序列-linker1-靶向基因
‑‑
linker2-编码cd63蛋白的碳端序列-5'侧翼序列-rna片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
155.rna片段及启动子对于sirna表达的影响结果如图5所示。
[0156]5’
侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
[0157]
loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
[0158]3’
侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
[0159]
补偿序列为rna片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基；
[0160]
中间序列选自linker1、lingker2。
[0161]
含有插入rvg靶向基因且含有或不含有loop序列的情况下，对于sirna、蛋白或mrna表达的影响结果如图6所示。
[0162]
在递送载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列相连；
[0163]
其中，序列1为cagatc，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为tggatc。优选地，序列2是由10-50个碱基组成的序列，更为优选地，序列2是由20-40个碱基组成的序列。
[0164]
在递送载体中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
[0165]
其中，序列4为cagatctggccgcactcgaggtagtgagtcgaccagtggatc。
[0166]
相邻的基因线路之间用于连接的序列4或序列4同源序列对于sirna表达的影响结果如图8所示。
[0167]
器官组织为肝脏，复合结构为外泌体。
[0168]
rna序列的长度为15-25个核苷酸。
[0169]
rna序列长度对于蛋白或mrna表达的影响结果如图7所示。
[0170]
rna序列选自以下任意一种或几种：egfr基因的sirna，kras基因的sirna，vegfr基因的sirna，mtor基因的sirna，tnf-α基因的sirna,integrin-α基因的sirna，b7基因的sirna，tgf-β1基因的sirna，h2-k基因的sirna，h2-d基因的sirna，h2-l基因的sirna，hla基因的sirna，gdf15基因的sirna，mirna-21的反义链，mirna-214的反义链，tnc基因的sirna，ptp1b基因的sirna，mhtt基因的sirna，lrrk2基因的sirna，α-synuclein基因的sirna，或与上述序列同源性大于80％的rna序列，或编码上述rna的核酸分子。
[0171]
rna片段包括rna序列本体和对rna序列本体进行核糖修饰得到的修饰rna序列。即rna片段既可以仅由至少一个rna序列本体组成，也可以仅由至少一个修饰rna序列组成，还可以由rna序列本体与修饰rna序列组成。优选地，所述核糖修饰为2’氟嘧啶修饰。
[0172]
递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
[0173]
启动子与编码cd63蛋白的氮端序列之间设有中间序列片段，该中间序列片段的长度为60-150bp的序列，优选长度为80-120bp的序列，更优选长度为90-110bp(比如95、100、105等)的序列，此序列只对长度有一定要求，对具体的碱基排列无要求。
[0174]
本技术还提供一种以上任意一段所述的rna递送系统在药物中的应用。
[0175]
药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
[0176]
药物为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
[0177]
各基因的sirna均为具有抑制该基因表达的功能的rna序列，具有抑制各基因表达的功能的rna序列数量繁多，在此无法一一列举，仅以下述部分效果较优的序列进行举例说明。
[0178]
egfr基因的sirna包括uguugcuucucuuaauuccu、aaaugaucuucaaaagugccc、ucuuuaagaaggaaagaucau、aauauucguagcauuuaugga、uaaaaauccucacauauacuu、其他具有抑制egfr基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0179]
kras基因的sirna包括ugauuuaguauuauuuauggc、aauuuguucucuauaauggug、uaauuuguucucuauaauggu、uuauguuuucgaauuucucga、uguauuuacauaauuacacac、其他具有抑制kras基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0180]
vegfr基因的sirna包括auuugaagaguuguauuagcc、uaauagacugguaacuuucau、acaacuauguacauaauagac、uuuaagacaagcuuuucucca、aacaaaagguuuuucauggac、其他具有抑制vegfr基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0181]
mtor基因的sirna包括agauaguuggcaaaucugcca、acuauuucauccauauaaggu、aaaauguugucaaagaagggu、aaaaauguugucaaagaaggg、ugauuucuuccauuucuucuc、其他具有抑制mtor基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0182]
tnf-α基因的sirna包括aaaacauaaucaaaagaaggc、uaaaaaacauaaucaaaagaa、aauaauaaauaaucacaagug、uuuucacggaaaacaugucug、aaacauaaucaaaagaaggca、其他具有抑
制tnf-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0183]
integrin-α基因的sirna包括auaaucaucuccauuaauguc、aaacaauuccuuuuuuaucuu、auuaaaacaggaaacuuugag、auaaugaaggauauacaacag、uucuuuauucauaaaagucuc、其他具有抑制integrin-α基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0184]
b7基因的sirna、uuuucuuuggguaaucuucag、agaaaaauuccacuuuuucuu、auuucaaagucagauauacua、acaaaaauuccauuuacugag、auuauugaguuaaguauuccu、其他具有抑制b7基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0185]
tgf-β1基因的sirna包括acggaaauaaccuagaugggc、ugaacuugucauagauuucgu、uugaagaacauauauaugcug、ucuaacuacaguaguguuccc、ucucagacucuggggccucag、其他具有抑制tgf-β1基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0186]
h2-k基因的sirna包括aaaaacaaaucaaucaaacaa、ucaaaaaaacaaaucaaucaa、uaugagaagacauugucuguc、aacaaucaagguuacauucaa、acaaaaccucuaagcauucuc、其他具有抑制h2-k基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0187]
h2-d基因的sirna包括aaucucggagagacauuucag、aauguuguguaaagagaacug、aacaucagacaauguugugua、uguuaacaaucaaggucacuu、aacaaaaaaaccucuaagcau、其他具有抑制h2-d基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0188]
h2-l基因的sirna包括gauccgcucccaauacuccgg、aucugcgugauccgcucccaa、ucggagagacauuucagagcu、ucucggagagacauuucagag、aaucucggagagacauuucag、其他具有抑制h2-l基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0189]
hla基因的sirna、aucuggauggugugagaaccg、ugucacugcuugcagccugag、ucacaaagggaagggcaggaa、uugcagaaacaaagucagggu、acacgaacacagacacaugca、其他具有抑制hla基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0190]
gdf15基因的sirna包括uauaaauacagcuguuugggc、agacuuauauaaauacagcug、aauuaauaauaaauaacagac、aucugagagccauucaccguc、ugcaacuccagcuggggccgu、其他具有抑制gdf15基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0191]
tnc基因的sirna包括uaugaaauguaaaaaaaggga、aaucauauccuuaaaauggaa、uaaucauauccuuaaaaugga、ugaaaaauccuuaguuuucau、agaaguaaaaaacuauugcga、其他具有抑制tnc基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0192]
ptp1b基因的sirna包括ugauauagucauuaucuucuu、uccauuuuuaucaaacuagcg、auuguuuaaauaaauauggag、aauuuuaauacauuauugguu、uuuauuauuguacuuuuugau、其他具有抑制ptp1b基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0193]
mhtt基因的sirna包括uauguuuucacauauugucag、auuuaguagccaacuauagaa、auguuuuucaauaaaugugcc、uaugaauagcauucuuaucug、uauuuguuccucuuaauacaa、其他具有抑制mhtt基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0194]
lrrk2基因的sirna包括auuaacaugaaaauaucacuu、uuaacaauaucauauaaucuu、aucuuuaaaauuuguuaacgc、uugauuuaagaaaauagucuc、uuugauaacaguauuuuucug、其他具有抑制lrrk2基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0195]
α-synuclein基因的sirna包括auauauuaacaaauuucacaa、aaguauuauauauauuaacaa、auaacuuuauauuuuuguccu、uaacuaaaaaauuauuucgag、
ucgaauauuauuuauugucag、其他具有抑制α-synuclein基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
[0196]
此外，本技术还具有明显抑制二型糖尿病、重症肌无力、阿尔兹海默病、由肥胖症引起的心血管疾病、移植物抗宿主病及其相关疾病的作用。且癌症还可以治疗胃癌、肝癌、脑癌、血癌、肠癌、皮肤癌、淋巴癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、头颈部鳞癌、血管瘤、黑色素瘤等，这些还在实验验证中，后续补充。
[0197]
上述实施例所用的载体为质粒或病毒。
[0198]
在本技术中，所述的同源的序列均包括在原序列基础上增加一个或几个碱基、减少一个或几个碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列。
[0199]
在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。
[0200]
在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
[0201]
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
[0202]
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
[0203]
上面结合附图对本技术优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本技术并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术构思的前提下做出各种变化。