一种用于植入材料体外细胞的毒性检测方法与流程

1.本发明属于临床前安全性检测的技术领域，具有而言涉及一种用于植入材料体外细胞毒性检测的方法。


背景技术：

2.体内植入材料的临床前安全性检测，通常是将植入材料的浸提液培养成纤维细胞，根据纤维的损伤情况评估该植入材料的安全性，但该种方法中，由于培养环境是在培养板中将浸提液直接与纤维细胞接触，而体内细胞均是在一定基质支撑下生长，因此所测得的数据存在一定的失真度。
3.利用各种材料使细胞附着在立体空间内生长，形成类似体内的组织结构，发挥其生理功能是一种有效的解决方法。专利cn102010601a、cn101624472a和cn101624473a中分别公开了丝素蛋白在交联剂的作用下制得一种支架材料，该种支架材料属大孔径支架，仅适合于大规模培养肝细胞，应用范围有限。


技术实现要素：

4.为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，该种方法可以获得更为准确的安全性评估值。
5.为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
6.一种用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，首先构建一小孔径的三维基质载体模拟反应细胞的体内环境，然后在所述三维基质载体上培养所述植入材料体外细胞，最后对所述植入材料体外细胞进行毒性检测，所述三维基质载体通过以下方法获：
7.1)将质量浓度为3％的丝素蛋白溶液与质量浓度为3％的壳聚糖溶液按5：5或4:6的体积比混合，获得混合溶液；
8.2)以每100ml所述混合溶液中加入一份交联剂的比例关系，在所述混合溶液中添加所述交联剂，获得交联产物；所述一份交联剂通过1g 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺和0.26g n-羟基琥珀酰亚胺溶于1-2ml的95％乙醇中制备而得；
[0009]
3)将所述交联产物依次于4℃冰箱交联过夜、-20℃冰箱冷冻24h、-80℃冰箱冷冻24h，梯度冷冻后于冷冻干燥机中干燥48h。
[0010]
有益效果
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与现有技术相比，本发明具有以下优点：
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1、本发明的检测方法中所检测的细胞是种植在小孔径的三维基质载体上的，种植后的细胞能发挥正常生理功能，从而使得所检测到的数据更为真实，减少了体内外实验结果的误差，获得更具参考价值的评价值，具有重大的社会效益。
[0013]
2、本发明中所制备的三维基质载体具有较好的孔隙交联度、孔径均一度和结构稳定性，该三维基质载体的构象接近细胞体内的空间构象。
附图说明
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图1.sem扫描电镜观察下，不同丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液体积比下的三维多孔结构示意图。
[0015]
图2.sem扫描电镜观察下，不同丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液体积比下的三维多孔结构的孔径大小示意图。
具体实施方式
[0016]
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0017]
丝素蛋白(silk fibroin,sf)是由18种氨基酸构成的纯天然高分子聚合物，其氨基酸组成与人类蛋白质极为相近。大量研究表明，丝素蛋白不仅具有良好的细胞亲和性、生物相容性、生物可降解性、柔韧性，还具有三维结构的可控性，并且来源广泛，价格低廉。近年来，丝素蛋白已经被研究开发为多种生物材料，如人工骨骼、人工血管、人工神经、人工真皮和药物释放载体等。
[0018]
壳聚糖(chitosan,cs)是甲壳质部分脱去乙酰基的产物，糖氨聚糖类似物，能够模拟由多糖类和糖胺聚糖构成的细胞外基质，充当细胞粘附、迁移和最终组织形成的底物。此外，由于其良好的成膜性、韧性、透气保湿性、生物可降解、抗菌以及促进伤口凝血等作用，已被广泛应用于人工真皮、抗炎药、手术缝合线、骨愈合治疗和人工血管等。
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组织工程学(tissue engineering)是一门结合了细胞生物学、工程学和材料学为一体的新兴学科。其主要是在体内外构建组织或者器官替代物，达到修复受损组织，维持或者改善器官形态和功能的作用。组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入到机体的不同组织，达到替代相应缺损组织和器官的功能性材料。
[0020]
基于上述理论研究，本实施例的用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，首先构建一小孔径的三维基质载体模拟反应细胞的体内环境，然后在所述三维基质载体上培养所述植入材料体外细胞，最后对所述植入材料体外细胞进行毒性检测，所述三维基质载体通过以下方法获：
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1)将质量浓度为3％的丝素蛋白溶液与质量浓度为3％的壳聚糖溶液按5：5或4:6的体积比混合，获得混合溶液；
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2)以每100ml所述混合溶液中加入一份交联剂的比例关系，在所述混合溶液中添加所述交联剂，获得交联产物；所述一份交联剂通过1g 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺和0.26g n-羟基琥珀酰亚胺溶于1-2ml的95％乙醇中制备而得；
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3)将所述交联产物依次于4℃冰箱交联过夜、-20℃冰箱冷冻24h、-80℃冰箱冷冻24h，梯度冷冻后于冷冻干燥机中干燥48h。
[0024]
优选的，所述丝素蛋白溶液由蚕茧壳或蚕丝制得。但除了三维基质载体材料的选择外，其三维结构本身的构造也非常重要，它决定了细胞能否在载体上很好地黏附、增殖、分化。如图1所示的sem图，所有比例复合支架均具有相互连接的网孔结构，但纯丝素蛋白支架呈现出无定形大孔结构，而纯壳聚糖支架为连接不良的小孔结构。随着壳聚糖的加入，各比例支架呈现多孔网状结构，如图2所示分别为3％的丝素蛋白溶液和3％的壳聚糖溶液分
别以5:5、4:6、3:7、2:8、1:0和0:1的比例混合的孔网状结构示意图。其中，5：5和4：6比例的孔网状结构比其他组好，表现出蜂窝状的多孔结构和良好的孔径均一性。该结构使得三维基质载体具有较大的表面积，能够促进细胞向孔内伸展，为细胞黏附和生长提供相应的表面空间。且孔隙之间连接发达，促进了细胞的迁移和营养交换。因此，图2结果表明，壳聚糖的加入促进了丝素蛋白和壳聚糖的相互作用，然而过多的壳聚糖不利于蜂窝状多孔支架的形成。而5：5和4：6两组支架在孔隙交联度和孔径均一度上较其他组有明显优势，更适合细胞的生长。
[0025]
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思，目的是使一般技术人员了解本发明的内容并据以实施，但不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质内容所做出的等效变化及其不同领域的应用，都涵盖在本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，其特征在于，首先构建一小孔径的三维基质载体模拟反应细胞的体内环境，然后在所述三维基质载体上培养所述植入材料体外细胞，最后对所述植入材料体外细胞进行毒性检测，所述三维基质载体通过以下方法获：1)将质量浓度为3％的丝素蛋白溶液与质量浓度为3％的壳聚糖溶液按5：5或4:6的体积比混合，获得混合溶液；2)以每100ml所述混合溶液中加入一份交联剂的比例关系，在所述混合溶液中添加所述交联剂，获得交联产物；所述一份交联剂通过1g 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺和0.26gn-羟基琥珀酰亚胺溶于1-2ml的95％乙醇中制备而得；3)将所述交联产物依次于4℃冰箱交联过夜、-20℃冰箱冷冻24h、-80℃冰箱冷冻24h，梯度冷冻后于冷冻干燥机中干燥48h。2.根据权利要求1所述的用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液由蚕茧壳或蚕丝制得。

技术总结
本发明提供一种用于植入材料体外细胞的毒性检测方法，首先构建一小孔径的三维基质载体模拟反应细胞的体内环境，然后在所述三维基质载体上培养所述植入材料体外细胞，最后对所述植入材料体外细胞进行毒性检测。本发明的检测方法中所检测的细胞是种植在小孔径的三维基质载体上的，种植后的细胞能发挥正常生理功能，从而使得所检测到的数据更为真实，减少了体内外实验结果的误差，获得更具参考价值的评价值，具有重大的社会效益。具有重大的社会效益。具有重大的社会效益。


技术研发人员：荣超 鹿伟民 王守立
受保护的技术使用者：江苏博赛孚医疗科技有限公司
技术研发日：2021.08.16
技术公布日：2023/2/17