一种人多发性骨髓瘤MM.1S细胞培养基及其应用的制作方法

一种人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基及其应用
技术领域
1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基及其应用。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)，又称骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤或kahler病，是一种起源于淋巴浆细胞系的血液系统恶性肿瘤。多发性骨髓瘤的特征是单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白。恶性浆细胞无节制地增生、广泛浸润和大量单克隆免疫球蛋白的出现及沉积，导致正常多克隆浆细胞增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制，从而引起广泛骨质破坏、反复感染、血钙增高、肾功能损伤、贫血、高粘滞综合征等临床表现并导致不良后果。多发性骨髓瘤患者的年龄大部分在40岁以上，其诊断的中位年龄为69岁，患者的平均总生存期为6～7年。多发性骨髓瘤通常可以使用化学疗法、服用类固醇类药物、服用蛋白酶体抑制剂、骨髓移植等手段来进行治疗。
3.人多发性骨髓瘤细胞是异常浆细胞，其迅速繁殖并产生称为副蛋白的异常抗体，临床上通常通过对这种副蛋白进行测量来诊断骨髓瘤。人多发性骨髓瘤mm.1s细胞是从一名对胆固醇类药物治疗产生耐药性的多发性骨髓瘤患者的外周血中分离得到的，该细胞株对地塞米松敏感。为了深入研究人多发性骨髓瘤的发病机制和测试药物对mm.1s的效用，常常需要足够数量的mm.1s。因此，为了获得足够数量的mm.1s用于研究，亟需开发一种能够能够用于对mm.1s进行培养并使其大量增殖的培养基。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基及其应用，该培养基中含有l-谷氨酰胺、胎牛血清、d-葡萄糖、4-羟基哌嗪乙磺酸，这几种组分之间具有良好的协同增效作用，有利于人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的快速生长和增殖。
5.根据本发明的第一个方面，提供一种人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基，该培养基包括0.01～0.05vol％l-谷氨酰胺、5～10vol％胎牛血清、20～30mm 4-羟基哌嗪乙磺酸和基础培养基，基础培养基包括d-葡萄糖；且培养基不含丙酮酸钠。
6.本发明提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基中含有l-谷氨酰胺、胎牛血清、d-葡萄糖和4-羟基哌嗪乙磺酸。其中，l-谷氨酰胺有利于维持人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的生长，减少mm.1s因生长不良而死亡的现象，并且能够使mm.1s保持良好的生理活性；胎牛血清中含有多种不同种类的细胞生长因子，能够为mm.1s提供营养成分的同时对细胞的有害成分少；d-葡萄糖作为一种代谢碳源，能够为mm.1s提供营养成分，有效减轻mm.1s在培养过程中的细胞损伤；4-羟基哌嗪乙磺酸的加入则使得培养基具有良好的缓冲能力，能够维持培养体系的ph稳定性，进而有利于维持mm.1s的细胞活性。本发明提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基通过将上述几种组分进行搭配使用并限定了特定的含量，使得各组分之间具有良好的协同作用，有利于人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的快速生长和增殖。与传统的骨
髓瘤细胞培养基相比，本发明提供的培养基中所采用的l-谷氨酰胺的用量极少，仅为0.01～0.05vol％，能够避免由于l-谷氨酰胺自发分解形成大量对细胞有毒害作用的废物氨，进而导致细胞活性降低、细胞扩增较慢和效率低的现象。此外，本发明提供的培养基中不含丙酮酸钠，与以丙酮酸钠作为部分替代碳源相比，培养基中以d-葡萄糖作为代谢碳源，有利于提高mm.1s的生长和增殖速度，使得该培养基即使去除了丙酮酸钠，但更加适合mm.1s的增殖，有利于mm.1s的高效扩增和减少成本。
7.优选地，上述人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基还包括0.5～2vol％青霉素-链霉素混合物。
8.本方案在人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基中添加的青霉素-链霉素混合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有有效的联合抗菌作用，能够防止mm.1s细胞在培养过程中受到细菌污染。
9.优选地，上述基础培养基还包括酚红。
10.优选地，在基础培养基中，所述d-葡萄糖的浓度为4～5g/l。
11.根据本发明的第二个方面，提供上述人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基在人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的培养中的应用。
12.根据本发明的第三个方面，提供一种用于人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养的试剂盒，该试剂盒含有上述人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基。
13.根据本发明的第四个方面，提供一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
14.(1)将人多发性骨髓瘤mm.1s细胞按照4
×
105～6
×
105cells/ml的细胞密度加入到如权利要求1～4任意一项所述人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基中，于37℃、5％co2下进行原代培养；
15.(2)将经过原代培养的所述人多发性骨髓瘤mm.1s细胞进行传代培养。
16.本方案涉及培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，在mm.1s细胞刚复苏时，由于细胞的状态较差，细胞量不够，将原代培养过程中的细胞密度调整为4
×
105～6
×
105cells/ml，在该细胞密度下，mm.1s细胞的复苏效率高，有利于mm.1s细胞的后续生长和增殖。
17.优选地，在步骤(1)中，人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的接种细胞密度为5
×
105cells/ml。
18.优选地，在步骤(2)中，待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时进行传代培养。
19.优选地，在步骤(2)中，在进行传代培养前，将人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的细胞密度调整为0.9
×
106～1.1
×
106cells/ml。
20.本方案在传代培养前将细胞密度调整至0.9
×
106～1.1
×
106cells/ml，有利于缩短传代时间和提高细胞传代效率，具体表现在：两天便可传一次代，且p7代开始传代密度为1.3
×
106～1.6
×
106cells/ml。
21.优选地，在步骤(2)中，在进行传代培养前，将人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的细胞密度调整为1.0
×
106cells/ml。
22.优选地，在步骤(2)中，在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
23.本方案通过调整传代间隔时间和传代比例，能够进一步提高mm.1s细胞的增殖和传代效率。
附图说明
24.图1为本发明利用对比例4提供的方法对mm.1s细胞进行传代培养至p7代时第1、2、3天的细胞生长和增殖情况结果图；
25.图2为本发明利用实施例4提供的方法对mm.1s细胞进行传代培养至p7代时第1、2、3天的细胞生长和增殖情况结果图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1～3和对比例1～2
28.一种人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基，其成分如表1所示，制备方法包括以下步骤：向基础培养基(含有4～5g/l d-葡萄糖、20～30mm 4-羟基哌嗪乙磺酸和适量酚红)中添加0.01～0.05vol％l-谷氨酰胺、5～10vol％胎牛血清和0.5～2vol％青霉素-链霉素混合物，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基。
29.表1人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基
[0030][0031]
实施例4
[0032]
一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
[0033]
(1)在15ml离心管中提前加入8ml预热好的实施例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基；
[0034]
(2)从细胞库液氮罐中取出p5代mm.1s冻存管，在洁净区迅速拧开盖子，再把盖子拧回来(以防爆裂)，迅速将冻存管放入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并不断地摇动，使管内的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候取出；
[0035]
(3)在冻存管的外壁喷75％酒精放入工作台，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁；
[0036]
(4)将mm.1s转移至加好培养基的离心管中，混匀，再加1ml实施例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基清洗一遍冻存管后一并转移到离心管中；
[0037]
(5)将离心管置于低速离心机上，800rpm离心3min，吸弃上清，然后用适量实施例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基重悬细胞，取10μl细胞悬液，利用台盼蓝染色计数，将细胞悬液按照5
×
105cells/ml的细胞密度加入到含有实施例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基的培养瓶内，置于37℃、5％co2的培养箱中进行原代培养；
[0038]
(6)待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时，将细胞密度调整为1.0
×
106cells/ml，进行传代培养；
[0039]
在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
[0040]
实施例5
[0041]
一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
[0042]
(1)在15ml离心管中提前加入8ml预热好的实施例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基；
[0043]
(2)从细胞库液氮罐中取出p5代mm.1s冻存管，在洁净区迅速拧开盖子，再把盖子拧回来(以防爆裂)，迅速将冻存管放入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并不断地摇动，使管内的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候取出；
[0044]
(3)在冻存管的外壁喷75％酒精放入工作台，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁；
[0045]
(4)将mm.1s转移至加好培养基的离心管中，混匀，再加1ml实施例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基清洗一遍冻存管后一并转移到离心管中；
[0046]
(5)将离心管置于低速离心机上，800rpm离心3min，吸弃上清，然后用适量实施例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基重悬细胞，取10μl细胞悬液，利用台盼蓝染色计数，将细胞悬液按照4
×
105cells/ml的细胞密度加入到含有实施例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基的培养瓶内，置于37℃、5％co2的培养箱中进行原代培养；
[0047]
(6)待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时，将细胞密度调整为0.9
×
106cells/ml，进行传代培养；
[0048]
在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
[0049]
实施例6
[0050]
一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
[0051]
(1)在15ml离心管中提前加入8ml预热好的实施例3制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基；
[0052]
(2)从细胞库液氮罐中取出p5代mm.1s冻存管，在洁净区迅速拧开盖子，再把盖子拧回来(以防爆裂)，迅速将冻存管放入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并不断地摇动，使管内的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候取出；
[0053]
(3)在冻存管的外壁喷75％酒精放入工作台，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁；
[0054]
(4)将mm.1s转移至加好培养基的离心管中，混匀，再加1ml实施例3制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基清洗一遍冻存管后一并转移到离心管中；
[0055]
(5)将离心管置于低速离心机上，800rpm离心3min，吸弃上清，然后用适量实施例3制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基重悬细胞，取10μl细胞悬液，利用台盼蓝染色计数，将细胞悬液按照6
×
105cells/ml的细胞密度加入到含有实施例3制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基的培养瓶内，置于37℃、5％co2的培养箱中进行原代培养；
[0056]
(6)待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时，将细胞密度调整为1.1
×
106cells/ml，进行传代培养；
[0057]
在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
[0058]
对比例3
[0059]
一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
[0060]
(1)在15ml离心管中提前加入8ml预热好的对比例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基；
[0061]
(2)从细胞库液氮罐中取出p5代mm.1s冻存管，在洁净区迅速拧开盖子，再把盖子拧回来(以防爆裂)，迅速将冻存管放入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并不断地摇动，使管内的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候取出；
[0062]
(3)在冻存管的外壁喷75％酒精放入工作台，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁；
[0063]
(4)将mm.1s转移至加好培养基的离心管中，混匀，再加1ml对比例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基清洗一遍冻存管后一并转移到离心管中；
[0064]
(5)将离心管置于低速离心机上，800rpm离心3min，吸弃上清，然后用适量对比例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基重悬细胞，取10μl细胞悬液，利用台盼蓝染色计数，将细胞悬液按照5
×
105cells/ml的细胞密度加入到含有对比例1制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基的培养瓶内，置于37℃、5％co2的培养箱中进行原代培养；
[0065]
(6)待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时，将细胞密度调整为1.0
×
106cells/ml，进行传代培养；
[0066]
在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
[0067]
对比例4
[0068]
一种培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法，包括以下步骤：
[0069]
(1)在15ml离心管中提前加入8ml预热好的对比例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基；
[0070]
(2)从细胞库液氮罐中取出p5代mm.1s冻存管，在洁净区迅速拧开盖子，再把盖子拧回来(以防爆裂)，迅速将冻存管放入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并不断地摇动，使管内的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候取出；
[0071]
(3)在冻存管的外壁喷75％酒精放入工作台，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁；
[0072]
(4)将mm.1s转移至加好培养基的离心管中，混匀，再加1ml对比例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基清洗一遍冻存管后一并转移到离心管中；
[0073]
(5)将离心管置于低速离心机上，800rpm离心3min，吸弃上清，然后用适量对比例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基重悬细胞，取10μl细胞悬液，利用台盼蓝染色计数，将细胞悬液按照5
×
105cells/ml的细胞密度加入到含有对比例2制得的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基的培养瓶内，置于37℃、5％co2的培养箱中进行原代培养；
[0074]
(6)待人多发性骨髓瘤mm.1s细胞融合度达到90％时，将细胞密度调整为1.0
×
106cells/ml，进行传代培养；
[0075]
在传代培养的过程中，每2～3天传代一次，传代比例为1:2～3。
[0076]
测试例
[0077]
利用实施例4～6和对比例3～4提供的培养人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的方法对人多发性骨髓瘤mm.1s细胞进行培养，在传代培养过程中对p7代mm.1s的生长和增殖情况进行
观察。结果发现，采用实施例4～6提供的方法对mm.1s细胞进行培养时，mm.1s细胞的生长和增殖速率、活细胞数量均显著高于对比例3～4。
[0078]
其中，利用对比例4提供的方法对mm.1s细胞进行传代培养至p7代时第1、2、3天的细胞生长和增殖情况如图1所示，a、b、c分别表示第1、2、3天mm.1s细胞的生长和增殖情况；利用实施例4提供的方法对mm.1s细胞进行传代培养至p7代时第1、2、3天的细胞生长和增殖情况如图2所示，a、b、c分别表示p7代第1、2、3天mm.1s细胞的生长和增殖情况。
[0079]
由图1可知，利用对比例2提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基对mm.1s细胞进行培养，传代培养至p7代时，细胞增殖速率缓慢，细胞传代时间长，需要5天才能传代一次，且p7中第1、2、3天的mm.1s活细胞个数较少，出现这种现象的原因是对比例2提供的培养基中含有1vol％l-谷氨酰胺和1vol％丙酮酸钠，由于l-谷氨酸氨在细胞培养过程中会自发分解形成氨，氨作为一种废物在整个培养过程中逐渐积累，会降低mm.1s细胞的活性，进而导致细胞增殖缓慢，而丙酮酸钠的存在则使得细胞在d-葡萄糖和丙酮酸钠这两种代谢碳源同时存在的情况下，mm.1s细胞会将部分丙酮酸钠作为碳源进行代谢，细胞的生长和增殖速率低于单纯以d-葡萄糖作为代谢碳源时的生长和增殖速率。
[0080]
由图2可知，利用实施例1提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基对mm.1s细胞进行培养，传代培养至p7代时，细胞增殖速率快，传代时间大大缩短，2～3天即可传代一次，第1、2、3天的mm.1s活细胞个数显著高于利用对比例2提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基对mm.1s细胞进行培养时的活细胞个数，这主要是因为实施例1提供的培养基中不含丙酮酸钠，其中l-谷氨酰胺的含量显著低于对比例2，仅为0.03vol％，培养体系中不含大量的氨，不会对mm.1s细胞的活性造成影响，培养基中含有l-谷氨酰胺、胎牛血清、d-葡萄糖、4-羟基哌嗪乙磺酸和青霉素-链霉素混合物，这几种组分之间具有良好的协同增效作用，使得mm.1s细胞能够更好的适应该培养基并能够进行快速生长和增殖。
[0081]
上述结果说明，与传统的骨髓瘤细胞培养基相比，本发明提供的人多发性骨髓瘤mm.1s细胞培养基更加有利于人多发性骨髓瘤mm.1s细胞的快速生长和增殖，所采用的l-谷氨酰胺的用量极少，仅为0.01～0.05vol％，能够避免由于l-谷氨酰胺自发分解形成大量对细胞有毒害作用的废物氨，进而导致细胞活性降低、细胞扩增较慢和效率低的现象，并且，培养基中不含丙酮酸钠，mm.1s细胞以d-葡萄糖作为代谢碳源，有利于进一步提高mm.1s细胞的生长和增殖速率。
[0082]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。