一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片的制作方法

1.本实用新型专利涉及一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，涉及细胞生物学细胞培养领域。


背景技术：

2.细胞爬片是一种是薄型玻璃圆片，可以让细胞贴附生长，利于细胞高密度集中生长，可用于免疫组织化学染色，细胞涂片，原位杂交等实验。传统的细胞爬片尺寸单一，仅仅适用于小尺寸细胞培养板，且爬片直径远远小于培养孔内径，易在培养液中来回晃动，不利于细胞贴附。另外，针对于细胞培养常用的培养皿(如直径为35mm、60mm和100mm)，市面上缺乏与之匹配的细胞爬片，若在这些培养皿中使用单张普通爬片，则由于爬片尺寸过小，整皿培养的细胞多半会浪费，若在这些培养皿中使用多张普通爬片，则由于爬片易在培养基中晃动，会造成多张爬片的交互重叠，重叠部分不能贴附细胞，导致细胞的贴附面积过低，不利于细胞的增殖及达不到后续实验的细胞用量。
3.非贴壁干细胞(例如人诱导多能干细胞)不能自主贴附于培养皿表面，而该种细胞需要其贴附后才能增殖及分化，因此需要借助促进贴附的试剂(例如基质胶)帮助其贴附生长。在使用普通细胞爬片时，由于爬片常常在基质胶中漂浮晃动，导致爬片之间互相严重重叠，重叠部分不能浸润基质胶从而造成干细胞不贴附，因此细胞贴附面积小，贴附率低，影响了细胞的增殖并造成细胞培养基的浪费和后续实验试剂的浪费。
4.综上所述，目前亟需设计一种克服上述技术问题的多尺寸可分离的整片式细胞爬片。


技术实现要素：

5.本实用新型的目的是提供一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，能有效解决现有技术中存在的细胞的贴附面积过低以及爬片尺寸过小等问题。
6.本专利采用如下技术方案解决以上技术问题：
7.一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，其中：整片式细胞爬片为四组，各个整片式细胞爬片表面分别设有多种不同尺寸的大、小爬片。
8.进一步的，整片式细胞爬片包括细胞爬片一、细胞爬片二、细胞爬片三和细胞爬片四，其中：
9.细胞爬片一，设置10个大爬片一和4个小爬片一；
10.细胞爬片二，设置8个大爬片二；
11.细胞爬片三，设置12个大爬片三和6个小爬片三；
12.细胞爬片四，设置4个大爬片四；
13.进一步的，所述细胞爬片一、细胞爬片二、细胞爬片三和细胞爬片四分别对应各个大爬片一、小爬片一、大爬片二、大爬片三、小爬片三以及大爬片四的边沿处均形成有与各个大、小爬片对应的凹槽；
14.所述凹槽的宽度为0.1～0.15mm，凹槽的深度为0.1～0.12mm；
15.所述凹槽的内径略大于对应放置的各个大、小爬片的外径。
16.进一步的，所述细胞爬片一的直径为97～99mm；
17.所述细胞爬片二的直径为57～59mm；
18.所述细胞爬片三的直径为33～34mm；
19.所述细胞爬片四的直径为20～21mm；
20.所述细胞爬片一、细胞爬片二、细胞爬片三和细胞爬片四的厚度均为0.18～0.2mm。
21.进一步的，所述细胞爬片一、细胞爬片二、细胞爬片三和细胞爬片四均采用无色透明玻璃材质制成。
22.进一步的，大爬片一的直径为21.5～22.0mm；
23.小爬片一的直径为9.5～10.0mm；
24.大爬片二的直径为9.5～10.5mm；
25.大爬片三的直径为11.5～12.0mm；
26.小爬片三的直径为5.5～6.0mm；
27.大爬片四的直径为6.5～7.0mm。
28.与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：
29.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，包含四种尺寸的整片式爬片，可分别适配于市面上大多数品牌直径为100mm、60mm和35mm的培养皿，以及6孔板和12孔板，爬片外径略小于培养皿内径或培养孔内径，爬片刚好能放入其中而不发生晃动。
30.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，整片式细胞爬片通过能与不同尺寸的培养皿和培养板完美适配，从而可使基质胶均匀附着于其表面，非贴壁干细胞可完全贴附于爬片之上，从而大大提高了细胞贴附面积，节约了细胞用量，节省了细胞培养基的使用量，并且能增殖出足量的细胞用于后续实验，具有操作简单、成本低等优点。
31.上述说明仅是本实用新型技术方案的概述，为了能够清楚了解本实用新型的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下本实用新型的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
32.为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1是本专利实施例中细胞爬片一的结构示意图；
34.图2是本专利实施例中细胞爬片二的结构示意图；
35.图3是本专利实施例中细胞爬三的结构示意图；
36.图4是本专利实施例中细胞爬片四的结构示意图；
37.图5是图4中a处的放大图；
38.图6为细胞爬片培养的人诱导多能干细胞的oct4(一种干细胞标志蛋白)的免疫染
色结果图；
39.图7为细胞爬片培养的人诱导多能干细胞的增殖结果图；
40.附图标记：
41.1、细胞爬片一；11、大爬片一；12、小爬片一；
42.2、细胞爬片二；21、大爬片二；
43.3、细胞爬片三；31、大爬片三；32、小爬片三；
44.4、细胞爬片四；41、大爬片四；
45.5、凹槽；
具体实施方式
46.为了便于理解本实用新型的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本实用新型做进一步详细阐述。
47.请参阅图1-5，本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片：整片式细胞爬片为四组，各个整片式细胞爬片表面分别设有多种不同尺寸的大、小爬片。
48.具体而言，整片式细胞爬片包括细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4，其中：
49.细胞爬片一1，设置10个大爬片一11和4个小爬片一12；
50.细胞爬片二2，设置8个大爬片二21；
51.细胞爬片三3，设置12个大爬片三31和6个小爬片三32；
52.细胞爬片四4，设置4个大爬片四41。
53.细胞爬片一1为整片式细胞爬片，适配于100mm细胞培养皿，大爬片一11、小爬片一12为细胞爬片一1中可分离出的大、小爬片；
54.细胞爬片二2为整片式细胞爬片，适配于35mm细胞培养皿和6孔板，大爬片二21为细胞爬片二2中可分离出的大爬片；
55.细胞爬片三3为整片式细胞爬片，适配于60mm培养皿，大爬片三31和小爬片三32为细胞爬片三3中可分离出的大、小爬片；
56.细胞爬片四4为整片式细胞爬片，适配于12孔板，大爬片四41为细胞爬片四4中可分离出的大爬片。
57.需要说明的是，整片式细胞爬片，其适用的非贴壁干细胞类型为胚胎干细胞、诱导多能干细胞、多能干细胞诱导的神经干细胞、多能干细胞诱导的间充质干细胞。
58.进一步的，所述细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4分别对应各个大爬片一11、小爬片一12、大爬片二21、大爬片三31、小爬片三32以及大爬片四41的边沿处均形成有与各个大、小爬片对应的凹槽5；
59.所述凹槽5的宽度为0.1～0.15mm，凹槽5的深度为0.1～0.12mm；
60.所述凹槽5的内径略大于对应放置的各个大、小爬片的外径。
61.进一步的，所述细胞爬片一1的直径为97～99mm；
62.所述细胞爬片二2的直径为57～59mm；
63.所述细胞爬片三3的直径为33～34mm；
64.所述细胞爬片四4的直径为20～21mm；
65.所述细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4的厚度均为0.18～0.2mm。
66.进一步的，所述细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4均采用无色透明玻璃材质制成。
67.进一步的，大爬片一11的直径为21.5～22.0mm；
68.小爬片一12的直径为9.5～10.0mm；
69.大爬片二21的直径为9.5～10.5mm；
70.大爬片三31的直径为11.5～12.0mm；
71.小爬片三32的直径为5.5～6.0mm；
72.大爬片四41的直径为6.5～7.0mm。
73.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，整片式爬片中内含不同尺寸的圆形大爬片和小爬片，待细胞贴满后可根据后续实验需求从整片式爬片中分离出大爬片和小爬片使用，以节约细胞用量及后续实验的试剂用量，节约实验成本。
74.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，克服了普通细胞爬片因尺寸单一仅仅适用于小尺寸细胞培养板，且易在培养液中来回晃动，不利于细胞贴附等问题，广泛适用于干细胞培养、分子生物学等细胞生物学领域。
75.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，包含四张不同尺寸的整片式圆形爬片，爬片外径尺寸略小于其适用的细胞培养皿/培养板直径，可以轻松放入其中并且不会在其中晃动，以方便加入的促细胞贴附的基质胶可以均匀附着于其表面，从而使培养的非贴壁干细胞能均匀贴附于爬片上快速增殖。
76.本实用新型的一种多尺寸可分离的整片式细胞爬片，其使用方法如下：
77.包括以下步骤：
78.1)在超净工作台中分别拿出直径为100mm、60mm和35mm的细胞培养皿，放入对应尺寸的细胞爬片一1、细胞爬片二2和细胞爬片三3；分别拿出孔径为34.8mm和22.1mm的6孔细胞培养板和12孔细胞培养板，放入对应尺寸的整片式细胞爬片细胞爬片二2和细胞爬片四4。
79.2)经过步骤1)后，将促细胞贴附的基质胶从冰箱冷藏室拿出，铺于培养皿和培养板中，均匀盖过整片式细胞爬片表面，然后静置1小时；
80.3)经过步骤2)后，用移液器吸走基质胶，并将非贴壁干细胞悬液倒入培养皿和培养板中，于细胞培养箱中静置，使非贴壁细胞在细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4上贴附并生长，待细胞增殖到所需密度后，倒掉细胞培养基，用无菌pbs润洗非贴壁干细胞后，取出细胞爬片一1、细胞爬片二2、细胞爬片三3和细胞爬片四4，用注射器针头沿大爬片一11、小爬片一12、大爬片二21、大爬片三31、小爬片三32以及大爬片四41的凹痕来回滑动，分离出各个大、小爬片以用于后续实验。
81.实施例1
82.以人诱导多能干细胞的培养为例
83.在生物安全柜中拿出一个直径为60mm的细胞培养皿，取出一张细胞爬片三3放入培养皿中，加入2ml基质胶，使其覆盖爬片表面，于室温下静置1小时。
84.用1ml移液器吸除基质胶，向培养皿中加入人诱导多能干细胞悬液5ml，轻轻晃动
培养皿，使悬液均匀分布于细胞爬片三3之上，然后将培养皿放入细胞培养箱静置培养。
85.待细胞长满后，吸除细胞培养基，用无菌pbs润洗细胞后，取出细胞爬片三3，用注射器针头沿大爬片三31和小爬片三32边缘的凹痕来回滑动，分离出大爬片三31和小爬片三32。
86.请参考图6，图6为细胞爬片培养的人诱导多能干细胞的oct4(一种干细胞标志蛋白)的免疫染色结果图，细胞均匀附着于爬片上并表达干性蛋白；
87.取大爬片三31，加入干细胞标志物oct4抗体50ul，于4度孵育过夜，pbs清洗3遍后，滴加50ul二抗及dapi染液复染细胞核，然后用pbs清洗3遍，于荧光显微镜下观察并拍照，发现细胞均匀分布于爬片上，且每个细胞都显著表达oct4，证实人诱导多能干细胞已经牢牢贴附于爬片并且均匀生长，见图6，证实该爬片有利于干细胞均匀贴附并且由于其体积微小可以节省昂贵的抗体用量。
88.请参考图7，图7为本发明所述细胞爬片培养的人诱导多能干细胞的增殖结果图，细胞以稳定的速度增长；
89.取小爬片三32，加入细胞增殖标志物ki67抗体10ul，于4度孵育过夜，pbs清洗3遍后，滴加10ul二抗及dapi染液复染细胞核，然后用pbs清洗3遍，于荧光显微镜下观察并拍照，发现细胞均匀分布于爬片上，且每个细胞都显著表达ki67，证实人诱导多能干细胞可以在爬片快速增殖，见图7，证实该爬片可以维持干细胞的快速增殖特性。
90.上面结合实施例对本实用新型做了进一步的叙述，但本实用新型并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本实用新型宗旨的前提下做出各种变化。